下载文档原格式
实验一大肠杆菌基因组提取简介大肠杆菌(Escherichia coli)是一种常见的肠道菌，其基因组结构简单，可以用于实验室中的基因工程。
本实验将介绍如何从大肠杆菌中提取基因组DNA，并进行后续的测序和分析。
材料- 大肠杆菌菌株- SDS（1%）- NaCl(5M)- EDTA(0.5M)- 三氯乙酸(CTAB)细胞裂解缓冲液（含Tris-HCl,pH8.0、NaCl、CTAB和EDTA）- 氯仿- 异丙醇- TE缓冲液（pH8.0）- 75%酒精- 100%酒精步骤1. 建立大肠杆菌沙门氏菌联合培养通过将大肠杆菌菌株与沙门氏菌菌株联合培养，可以使大肠杆菌更具韧性，可以在更苛刻的条件下生存。
因此，在进行基因组提取前，可以将大肠杆菌与沙门氏菌一同培养。
具体步骤如下：1.1 从大肠杆菌与沙门氏菌培养基中选择处于对数生长期的菌株；1.2 筛选出同步菌种进行接吻结合；1.3 将大肠杆菌沙门氏菌接种于 LB 培养基中，进行生长，收集状态良好的菌落。
2. 细胞裂解收集培养的大肠菌细胞，经过洗涤后，加入细胞裂解缓冲液中。
在催化剂SDS的作用下，细胞质膜溶解，使DNA释放到缓冲液中。
2.1 用洗液洗细菌达到OD600为0.6时离心6000g， 10分钟；2.2 将上清液倒掉，沉淀用NaCl水洗涤后，离心6000g， 10分钟；2.3 将沉淀重悬于 Tris-HCl 缓冲液中，加入 SDS 、 NaCl和 EDTA，并在65℃下进行快速震荡混匀，直到完全均匀混合。
3. 蛋白酶和RNA酶的处理使用丙酮和氯仿的混合物沉淀DNA，过滤掉蛋白酶和RNA酶。
3.1 向上清液中加入等体积异丙醇，避免产生气泡，盖紧座析管盖，冰上静置10min 。
3.2 离心12000g 10min，弃取上清层。
将沉淀重悬于 TE 缓冲液中，加入20ug/ml RNase 处理，65℃将体系涡旋5min；3.3 加入等体积氯仿，振荡10min，然后离心12000g 10min ，弃取上清液。
中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine第42卷第12期2020年12月V ol.42No.12Dec.2020doi ：10.3969/j.issn.1008-0589.202010002牛源乳腺致病性大肠杆菌JL05全基因测序及毒力和耐药基因分析曲星霖1，肖丹2，吴健2，马晓媛3，白翠3，王妍1*，王楠3*（1.延边大学农学院，吉林延吉133000；2.吉林省农业科学院，吉林长春130033；3.吉林省动物疫病预防控制中心，吉林长春130062）摘要：为研究一株从奶牛乳样中分离到的乳腺致病性大肠杆菌（MPEC ）JL05的进化分群情况、耐药表型和耐药基因之间的相关性、毒力因子分布情况，本研究采用PCR 法、微量肉汤稀释法和高通量测序法对其进化分群、16种抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC ）、毒力基因、耐药基因的检测和分析。
PCR 检测结果表明，MPEC JL05属于B2群。
MIC 检测结果表明，MPEC JL05除对磺胺异恶唑中介、对呋喃妥因敏感外，对β-内酰胺、头孢菌素、氨基糖苷、抗叶酸、喹诺酮、大环内酯、四环素、苯丙醇类等8类14种抗菌药物均耐药。
全基因测序结果表明，MPEC JL05编码基因中存在MPEC 特有的fec 基因座；VFDB 数据库分析表明MPEC JL05具有黏附、侵袭、转运、铁摄取、分泌系统、细菌毒素6类80个毒力基因，并发现了耶尔森菌强毒力岛（HPI ）；CARD 数据库分析表明MPEC JL05菌株具有参与抗生素外排、抗生素失活、抗生素靶点改变、降低对抗生素的渗透性等4类耐药机制的53个耐药基因，且在质粒的耐药基因上下游发现了多个转座酶及整合酶基因。
本研究揭示了MPEC JL05复杂的进化史，为更全面的认识MPEC 基因组特征、致病力及耐药传播机制提供了参考。
