含珠草水提取物与抗菌药联用对含fosA3耐药基因大肠杆菌的抑菌效果研究
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紫苏中迷迭香酸的研究现状摘要:紫苏是广泛分布于各地的唇形科植物,其中含有的活性成分迷迭香酸表现出了众多的药理活性。
本文主要从紫苏中迷迭香酸的提取、纯化工艺和抗菌活性等方面展开介绍,以期为紫苏及迷迭香酸的开发利用做一定的参考。
关键词:紫苏迷迭香酸提取抗菌1.引言紫苏为原产中国的一年生草本植物,叶片多皱缩卷曲,具有特异的芳香气味。
它生长适应性很强,广泛分布于全球各地,在俄罗斯、日本、加拿大等国进行了大量的商业性栽种。
紫苏中含有丰富的营养物质,次级代谢产物多样,具有广泛的应用。
查阅相关记载得知紫苏除了药用、油用以外,也作香料、食物等用。
例如在湛江吴川地区,紫苏叶是广泛使用的调味品,而在韩国、越南等地区人们常常直接食用。
2.紫苏中迷迭香酸简介紫苏含有多种有效物质,使用价值颇高,其中的迷迭香酸更是不容小觑。
迷迭香酸是天然的酚酸类物质,由一分子咖啡酸和一分子3,4-二羟基苯基乳酸缩合而成,在双子叶植物中广泛存在,如紫草科、唇形科植物。
迷迭香酸在体内外试验中表现多种药理作用,如抗氧化、抗炎、抗菌、抑制菌体生物膜生长、抗肿瘤[1]等,因此也被广泛应用于药品、食品、化妆品等领域。
接下来笔者主要从迷迭香酸的生产工艺和抑菌两方面展开介绍。
3.迷迭香酸的提取生产工艺迷迭香酸的生产主要有三个方面:植物合成、化学合成以及生物合成。
对于提取方面,迷迭香酸主要从唇形科植物迷迭香中获得,但随着紫苏的开发利用程度加大,也常从紫苏的叶、茎及种子中提取纯化。
目前除溶剂提取、热水浸提等传统方法以外,超声波辅助提取、超临界流体萃取等新技术进一步提高了迷迭香酸的溶出率。
如朱惠丽[2]利用热水浸提法在紫苏叶中得到0. 82%迷迭香酸;刘根才[3]利用紫苏叶在料液比(g/mL)1∶9,39%乙醇超声提取63 min的条件下,提取到0.61%迷迭香酸。
从紫苏中提取到的迷迭香酸粗提液还需经过纯化精制,常用的提纯方法有结晶法、有机溶剂萃取法和大孔树脂吸附法[4]。
.论著.大肠埃希菌产超广谱内酰胺酶的耐药性分析郭琼杰,杨柳,杨晨,王娜,王珊珊[摘要]目的分析大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)产超广谱B-内酰胺酶(extended spectrum B-lactamases, ESBLs)的耐药性。
方法选取2017年6月〜2019年6月秦皇岛市第一医院收治的非重复大肠埃希菌感染80例患者作为研究对象,分别对其感染标本中的细菌进行检验、分离培养,运用常规鉴定技术鉴定细菌并进行药敏试验,使用纸片扩散法(K-B paper diffusion method,K-B法)检测E.coli,使用K-B法和国家临床实验室标准委员会(national committee for clinical laboratory standards,NCCLS)建议的双纸片协同试验进行ESBLs检测,统计E.coli ESBLs阳性株数并分析其耐药性。
