生理指标的测定-SOD-MDA-CAT-POD-叶绿素

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化复原法）1、试剂的配制1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液:取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/LPBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4)228.75ml，B母液(NaH2PO4)21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。

参照文件：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育第一版社，2000：267～268。

2）14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000ml。

（3）30μMEDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。

（4）60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保留。

5）2.25mM氮蓝四唑(NBT)溶液：取0.1840gNBT用PBS定容至100ml，避光保留。

酶液制备：取0.2g（可视状况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml50mmol/L 预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为酶液。

2、酶活性测定1）反响混淆液配制(以60个样为准)：分别取Met溶液162ml，EDTA-Na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml,混淆后摇匀；（2）分别取3ml反响混淆液和30μl酶液于试管中光照下反响（3）将试管置于光照培育箱中在4000lux20min；同时做两支比较管，此中后测定作为最大光复原管，1支试管取3ml反响混淆液加入30μlPBS（不加酶液）照光另1支只加缓冲液置于暗中测准时用于调零。

棉花叶片和根系中SOD、POD、CAT、MDA的测定研究表明逆境胁迫可使植物体内活性氧的产生和消除平衡失调，造成植物体内大量的自由基累计，进而膜脂结构的损伤和加速植物的衰老进程。

测定植物体内膜脂过氧化产物MDA的含量及植物体内抗氧化酶SOD、POD的活性高低，可在一定程度上反映逆境对植物的损害程度合作植物的衰老进程。

关于干旱、渍水、盐害和高温等逆境胁迫对作物候期衰老的影响的研究已有不少报道，但是在不同根土空间对作物衰老方面的研究尚不多见。

张永清等研究表明高粱在不同根土空间下，根土空间缩写降低了SOD、POD的含量，而对于不同配置及水分条件下棉花根系及地上部生理活性的研究较少因此探讨不同根系空间条件下对棉花根系生理特性、棉花后期衰老的影响。

测定部位：地上部：倒四叶地下部：上层（0-20cm）中层（20-40cm）下层（40-80 cm）根样一磷酸缓冲液的配制：A液：0.2M的KH2PO4溶液称取分析纯KH2PO427.216克，用蒸馏水定容至1000毫升。

B液：0.2M的K2HPO4溶液称取分析纯K2HPO4•3H2O45.644克，用蒸馏水定容至1000毫升。

或（A液：0.2M的NaH2PO4溶液称取分析纯NaH2PO4•2H2O 31.21克，用蒸馏水定容至1000毫升。

B液：0.2M的Na2HPO4溶液称取分析纯Na2HPO4•12H2O 71.64克，用蒸馏水定容至1000毫升。

）二、酶液的制备：称取0.5g放入研钵中，加5毫升PH=7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，冷冻离心20分钟（10000转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于0~40C下保存待用。

SOD（超氧化物歧化酶）的测定：1.SOD反应液的配制：母液的配制：（1）0.05M 磷酸缓冲液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;(2) 130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met 用磷酸缓冲液定容至100ml；（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；(4) 100μM EDTA-Na2: 取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，避光保存；(5) 20μM FD (核黄素): 0.00753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml。

植物生理学中各项生理指标的测定方法一.实验内容实验1MDA(丙二醛)含量测定所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯）0.25%硫代巴妥酸(纯)实验2：可溶性蛋白含量测定所需试剂：考马斯亮蓝G-25095%乙醇85%磷酸实验3：SOD(超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met）NBTEDTA-Na2核黄素实验4：CAT(过氧化氢酶)活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：PBS（PH=7.0）30%H2O2实验五：Ap某(抗坏血酸过氧化物酶)活性（即ASA—POD活性）测定所需试剂：ASA（分子量167.12）(乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2PBS(pH7.0)30%H2O实验6：ASA(维生素C)含量测定偏磷酸95%乙醇磷酸4%2,2-二联吡啶FeCl3（或FeCl3·6H2O）实验7：GSH(谷胱甘肽,媚力肽GSHGSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物)含量测定所需试剂：NaH2PO4·2H2ODTNB（二硫代硝基苯甲酸）PBS(PH6.8)实验8：脯氨酸测定所需试剂：磺基水杨酸甲苯茚三酮冰乙酸85%磷酸试验9：叶绿素含量测定。