关键词：大肠杆菌；进化分群；全基因组测序；耐药基因；毒力基因中图分类号：S852.61文献标识码：A文章编号：1008-0589（2020）12-1220-06Whole genome sequencing reveals the distribution of resistance and virulence genes of mammary pathogenicEscherichia coli JL05from bovineQU Xing-lin 1,XIAO Dan 2,WU Jian 2,MA Xiao-yuan 3,BAI Cui 3,WANG Yan 1*,WANG Nan 3*(1.Agricultural College of Yanbian University,Yanij 133000,China;2.Jilin Academy of Agricultural Sciences,Changchun 130033,China;3.Animal Disease Control Center of Jilin Provincal,Changchun 130062,China)Abstract :The aim of this study was to analyze the phylogenetic groups,virulence factor distribution,and the correlation between drug resistance phenotype and resistance genes of Escherichia coli JL05isolated from milk samples of dairy cows.The PCR,microdilution method and high-throughput sequencing were used to investigate the phylogenetic groups,MIC of 16antibacterial drugs,virulence genes and resistance genes.PCR results showed that E.coli JL05belonged to group B2.MIC results showed that E.coli JL05was sensitive to sulfamethoxazole and nitrofurantoin,but resistant to 14of Class 8antibacterial drugs,including β-lactam,cephalosporin,aminoglycoside,folic acid,quinolone,macrolide,tetracycline and phenylpropanol.The results收稿日期：2020-10-11基金项目：吉林省科技发展计划项目（20180623033TC ）作者简介：曲星霖（1997-），男，吉林长春人，硕士研究生，主要从事分子遗传研究.*通信作者：E-mail ：*****************；***************Corresponding author曲星霖，等.牛源乳腺致病性大肠杆菌JL05全基因测序及毒力和耐药基因分析第12期乳腺致病性大肠杆菌（Mammary pathogenic E.coli，MPEC）是奶牛乳房内感染（Intramammary infection，IMI）的主要病原体，因存在fec基因座可使细菌从柠檬酸盐中捕获铁而具有在牛乳腺中定植的能力[1]，其导致的急性乳腺炎不仅影响奶牛产奶量，同时也影响牛奶品质，增加了治疗费用，给奶牛业造成了严重的经济损失[2]。
比较基因组学鉴定大肠杆菌致病因子的教学分析比较基因组学是一门研究不同物种之间基因组差异的学科，通过比较基因组分析，可以深入了解不同物种在遗传层面的差异，从而揭示各种生物的遗传特性和进化规律。
在微生物领域，比较基因组学被广泛应用于致病菌的研究，通过对比病原微生物与非致病微生物的基因组差异，可以揭示其致病机制和病原性因子，有助于深入了解病原微生物的致病机理，为防控和治疗提供重要的科学依据。
本教学分析将以大肠杆菌为例，介绍如何利用比较基因组学鉴定大肠杆菌的致病因子。
一、大肠杆菌简介大肠杆菌（Escherichia coli），是一种革兰氏阴性细菌，属于肠杆菌科，是人和动物肠道中的常见菌群之一。
大肠杆菌广泛存在于自然界中，既是人体的共生菌，又是一种重要的病原微生物。
其中某些菌株具有致病性，能够引起人畜的肠道感染，甚至引发严重的肠道疾病，如腹泻、肠炎等。