结果非重复大肠埃希菌感染病例80例患者中E.coli ESBLs阳性株23株,占比28.75%,阴性株57例,占比71.25%。
E.coli ESBLs阳性株主要来源于尿液标本,之后依次为穿刺液、痰液、血液及引流液。
对E.coli ESBLs阳性株进行耐药性分析,结果显示亚胺培南的体外活性最好,耐药率最低为0.00%,其次为阿米卡星4.35%、头孢替坦4.35%、厄他培南4.35%、左氧氟沙星4.35%、头孢他啶4.35%、哌拉西林/他唑巴坦4.35%、妥布霉素4.35%;该试验中细菌对复方新诺明的耐药性最高为95.65%,其次为阿莫西林/克拉维酸91.30%、氨节西林91.30%、氨曲南86.96%、头孢曲松86.96%。
结论E.coli ESBLs对复方新诺明、阿莫西林/克拉维酸、氨节西林、氨曲南、头孢曲松有着较强的耐药性,对亚胺培南、阿米卡星、头孢替坦、厄他培南、左氧氟沙星、头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素等药物较为敏感,临床治疗时应严格根据细菌分布特点结合其耐药情况进行合理给药。
黄柏与抗菌药联合抗耐药大肠杆菌的作用研究司红彬;吴永继;黄丽云;秦燕;姚晓韵;林朗;黄凯;唐承明【摘要】为研究黄柏水提取物与抗菌药联合体外抗含fosA3和β-内酰胺酶(ESBLs)型耐药基因大肠杆菌的效果,对临床分离的细菌进行鉴定,确定细菌所含耐药基因种类,采用二倍微量稀释法分别检测黄柏水提取物与抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC),并以1/2 MIC的黄柏水提取物与抗菌药联合抑制耐药大肠杆菌.结果显示,分离到含fosA3和CTX-M耐药基因大肠杆菌;黄柏水提取物的MIC大于0.5 g/mL,以1/2 MIC的黄柏水提取物与14种抗菌药联合使用3代后,抗菌药抗菌活性显著增强,黄柏水提取物可显著降低抗菌药MIC,头孢曲松钠、阿莫西林、环丙沙星、左旋氧氟沙星、黏杆菌素、痢菌净、磺胺间甲氧嘧啶、加替沙星、头孢他啶、头孢噻呋钠、氟苯尼考、磷霉素的MIC均降到1.562 5μg/mL以下.黄柏水提取物联合抗菌药应用可能具有协同抑菌作用,可用于耐药细菌感染疾病的临床治疗.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2015(044)002【总页数】4页(P123-126)【关键词】黄柏;大肠杆菌;最小抑菌浓度;fosA3基因;β-内酰胺酶;联合抑制【作者】司红彬;吴永继;黄丽云;秦燕;姚晓韵;林朗;黄凯;唐承明【作者单位】广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005;广西大学动物科学技术学院,广西南宁530005;广西壮族自治区兽药监察所,广西南宁530001【正文语种】中文【中图分类】S859.3随着抗生素的滥用,细菌耐药性也日益严重,英、印科学家于2010年在印度地区发现了一种“超级细菌”——含有一种名为新德里金属β-内酰胺分解酶(NDM-1)的大肠杆菌,该菌几乎对目前所有的抗菌药均表现耐药[1]。
