酶质量浓度的测定

1.酶活性测定方法（1）按反应时间分类法：20世纪50年代以前大都使用固定时间法。

这种方法是以酶催化反应的平均速度来计算酶的活性，现多已不用。

50年代中期开始采用连续监测法。

这种方法用自动生化分析仪上完成，可以测酶反应的初速度，其结果远比固定时间法准确，在高浓度标本尤为明显，但本法也受到反应时间，反应温度，试剂等的影响，应加以注意。

1）定时法：通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法，称为两点法，其中t1往往取反应开始的时间。

在酶反应一定时间后，往往通过加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等，使反应完全停止，所以也叫中止反应法。

2）连续监测法：又称为动力学法或速率法、连续反应法。

在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。

3）平衡法：通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。

（2）按监测方法分类法：可分为①分光光度法；②旋光法；
③荧光法；④电化学方法；⑤化学反应法；⑥核素测定法；⑦量热法。

2.酶质量测定法随着免疫技术的发展，出现了利用酶的抗原性，通过抗原、抗体反应来直接测定酶的质量，直接用质量单位ng／ml、μg／L来表示酶含量的高低。

免疫学方法与测定活性方法相比，其优点是灵敏度和特异性高，不受体液中其他物质的影响，特别是抑制剂和激活剂的影响，当血液中有酶抑制剂存在，或因基因缺陷，合成了无活性的酶蛋白时，可以测出灭活的酶蛋白量，有利于疾病诊断和科学研究。

如肌酸激酶同酶MB（CKMB）质量测定较活性测定对疾病的诊断价值高。

酶检测方法引言酶是一类生物催化剂，能够加速化学反应速率而不被消耗。

酶检测方法是通过测定酶活性或酶与底物的反应产物来评估酶的功能和浓度。

酶检测方法在生物医学研究、生物工程、食品检测等领域具有广泛的应用。

酶检测方法的分类酶检测方法可以根据测定酶活性的原理和方法进行分类，常见的分类包括：1.光度法：利用酶催化反应产生的吸光度变化来测定酶活性。

常见的方法有比色法、荧光法和发光法等。

其中，比色法是一种常用的酶检测方法，通过测定反应产物的吸光度来间接测定酶活性。

2.电化学法：利用酶催化反应产生的电流变化来测定酶活性。

常见的方法有电化学阻抗法、循环伏安法和恒电位法等。

电化学法具有高灵敏度、高选择性和实时监测等优点，广泛应用于生物传感器和生物芯片等领域。

3.质谱法：利用质谱仪测定酶催化反应产生的质荷比变化来测定酶活性。

质谱法具有高分辨率、高灵敏度和高特异性等优点，适用于复杂样品的酶活性测定。

4.核磁共振法：利用核磁共振仪测定酶催化反应产生的核磁共振信号变化来测定酶活性。

核磁共振法具有非破坏性、无辐射和无需标记等优点，适用于生物体内酶活性的测定。

5.荧光法：利用酶催化反应产生的荧光信号变化来测定酶活性。

荧光法具有高灵敏度、高选择性和实时监测等优点，广泛应用于生物分子的定量和定位分析。

酶检测方法的步骤酶检测方法的一般步骤包括：1.样品制备：将待测样品进行处理，如离心、过滤、稀释等，以获得适合测定的样品。

2.酶反应体系的建立：根据待测酶的特性和反应条件，选择适当的底物、辅酶、缓冲液和温度等，建立酶反应体系。

3.酶反应的进行：将样品与酶反应体系混合，在恒定的温度和pH条件下进行酶反应。

4.反应终止：通过改变反应条件或添加反应终止剂等方式，停止酶反应。

5.产物的测定：根据酶反应产生的产物特性，选择相应的测定方法进行测定。

常见的方法有分光光度法、荧光法、电化学法等。

6.数据分析：根据测定结果，计算酶活性或酶浓度，并进行数据分析和统计处理。

第二章DNA的纯化、浓度的测定及质量鉴定实验一 DNA(或RNA)的核酸酶处理纯化一、原理和用途在基因工程中，DNA与RNA的提取与纯化是最基本的实验方法。

在DNA提取时，有时会有RNA的污染，在RNA提取时，有时会有DNA的污染，为了消除它们对后续实验的影响，通常我们要对所提取的DNA或RNA用相应的核酸酶进行纯化。