对大肠杆菌的致病性进行深入研究，对于预防和控制相关疾病具有重要意义。
二、大肠杆菌的致病因子大肠杆菌的致病性主要由其特有的毒力因子和致病因子所决定，其中的毒力因子主要包括毒素、细菌毛和附着因子等。
毒素是大肠杆菌最主要的毒力因子，包括肠毒素、血清素、肠毒素和淀粉酶等，它们能够对宿主细胞产生毒性作用，引起细胞损伤和炎症反应。
细菌毛是大肠杆菌附着和入侵宿主细胞的重要结构，它能够使细菌更容易附着于宿主细胞表面，引发感染。
附着因子是大肠杆菌在宿主肠道黏膜上附着和定植的重要因子，通过附着因子，大肠杆菌能够有效地抵抗肠道黏膜的清洁作用，长时间存在于肠道内，引发感染和疾病。
三、基因组学鉴定大肠杆菌的致病因子利用比较基因组学分析，可以揭示大肠杆菌致病因子的基因组遗传特征，为深入研究其致病机制提供重要的科学依据。
比较基因组学鉴定大肠杆菌的致病因子主要包括以下几个步骤：1. 基因组序列比对：利用测序技术对不同菌株的基因组进行测序并获得其基因序列信息；然后，将所获得的基因组序列进行比对分析，从而找出菌株间的差异和共同点。
大肠杆菌中的基因组结构和功能研究大肠杆菌是一种广泛存在于环境中和人体肠道内的细菌。
它的基因组结构和功能一直是分子生物学和微生物学研究的热门领域。
随着基因测序技术的发展，我们对大肠杆菌的基因组结构和功能的认识也越来越深入。
基因组结构大肠杆菌的基因组属于革兰氏阴性菌，它是一个圆形的DNA分子，大约有4.6兆碱基对。
它的基因组包含了大约4500个基因，其中有许多基因是与宿主细胞的生长和代谢相关的。
大肠杆菌的基因组还具有多个质粒，这些质粒通常含有一些与环境适应和抗药性相关的基因。
大肠杆菌的基因组中还有许多重复序列和转移元件。
这些序列包括了IS元件、转座子、整合子等等。
它们都能够影响基因表达和基因组稳定性，并在细菌进化中具有重要的作用。
功能研究大肠杆菌中的基因组结构和功能研究主要包括以下几个方面。
基因功能注释随着大肠杆菌基因组测序的完成，相应的基因功能注释也日益完善。
目前已有大量的基因在数据库中被标注了功能和注释信息，这对于后续的基因调控、表达和功能研究提供了重要的数据支持。
转录调控在大肠杆菌中，转录调控是一种重要的基因调控机制。
研究者发现大肠杆菌基因组中存在大约350个调控因子。
这些调控因子通常能够识别特定的DNA序列，在特定条件下调控相应基因的表达。
研究发现，其中的一些调控因子还具有重要的作用，如lac重pressor、trp重pressor等。
新基因鉴定随着转录组和蛋白质组学技术的发展，大肠杆菌中的新基因鉴定越来越重要。
许多研究者利用这些技术，鉴定出了大量的新基因，其中包括了一些与代谢途径、抗药性和环境适应有关的基因。
基因组稳定性在细菌进化中，基因组稳定性是非常重要的。
大肠杆菌中的基因组稳定性与它的保护性随机DNA修复系统、R-质粒的结构和核苷酸代谢等多个方面有关。
研究人员对这些方面进行了深入探究，为我们对细菌基因组稳定性的了解提供了一定程度的帮助。
结论大肠杆菌是一个重要的微生物模型生物，它的基因组结构和功能一直是分子生物学和微生物学研究的热门领域。
细菌基因组测序方法
细菌基因组测序方法主要有以下几种：
1. 整体基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）：将
细菌的整个基因组进行测序，并通过比对参考基因组或组装建立一个完整的基因组序列。
2. 目标区域测序（Targeted Sequencing，TS）：针对特定基因、基因组区域或有意义的变异位点进行测序。
3. 细胞单体测序（Single-cell Sequencing，SCS）：将细胞单
体进行测序，通过技术手段将单个细胞的DNA扩增到足够浓
度后进行测序。
4. 转录组测序（RNA Sequencing，RNA-Seq）：将细菌转录产物测序，包括mRNA、ncRNA等，可以了解细菌的转录水平
和转录后调控。
5. 甲基化测序（Methylation Sequencing，Methyl-Seq）：对细
菌基因组进行甲基化修饰位点的检测以获得表观遗传信息。
6. 大肠杆菌的测序方法还包括平滑野百合花青素基因组测序（PacBio）和人工合成DNA 和4D核磁共振测序。