第38卷第8期学报No 8Vol 382023年8月JournalofLeshanNormalUniversityAug ꎬ2023DOI:10.16069/j.cnki.51-1610/g4.2023.08.003杜仲叶水提物和醇提物抑菌及其抗氧化活性研究龚卫华1ꎬ王延云2ꎬ贺建武1җꎬ胡美忠3ꎬ蓝道英1[1.杜仲综合利用技术国家地方联合工程实验室(吉首大学)ꎬ湖南吉首416000ꎻ2.乐山师范学院生命科学学院ꎬ四川乐山614000ꎻ3.铜仁职业技术学院ꎬ贵州铜仁554300]摘㊀要:为比较杜仲叶水提物和醇提物抗菌及抗氧化活性ꎬ分别采用去离子水和乙醇(50%和75%)溶液提取杜仲叶ꎬ得到三种提取物ꎬ采用Alamarblue实验法测定提取物的抑菌效果ꎬ通过DPPH自由基㊁超氧阴离子及总还原力来评价其抗氧化活性ꎮ结果表明:三种杜仲叶提取物对细菌均有一定抑制活性ꎬ特别是对金黄色葡萄球菌的抑制活性最强ꎬ其中杜仲叶水提物㊁50%醇提物和75%醇提物对金黄色葡萄球菌MIC50分别为7.21㊁3.32和4.12mg/mLꎻ但杜仲叶水提物对真菌黄曲霉无明显抑菌效果ꎬ杜仲醇提物抑菌效果强于杜仲水提物ꎮ三种杜仲提取物均具有较强的抗氧化活性ꎬ其中醇提物的清除DPPH㊁超氧阴离子能力及总还原力均高于水提物ꎮ总之ꎬ杜仲叶提取物均具有一定抗菌和抗氧化活性ꎬ具有作为食品防腐剂和抗氧化剂的潜力ꎮ关键词:杜仲叶ꎻ提取物ꎻ抑菌活性ꎻ抗氧化作用中图分类号:S965.325㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1009-8666(2023)08-0010-05收稿日期:2022-04-12基金项目:国家自然科学基金项目 湘西地区野生食用植物资源利用的空间分异及形成机制 (42001200)ꎻ湖南省科技成果转化及产业化计划 高新技术产业科技创新引领计划项目 杜仲深度研发及高值化利用关键技术集成与示范 (2020SK2028)ꎻ湖南省教育厅项目 白耙齿菌降解杜仲果壳木质纤维素的机制研究 (19B455)ꎻ铜仁职院国家民委中兽药重点开放实验项目 杜仲提取物抑菌作用及在蛋鸡日粮中的应用研究 ( 2020 005)作者简介:龚卫华(1980 )ꎬ女ꎬ土家族ꎬ湖南永顺人ꎬ吉首大学副教授ꎬ博士ꎬ研究方向:植物资源高值化利用ꎮҗ通信作者:贺建武(1985 )ꎬ男ꎬ土家族ꎬ湖南溆浦人ꎬ副教授ꎬ博士ꎬ研究方向:可持续生态学和生物资源可持续利用ꎮE-mail:hejsu@jsu.edu.cnꎮ0㊀引言在食品工业中ꎬ为提高食品的品质ꎬ延长其货架期ꎬ需要添加一定量的食品添加剂ꎬ但化学添加剂存在一定的安全隐患ꎬ人们迫切需要使用天然㊁安全和高效的食品添加剂来满足这一需求ꎮ因此ꎬ从植物中提取活性成分是一种适当的方法ꎮ有研究表明ꎬ植物提取物具有杀菌㊁抗氧化㊁降三高和抗肿瘤等作用[1-4]ꎬ目前已广泛应用于化妆品㊁食品加工㊁饲料添加剂中[5-7]ꎮ杜仲(EucoommiaulmoidesOliv.)