80%丙酮试验9：GR活性测定试验10：过氧化氢含量测定。

三氯乙酸试验11：超氧阴离子含量测定二．酶液和母液提取1.酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）(内含1%(m/v)聚乙烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/LEDTANa2或EDTA)，也可为（内含2%(m/v)PVP），0.2mmol/LEDTANa2或EDTA）（先配制后用缓冲液定容）2.ASA.GSH母液提取所需试剂：5%偏磷酸1．抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT）：1g（根据样品的量,少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml.50mmol/L 磷酸缓冲液（PH=7.8）↓4℃冷冻15000g离心20分钟↓上清液即为酶液（5℃下保存一两天内备用，中短期用-20℃保存）2．ASA.GSH母液提取：0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液↓4℃冷冻14000g离心10分钟↓上清液即为母液（5℃下保存备用）（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA）酶液提取所需试剂：PVP（聚乙烯吡哆烷酮）：1%（1g溶于100ml水），1000ml需称取10g，此处用PBSEDTA-Na2:0.1mmol/L(37.2mgEDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水)，此处用PBSPBS（缓冲液）配制方法：①Na2HPO4·12H2O②NaH2PO4·2H2O取①71.64g，蒸馏水定容至1L，取②31.21g定容至1L，放置4℃冰箱备用PH=7.8取①91.5ml+②8.5ml=100ml(浓度0.2mol/L)需要0.05mol/L→将上述溶液烯释至400ml（0.2mol/L某0.1=0.05mol/L某V）母液提取所需试剂：5%偏磷酸：称5g纯偏磷酸，定容至100ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60℃）偏磷酸有剧毒（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）（现所用为38%HPO3，所以需称65.7895g，定容至500ml）三．实验步骤实验1：MDA含量测定1.1所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯）称10g定容至100ml0.25%硫代巴妥酸(纯)称0.25g用10%TCA定容至100ml（配制时，可一次完成，先配TCA，不要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热）1.2步骤：取0.3g叶片，加4ml磷酸缓冲液研磨，加入4ml0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液↓摇匀95℃加热15分钟↓快速冷却3000g离心15分钟↓取上清测定OD532，OD600，OD450值↓按公式求MDA浓度=6.45某（OD532-OD600）-0.56OD450(μmol/L)可溶性糖浓度=11.71某OD450(mmol/L)-3最后计算MDA含量（μmol/gFW）=[4某（MDA浓度某）某10/0.1]-3同时，可测得可溶性糖含量（mmol/gFW）=4某（可溶性糖浓度χ）某10/0.1（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入）注意：以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零MDA含量测定的改进1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量，用量可以定为1.0、1.5或2.0（较好）ml。

叶绿素，SOD,MDA,POD,硝酸还原酶等测定方法(2009-04-12 20:40:12)标签：教育分类：教育实验测定方法1 叶绿素含量测定：80％的丙酮液的配制：4L丙酮 + 1L蒸馏水。

称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80％的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm下测定光密度，以80％的丙酮液为空白。

（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36）也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/2452 抗氧化酶活性的定：（2.5g样）0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L。

（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。

取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。

2.1丙二醛（MDA）的测定：20％三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。

（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）；0.5% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20％三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml。

（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解）；0.5ml酶液（对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+ 3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却（至少30min）――比色（OD600、OD532、OD450）。

缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液1.SOD的测定方法加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3ml NBT: 0.3ml EDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml试剂配制：(1) 0.05mol/L PBS：pH7.8(2) 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml(3) 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)(4) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml(5) 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml(避光保存) 注：（1）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管(2) 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值2.MDA的测定方法试剂配制：（1）5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml（2）0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml方法：酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却，10000r/min离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制：（1）0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A(0.2mmol/L的HAc溶液)—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中B(0.2mmol/L的NaAc溶液)—（2）0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中（临用前配制）（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml（临用前配制）方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液（5min值为500-800即可）—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min4.CAT的测定方法试剂配制：(1) 50mmol/L的PBS（pH7.0） (2) 0.3% H2O2—1ml H2O2定容至100ml 方法：(1)以不加H2O2的50mmol/L的PBS（pH7.0）为空白把A240调零(2)50ul酶液—3ml 50mmol/L的PBS（pH7.0）—0.2ml 0.3% H2O2—迅速颠倒混匀，开始计时—1min后在240nm下比色，1次/1min(连续读取5min)。

一.实验内容实验1 MDA(丙二醛)含量测定所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯） 0.25%硫代巴妥酸 (纯)实验2：可溶性蛋白含量测定所需试剂：考马斯亮蓝G-250 95%乙醇 85%磷酸实验3：SOD(超氧化物歧化酶)酶活性测定所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met） NBT EDTA-Na2 核黄素实验4：CAT(过氧化氢酶)活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：PBS（PH=7.0） 30% H2O2实验五：Apx(抗坏血酸过氧化物酶)活性（即ASA—POD活性）测定所需试剂：ASA（分子量167.12） (乙=胺四乙酸=钠)EDTA—Na2 PBS (pH7.0) 30%H2O实验6： ASA(维生素C)含量测定偏磷酸 95%乙醇磷酸 4% 2,2-二联吡啶 FeCl3（或FeCl3·6H2O）实验7：GSH(谷胱甘肽, 媚力肽GSH GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物)含量测定所需试剂：NaH2PO4·2H2O DTNB（二硫代硝基苯甲酸） PBS (PH6.8)实验8：脯氨酸测定所需试剂：磺基水杨酸甲苯茚三酮冰乙酸 85%磷酸试验9：叶绿素含量测定。

80%丙酮试验9：GR活性测定试验10：过氧化氢含量测定。

三氯乙酸试验11：超氧阴离子含量测定二．酶液和母液提取1. 酶液提取所需试剂：50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）(内含1% (m/v) 聚乙烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/L EDTANa2或EDTA)，也可为（内含2% (m/v)PVP），0.2mmol/L EDTA Na2或EDTA）（先配制后用缓冲液定容）2. ASA . GSH母液提取所需试剂：5%偏磷酸1．抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT）：1g（根据样品的量,少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml. 50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）↓4℃冷冻15000g离心20分钟↓上清液即为酶液（5℃下保存一两天内备用，中短期用-20℃保存）2．ASA . GSH母液提取：0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液↓4℃冷冻14000g离心10分钟↓上清液即为母液（5℃下保存备用）（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA）酶液提取所需试剂：PVP（聚乙烯吡哆烷酮）：1%（1g溶于100ml水），1000ml需称取10g，此处用PBSEDTA-Na 2 : 0.1mmol/L (37.2mg EDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水)，此处用PBSPBS（缓冲液）配制方法：① Na2HPO4·12H2O ② NaH2PO4·2H2O取① 71.64g，蒸馏水定容至1L，取② 31.21g定容至1L，放置4℃冰箱备用PH=7.8 取① 91.5ml+② 8.5ml=100ml (浓度0.2mol/L)需要0.05mol/L→将上述溶液烯释至400ml （0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）母液提取所需试剂：5%偏磷酸：称5g纯偏磷酸，定容至100 ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60℃）偏磷酸有剧毒（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）（现所用为38%HPO3，所以需称65.7895g，定容至500ml）三．实验步骤实验1：MDA含量测定1.1所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯）称10g定容至100ml0.25%硫代巴妥酸 (纯) 称0.25g用10%TCA定容至100ml（配制时，可一次完成，先配TCA，不要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热）1.2步骤：取0.3g叶片，加4ml磷酸缓冲液研磨，加入 4ml 0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液↓摇匀95℃加热15分钟↓快速冷却3000g离心15分钟↓取上清测定 OD532，OD600，OD450值↓按公式求 MDA浓度=6.45×（OD532-OD600）-0.56OD450 (μmol/L)可溶性糖浓度=11.71×OD450 (mmol/L)最后计算 MDA含量（μmol/g FW）= [4×（MDA浓度x）×10-3/0.1]同时，可测得可溶性糖含量（m mol/g FW）= 4×（可溶性糖浓度χ）×10-3/0.1（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入）注意：以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零MDA含量测定的改进1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量，用量可以定为1.0、1.5或2.0（较好）ml。