问答题：1、大肠杆菌的基因组大小是多少bp？原核生物复制叉的速度是多少？正常情况下大肠杆菌是多长时间繁殖一代？为什么在营养丰富的情况下20min繁殖一代？4.6X106 bp；1kb/s; 40min; 上一次复制没有完成下一代就开始了2、真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面存在以下几个方面的差异①在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，很少存在原核生物中常见的多基因操纵子形式②真核细胞DNA与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。
③高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子④真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。
⑤在真核生物中，基因转录的调节区相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5’上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。
在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑制RNA聚合酶与它的结合⑥真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。
⑦许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程，才能顺利地翻译成蛋白质。
简答题1、DNA复制的保真性至少要依赖三种机制1. 遵守严格的碱基配对规律；2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3. 复制出错时DNA-pol的即时校读功能2、表观遗传学的特点1.可遗传的，即这类改变通过有丝分裂或减数分裂，能在细胞或个体世代间遗传；2.可逆性的基因表达调节，也有较少的学者描述为基因活性或功能的改变；3.没有DNA序列的改变或不能用DNA序列变化来解释。
3、中心法则（图示）4、遗传印迹的特点：基因组印迹依靠单亲传递某种性状的遗传信息，被印迹的基因会随着其来自父源或母源而表现不同，即源自双亲的两个等位基因中一个不表达或表达很弱。
细菌基因序列研究报告细菌基因序列研究报告细菌基因序列研究报告是利用高通量测序技术对细菌基因组进行测序和分析的报告。
本报告以大肠杆菌（Escherichia coli）为研究对象，通过对其基因组序列的测定和分析，揭示了细菌基因组的结构、功能和演化等方面的信息。
一、研究目的本研究的目的是通过对大肠杆菌基因组的测序和分析，探索细菌基因组的特征和功能，为进一步的细菌基因研究提供参考和依据。
二、实验方法1. 样本处理：从培养的大肠杆菌中提取基因组DNA，并通过PCR扩增得到足够数量的DNA样本。
2. 基因组测序：采用Illumina高通量测序平台对样本进行测序，得到海量的短读序列。
3. 数据处理和拼接：使用适当的软件对测序数据进行预处理、质控和拼接，得到完整的基因组序列。
4. 基因组注释和分析：将得到的基因组序列与已知数据库进行比对和注释，如基因预测、基因功能注释、基因家族分类等。
5. 演化分析：通过多序列比对和系统发育树构建等方法，分析大肠杆菌与其他相关物种之间的演化关系。
三、结果与讨论1. 基因组结构：通过测序和拼接，我们得到了大肠杆菌的完整基因组序列，并发现其具有单个的圆形染色体。
基因组大小为4.6兆碱基对，含有大约4000个基因。
2. 基因功能和注释：通过对基因组进行注释和功能预测，我们发现其中包含多个致病性因子和抗生素抗性基因。
此外，还发现了许多调控基因和代谢酶基因，这些基因对大肠杆菌的生长和适应环境起着重要作用。
3. 演化关系：通过与其他相关物种进行比较和分析，我们发现大肠杆菌与其他肠道细菌存在较高的相似性，这可能说明它们具有共同的起源和进化历史。
综上所述，本研究通过细菌基因序列的测定和分析，揭示了大肠杆菌基因组的结构、功能和演化等方面的信息。
这对于进一步理解细菌基因组的特征和功能具有重要的意义，也为生物医学研究和药物开发提供了新的线索与依据。