核糖核酸酶A（又叫RNA酶A，RNase A）来源于牛胰脏，是一种内切核糖核酸酶，可特异性攻击RNA上嘧啶残基的3′端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键，从而除去RNA，其反应终产物为嘧啶3′磷酸及末端带嘧啶3′磷酸的寡核苷酸。

脱氧核糖核酸酶I（又叫DNA酶I，DNase I）来源于牛胰脏，是一种内切脱氧核糖核酸酶，它能水解双链或单链DNA，产生带5′端磷酸基团的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。

当Mg2+存在时，DNA酶I可独立地作用于每条DNA链，且切割位点随机分布。

而当Mn2+存在时，DNA酶I可在两条链大致同一位置上切割DNA链，产生平齐末端或具有1～2个核苷酸突起的DNA片段。

二、实验材料粗提的DNA（或RNA）溶液。

三、溶液与缓冲液1．核糖核酸酶A2．10×RNase A悬浮液3．DNase I4．10×DNase I液（含MgCl2）或10×DNase I缓冲液（含MnCl2）5．灭菌纯水6．无水乙醇7．70％乙醇8．TE缓冲液四、仪器设备及耗材制冰机，冰箱，冷冻低温超速离心机，干燥培养恒温器，恒温水浴箱，旋涡振荡器，真空干燥器，离心管架，吸头盒, 2 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL移液器，10 μL、200 μL、1000 μL吸头，1.5 mL离心管等。

五、实验方法1. 有些商业用固体RNase A干粉（或DNase I）可能含有微量的DNase（或RNase）活性，故在使用前应去除其活性，去除的方法可按照商家的使用说明书进行。

医学检验主管检验师资格考试复习资料生物化学（12）血清酶催化活性浓度和代谢物浓度酶法检测技术一、酶活性的定义及单位酶活性指酶催化反应的能力即酶促反应速度。

表示常用国际单位。

1min能转化1微摩尔底物（μmol）的酶量为一个国际单位（μmol／min）。

用SI制表示的酶活性单位为Katal（催量）。

每秒钟转化1个摩尔底物的酶量为1Katal（mol/sec）常用单位为μKatal或nKatal。

国际单位和Katal间关系为：1U＝1μmol／min＝16.67nmol／s＝16.67nKatal1.连续监测法中酶活性浓度的计算：连续检测法指的是在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。

连续监测法优点之一是计算方便，不需作标准曲线或标准管，用分光光度计监测酶反应过程时，很容易求出反应体系中每分钟吸光度变化，根据摩尔吸光系数可求出△A。

ε为微摩尔（线性）吸光体系△A为吸光度变化ν为标本体积（ml）V为反应体系体积（ml）L为光径（cm）后面几项皆为常数，叫做酶活力浓度测定转化因子：2.常数K值设置应是测定酶的判断值或参考值上限，应保证这些值测定的可靠。

3.临床酶催化活性浓度测定的校准由于临床酶催化活性浓度测定受测定方法和条件的影响，国际医学检验量值溯源委员会推荐了常用酶测定的参考方法，采用与仪器和试剂相配套的有溯源校准的校正测定系统，是发展趋势。

二、测定酶活性浓度的两大类方法（一）固定时间法（取样法）先让酶与底物在一定温度下作用一段固定的时间，然后停止酶反应，加人试剂进入化学反应呈色测出底物和产物的变化。