SOD活性测定POD活性测定CAT活性测定质膜透性测定MDA含量测定色素含量测定实验方案一、细胞质膜透性的测定（电导法）材料、仪器设备1.材料：植物叶片，每个样本1cm2的小叶片1g。

2.仪器药品：洗洁精；电导仪；电子天平；冰箱；真空泵；真空干燥器；恒温培养箱；电炉；50ml烧杯；50ml量筒；小镊子；纱布；表皿；滤纸条；镜头纸；剪刀；玻棒；胶头滴管；瓷盘。

实验步骤1.清洗用具所用玻璃用具均需先用洗洁精清洗，然后用自来水洗3次，再用蒸馏水洗3次，然后放入或倒置在洗净的且垫有洁净滤纸的器皿中干燥后备用。

2.实验材料的准备及处理选取叶龄叶位长势均相似的植物叶片，剪下后用湿布包住放在已经编号的保鲜袋中，最后用保鲜盒封存带回。

实验前用自来水冲洗叶片，除去表面沾污物，再用蒸馏水冲洗2次，用洁净滤纸轻轻吸干叶片表面水分放于已编号的洁净器皿中，然后分别剪成约1cm2的小叶片（或用直径为1cm2的打孔器钻取小圆片），注意除掉大叶脉。

将剪下的小叶片分别混合均匀，每个样本再快速称取鲜样2份，每份0.5g，分别放入编号为X-n-a、X-n-b的50ml烧杯中，另取编号C的烧杯，不加鲜样留作空白本底对照。

每个样本的三个烧杯中均加入蒸馏水30ml 浸泡，将盛有鲜样的a、b烧杯放入真空干燥器中，用真空泵抽气25min（以抽出细胞间隙中的空气），然后缓缓放入空气，从真空干燥器中取出a、b烧杯，a、C杯继续常温浸泡，b 杯称重，盖上表皿，置于电炉上煮沸15min，冷却后再称重并加蒸馏水至原重量，继续室温自然浸泡45min即可测定。

各样本处理时浸泡时间和处理温度要保持一致，均保持在室温下。

（注：自然浸泡需要4～5h以上，为防止样品表面气泡的影响故用真空干燥管去除气泡，也可以在振荡器上浸泡1～2h。

）3.测定电导值在测定前先将各杯浸泡液摇匀，测出各杯样本浸出液电导率值，记录到原始数据表上相应栏中。

（注意：每测定完一个样液后，用蒸馏水漂洗电极，再用滤纸将电极擦干，然后进行下一个样液的测定）原始数据表样表如下：电导率测定记录表：样本编号处理电导率值(μS · cm－1)相对外渗率（％）空白对照C管（常温蒸馏水空白）___—___ (第X组第n个重复)a管（常温）b管（煮沸）___—___a管（常温）b管（煮沸）___—___a管（常温）b管（煮沸）4、结果计算按下公式计算低温及常温处理电解质的相对外渗率：电解质的相对外渗率（％）＝× 100%二、叶绿素含量的测定（丙酮提取法）材料、仪器设备1.材料：植物叶片，每个样本0.5g。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法抗氧化酶是生物体内重要的防御系统，它们通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。