ꎬ又名思仲㊁思仙㊁胶树等ꎬ单科单属ꎬ多年生落叶乔木ꎬ阔叶材ꎬ是我国特有的经济树种ꎮ传统以皮入药ꎬ但现代研究表明ꎬ杜仲叶与杜仲皮具有类似的化学成分及活性ꎬ富含环烯醚萜类㊁苯丙素类㊁总黄酮类㊁杜仲多糖㊁抗真菌蛋白㊁氨基酸等[8-10]ꎬ具有抗氧化㊁降糖㊁抗衰老和抑菌等作用[1ꎬ10-11]ꎮ研究表明ꎬ杜仲叶具有抗氧化活性ꎬ不同提取方式的杜仲叶中ꎬ活性成分和抗氧化作用存在一定差异[13]ꎮ杜仲叶醇提物主要聚焦在对其药用价值的研究[11-12]ꎬ对其抗菌抗氧化的深入研究还较少ꎮ因此ꎬ本研究以慈利县杜仲叶为原料ꎬ系统研究了不同杜仲叶水提物和醇提物的抑菌和抗氧化活性的效果ꎬ旨在为杜仲叶在食品添加剂方面的应用提供基础数据ꎮ2021年ꎬ国家把湖南省和河南省作为试点省份ꎬ将杜仲叶列为药食同源材料ꎮ这为杜仲叶在食品工业的发展开辟了新的通道ꎬ也为进一步综合开发利用杜仲叶提供了可能ꎮ1㊀材料与方法1.1㊀材料与试剂实验以湖南省慈利县江垭林场采摘的杜仲叶为原料ꎻ大肠杆菌(Escherichiacoli)㊁金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)㊁沙门氏菌(Salmonella)和黄曲霉均由乐山师范学院微生物实验室提供ꎻ1ꎬ1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)㊁铁氰化钾㊁邻二氮菲㊁三氯化铁和阿尔玛蓝(AlamarBlue)等为分析纯ꎮ1.2㊀仪器与设备KQ5200超声波清洗器(昆山是超声仪器有限公司)ꎻXY-350型高速多功能粉碎机(浙江省永康市松青五金厂)ꎻ培养箱(上海智诚分析仪器制造有限公司)ꎬLD-96A多功能酶标仪(山东莱恩德智能科技有限公司)ꎻBKQ-B50II高压蒸汽灭菌器(山东博科生物产业有限公司)ꎮ1.3㊀试验方法1.3.1㊀提取物的制备将新鲜的杜仲叶片用蒸馏水冲洗干净ꎬ烘干后粉碎待用ꎬ剪碎ꎬ装入1L的三角瓶中ꎬ分别加入水㊁75%乙醇和50%乙醇ꎬ室温下超声波提取3次ꎬ每次2hꎬ减压抽滤ꎬ将3次滤液合并后减压浓缩ꎬ冷冻干燥ꎬ即得3种不同杜仲叶提取物ꎬ置于4ħ条件下保存备用ꎮ1.3.2㊀抗菌活性评价杜仲叶提取物对致病菌金黄色葡萄球菌㊁沙氏杆菌㊁大肠杆菌和黄曲霉菌抗菌活性进行测试ꎬ参考Tang等[14]的Alamarblue实验法ꎬ以MIC50值表达抗菌活性ꎮ金黄色葡萄球菌㊁沙氏杆菌㊁大肠杆菌和黄曲霉菌接种在6ml的MHB培养基中孵化24h(37ħ)ꎮ将菌悬液在600nm的吸光度的光学密度(OD)调整到0.13~0.15(采用MHB调整)ꎬ表示其菌悬液浓度大约为1.5ˑ108CFU/mlꎮMIC50的测定采用96孔微滴板ꎬ每孔加入100lMHBꎬ然后将初始体积为200l的实验化合物加入到相应的孔中ꎬ然后依次稀释ꎬ从最高到最低达到理想的浓度ꎮ加入待测化合物后ꎬ每孔加入l.5l浓度为1.5ˑ108CFU/ml的菌悬液ꎬ使终浓度为达到5ˑ106CFU/mlꎮ混合液在37ħ孵育20h后ꎬ10lAlamarblue(AB)试剂被添加到微孔中并轻轻摇动ꎬ再孵化1h(37ħ)ꎬ摇匀后ꎬ在酶标仪中测定每孔在570和600nm的吸光度ꎮ对照组为MHB单独(空白)㊁稀释MHB+实验化合物和AB(阴性)㊁MHB+细菌细胞和AB(阳性)ꎮMIC50是根据制造商的配方(每个实验孔570~600nm的吸光度差除以