用这类方法测酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确，否则将引起较大误差。

该法最基本的一点是停止反应后才测定底物或产物的变化。

（二）连续监测法连续监测法具有众多的优点，随着科学技术的发展，自动生化仪的使用，正在逐步取代“固定时间法”。

各种酶的测定方法:土壤脲酶测定方法（靛酚比色法）根据脉酶水解时生成的氨与苯酚钠及次氯酸钠反应，形成兰色靛酚这一原理。

试剂配制：1.甲苯（分析纯）2.10%尿素：尿素（分析纯）10克溶于100毫升蒸馏水中。

（当天做当天配）3.柠檬酸盐缓冲液：368克柠檬酸（分析纯）溶于600毫升蒸馏水中；295克氢氧化钾溶于水；将二种溶液合并，调pH至6.7，并用水稀释至2升。

4.苯酚钠溶液：A.62.5克苯酚溶于少量95%乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升。

B.27克氢氧化钠溶于100毫升水中。

将二溶液保存在冰箱里。

使用前，将溶液A、B各吸取20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。

5.次氯酸钠溶液：用蒸馏水稀释试剂，至活性氯浓度为0.9%。

（次氯酸钠活性氯浓度为5.2%）。

标准溶液：称0.4717克硫酸铵（105 °C烘干）溶于水，稀释至1升（1毫升含100微克氮）即100ppm。

将100ppm的标准溶液稀释为10ppm。

分别吸取0、0.5ml、1.5ml、2.5ml、3.5ml、4.5ml、5.5ml、6.5ml、7.5ml于50毫升容量瓶或刻度试管中，加入试剂，最后定容至50 毫升使溶液浓度为：0、0.1ppm、0.3ppm、0.5ppm、0.7ppm、0.9ppm、1.1ppm、1.3ppm、1.5ppm。

分析步骤：称2~5克过20目风十土于50毫升磨口三角瓶中，加5~10滴甲苯，盖好，15分钟后加10毫升10%尿素和20毫升pH6.7柠檬酸盐缓冲液，摇匀后，在30C 恒温箱中培养24小时，过滤。

取滤液1~3毫升（视样品浓度定）于50毫升刻度试管中，加入4毫升苯酚钠溶液和3毫升次氯酸钠溶液，边加边摇匀。

20分钟后定容，在分光光度计波长578nm处比色（1cm比色杯）。

反应生成的靛酚兰能在60分钟以内稳定。

每一土样设置用水代替基质（即尿素）的对照，以除掉土壤中氨态氮引起的误差。

酶活性浓度测定的主要影响因素及控制影响酶促反应的因素主要有酶浓度、底物浓度、温度、pH及离子强度、电解质、辅酶、激活剂及抑制剂等。

（一）酶浓度在底物浓度远大于酶浓度时，酶促反应速率随酶浓度的增加而增加，即反应速率与酶的浓度成正比。

酶浓度特别高的标本，底物将过快且过多地消耗，影响酶活性测定，故需进行适当稀释，但要注意稀释产生的基质效应影响。

（二）反应系统温度的影响温度对酶促反应影响有两重性。

一方面，按照一般催化反应规律，温度升高可促进分子热运动，增加碰撞机会，提高酶促反应速率；另一方面，温度过高可因酶蛋白变性反而使酶反应速率下降。

多数酶在60℃时开始变性，80℃时已不可逆变性。

酶反应速率最大时的反应系统温度称为酶反应的最适温度（optimumtemperature）。

低于最适温度时，温度每升高10℃反应速率可增加1.7～2.5倍。

当高于最适温度时，反应速率则可能因酶变性失活反降低。

测定酶活性的温度长期未统一，学术团体推荐主要有3种：①德国临床生化学会（GSCC）推荐25℃；②国际临床化学联合会（IFCC）推荐30℃；③斯堪地那维亚临床生化学会（SSCC）推荐37℃。

我国推荐温度为37℃，现IFCC也改为推荐37℃。

测定酶活性时，温度的误差不能大于±0.1℃，以保证测定结果的准确性。

不同温度测定酶活性结果之间，不推荐使用酶的温度校正系数转换。

因此，不同反应温度测定酶活性应有相应参考区间，不能混用。

（三）底物的种类和浓度底物专一性不强的酶，可作用于多种底物，测定酶活性时，应优先考虑有较高诊断价值的底物。

底物专一性强的酶，如其所催化的为可逆反应，则需要从测定技术和实用方面考虑选择测定正向或负向反应。

在米氏方程中，当底物浓度［S］≫Km时，Km可忽略不计，则v=Vmax=K2［E］，即反应速率与底物浓度无关，仅和酶浓度［E］成正比，此为零级反应（图28-1中的c段）。

因此，临床测定酶活性时，一般均给予充分的底物浓度，最好为Km的10～20倍，保证反应速率与酶浓度［E］成正比，以准确测定酶活性。