阳性对照的差值)计算AB的减少百分比来确定的ꎮ试验进行了3个重复ꎮAB测定的MIC50被定义为使AB降低50%的实验化合物的最低浓度ꎬ并在添加AB后60min形成略带紫色的孔ꎮ1.3.3㊀DPPH自由基清除的测定参考张强等[15]方法ꎬ略有改动ꎮ取0.04mg/ml的DPPH-乙醇溶液1.5mlꎬ加入适量提取液用95%乙醇补足3mlꎮ静置30minꎬ在517nm处测定吸光度ꎮ清除率=1-(A1-A2)[]/A0ˑ100ꎮ其中:A1为加提取液后DPPH溶液的吸光度ꎬA2为提取液的吸光度ꎬA0为未加提取液时DPPH溶液的吸光度ꎮ1.3.4㊀清除超氧阴离子自由基(O2.-)的测定取适量样品溶液加入石英比色皿中ꎬ再加入Tris-HCl缓冲液至2950Lꎬ再加50L连苯三酚溶液ꎬ迅速混合(颠覆式)ꎬ开始计时ꎬ每隔30秒读数一次(A值ꎬ325nm)ꎬ至300秒时为止ꎮΔA=A325nmꎬ300s-A325nmꎬ30sꎮ清除率=ΔA0-ΔA样/ΔA0ˑ100ꎮ式中:ΔA0为不加样品的对照值ꎬΔA样为加样品后的测定值ꎮ1.3.5总还原能力测定(铁氰化钾还原法)参考张强等[15]方法ꎬ略有改动ꎮ2.5mL杜仲样品溶液加入2.5mL磷酸盐缓冲液和1mL铁氰化钾溶液ꎬ50ħ水浴中放置20minꎬ急速冷却ꎬ加2.5mLFeCl3溶液ꎬ混匀后在3500r/min离心10minꎮ取上清液2.5mLꎬ加入2.5mL双馏水和0.5mLFeCl2溶液ꎬ混合均匀ꎬ静置10min后在波长700nm下测吸光度A值ꎮA越大ꎬ则样品的还原力越强ꎮ2㊀结果与分析2.1㊀杜仲叶提取物抑菌活性由表1可以得出杜仲醇提物对细菌有很强的抑制作用ꎬ特别是对金黄色葡萄球菌的抑制效果最强ꎬ与胡居吾等[6]研究的结果一致ꎮ胡居吾等[6]研究发现杜仲绿原酸提取物抑菌效果强于平卧菊三七和金银花绿原酸提取物ꎬ这不仅与绿原酸有关ꎬ还可能与提取物中黄酮类物质的含量有关ꎮ杜仲醇提物不仅对细菌有抑制效果ꎬ对黄曲霉真菌也有一定的抑菌效果ꎬ而杜仲50%乙醇提取物的抑菌效果更强ꎮ杜仲水提物对细菌有抑制作用ꎬ但对黄曲霉几乎没用抑制作用ꎮ这与季志平等[1]研究结果一致ꎮ石惠姝等[16]研究表明ꎬ杜仲水提物可以通过促进益生菌的生长达到抑制致病菌的效果ꎬ调节肠道菌群平衡ꎮ整体而言ꎬ杜仲叶提取物中ꎬ乙醇提取物的抑菌效果要高于水提物ꎬ抑制细菌效果要强于真菌ꎬ特别是对金黄色葡萄球菌的抑制效果最强ꎮ这有利于杜仲叶提取物作为天然食品杀菌剂进一步开发利用ꎮ表1㊀杜仲提取物抑菌效果提取物MIC50(mg/ml)金黄色葡萄球菌沙门氏菌大肠杆菌黄曲霉杜仲水提物7.218.237.79杜仲50%醇提物3.323.633.529.87杜仲75%醇提物4.124.814.2610.982.2㊀杜仲叶提取物对DPPH 的清除活性采用清除自由基DPPH.来评价杜仲叶提取物的抗氧化活性ꎬ结果见图1所示ꎬ随着提取物浓度的升高ꎬ清除自由基的能力增强ꎮ当提取物浓度达到0.5mg/mL时ꎬ提取物的DPPH.自由基清除率都达到了80%以上ꎬ说明杜仲叶提取物的抗氧化活性很高ꎬ与王凯等[17]和向灿辉等[18]研究结果一致ꎮ为了更好地比较各提取物之间抗氧化活性ꎬ计算其IC50(半抑制量浓度)ꎬ结果见图1ꎮIC50越小ꎬ表示其抗氧化活性越强ꎬ杜仲叶50%和75%醇提物的IC50值分别为0.161㊁0.162mg/mLꎬ表示两者之间抗氧化活性相似ꎬ而水提物的IC50值为0.262mg/mLꎬ要高于醇提物的IC50值ꎬ说明醇提物的抗氧化效果好于水提物ꎬ可能与其多酚的含量有关[19-20]ꎮ图1㊀杜仲叶提取物的DPPH清除活性2.3㊀杜仲叶提取物对超氧阴离子自由基(O2.-)清除活性超氧阴离子(O2.-)是活性氧的一种ꎬ是机体内寿命最长的自由基ꎬ如果体内O2.-堆积过量ꎬ会对机体造成危害ꎬ因此ꎬ本研究测定杜仲叶提取物对超氧阴离子的清除率具有重要意义[21]ꎮ由图2所示ꎬ杜仲叶提取物都具有较高的超氧阴离子清除活性ꎬ随着提取物浓度升高ꎬ其抗氧化活性逐渐增强ꎬ当提取物浓度达到0.7mg/mL时ꎬ其O2.-清除率都达到80%以上ꎬ乙醇提取物的清除效果更好ꎮ王凯等[17]研究表明ꎬ不同品种㊁储存时间㊁加工方式等制备的杜仲叶乙醇提取物均具有较强的清除O2.-的活性ꎮ不同杜仲叶提取物的IC50如图2所示ꎬ杜仲叶醇提物的IC50较杜仲叶水提物IC50要低ꎬ进一步说明杜仲叶醇提物清除超氧阴离子的效果更好ꎮ图2㊀杜仲叶提取物的超氧阴离子清除活性2.4㊀杜仲叶提取物总还原力测定总还原力测定是由抗氧化剂将Fe3+络合物还原为Fe2+络合物的能力来表示ꎮ本试验测定了3种杜仲叶提取物的总还原力ꎮ吸光度与还原力成正比ꎬ即吸光度越高还原能力越强ꎬ其结果见图3ꎮ随着杜仲叶提取物浓度升高ꎬ其还原能力逐渐增强ꎮ杜仲叶75%醇提物的总还原力最强ꎬ其次为50%醇提物ꎬ还原能力最弱的为杜仲叶水提物ꎮ与张强等[15]研究相比ꎬ本试验的杜仲提取物的总还原能力要强于其测定的不同地区的杜仲水提物ꎬ这可能是因为产地不同ꎬ杜仲叶中具有还原力的化合物的含量不一样导致的ꎮ图3㊀杜仲叶提取物的总还原力3㊀结论试验采用了水和乙醇(75%㊁50%)作为溶剂提取杜仲叶中有效成分ꎬ考察了不同杜仲叶提取物的抗菌和抗氧化活性ꎮ结果显示:在抗菌方面ꎬ杜仲提取物对金黄色葡萄球菌㊁沙门氏菌和大肠杆菌均有一定的抑制作用ꎬ其中对金黄色葡萄球菌的抑制效果最强ꎮ在抑制黄曲霉菌方面ꎬ杜仲醇提物有一定的抑制效果ꎬ而杜仲水提物几乎没有ꎮ其中杜仲50%醇提取物抑菌效果最强ꎬ其次是杜仲75%醇提物ꎬ最弱的为杜仲水提物ꎮ在抗氧化方面ꎬ实验从DPPH㊁超氧阴离子及总还原力3个指标入手ꎬ来对比不同杜仲提取物抗氧化性的差异ꎮ总体来说ꎬ不同杜仲提取物均有一定的抗氧化活性ꎬ但杜仲醇提物的抗氧化活性强于杜仲水提物ꎬ这可能与提取物中多酚等活性成分的含量有关ꎮ通过对杜仲叶提取物抗菌和抗氧化的综合分析ꎬ为杜仲叶提取物进一步在食品添加剂方面的应用提供理论支持ꎮ参考文献:[1]㊀季志平ꎬ苏印泉.杜仲叶提取物的抑菌活性研究[J].林产化学与工业ꎬ2008ꎬ28(2):63-66.[2]㊀GHAREEBMAꎬHABIBMRꎬMOSSALEMHSꎬetal.Phyto-chemicalanalysisofEucalyptuscamaldulensisleavesex 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