其中，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是三种主要的抗氧化酶。

测定这些酶的活性对于评估生物体的抗氧化能力具有重要意义。

本文将介绍几种常用的抗氧化酶活性测定方法。

1. 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法SOD是一种能够催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为氧气（O2）和过氧化氢（H2O2）的酶。

常用的SOD活性测定方法包括：氮蓝四唑（NBT）法：利用NBT在超氧阴离子自由基存在下被还原成蓝色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算SOD活性。

羟胺法：利用羟胺与超氧阴离子自由基反应硝酸盐，通过测定硝酸盐的量来计算SOD活性。

2. 过氧化物酶（POD）活性测定方法POD是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的POD活性测定方法包括：愈创木酚法：利用愈创木酚在过氧化物酶存在下被氧化红色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

邻苯三酚法：利用邻苯三酚在过氧化物酶存在下被氧化紫色化合物的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算POD活性。

3. 过氧化氢酶（CAT）活性测定方法CAT是一种能够催化过氧化氢（H2O2）分解为水和氧气的酶。

常用的CAT活性测定方法包括：紫外分光光度法：利用过氧化氢在紫外光下具有吸收的特性，通过测定反应液的吸光度变化来计算CAT活性。

酶偶联法：利用过氧化氢在过氧化物酶存在下被氧化水的特性，通过测定水的量来计算CAT活性。

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定的实验步骤与注意事项实验步骤1. 样品准备提取酶：根据实验目的，选择合适的组织或细胞提取酶。

常用的提取缓冲液包括磷酸盐缓冲液、TrisHCl缓冲液等。

离心：将提取液离心，分离上清液和沉淀物。

上清液中含有目标酶，沉淀物则含有杂质。

蛋白质定量：使用 Bradford 法或 Lowry 法等蛋白质定量方法测定上清液中的蛋白质浓度。

植物组织中SOD、POD、CAT、MDA的测定一、磷酸缓冲液的配制：A液：0.2M的NaH2PO4溶液称取分析纯NaH2PO4•2H2O 31.21g，用蒸馏水定容至1000ml。

B液：0.2M的Na2HPO4溶液称取分析纯Na2HPO4•12H2O 71.64g，用蒸馏水定容至1000ml。

）二、酶液的制备：称取0.5g放入研钵中，加5ml PH=7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，冷冻离心20分钟（若做可溶性蛋白，转速为4000转/分钟，若不做，则10000转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于0~40C下保存待用。

三、S OD的测定（NBT法)：1.SOD反应液的配制：母液的配制：（1）0.05M 磷酸缓冲液（pH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml;(2) 130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399gMet 用磷酸缓冲液定容至100ml；（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；(4) 100μM EDTA-Na2: 取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，避光保存；(5) 20μM FD (核黄素): 0.00753gFD用磷酸缓冲液定容至1000ml。

用前配，避光！！！SOD反应液：磷酸缓冲液：Met：NBT：EDTA-Na2：核黄素（FD）：H2O的比例为15：3：3：3：3：2.5，按母液顺序配制。

2.SOD的测定：取5ml离心管，吸取20μl的酶液，加入3ml反应液，4000Lux照光30分钟，同时取四支试管，三支做对照，一支做空白（不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，对照（CK）与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟，遮光保存，以空白调零，560nm 比色。

3.结果计算SOD总活性（吸光度/g·FW）=（A CK—A E）×V／（W×0.5×A CK）单位：NBT光还原50%为单位SOD 比活性（酶单位/mg蛋白）= SOD总活性/蛋白质浓度四、POD的测定：1.0.1M pH6.0磷酸缓冲液的配制：0.2 M Na2HPO4 (B液)6.15mL与0.2 M NaH2PO4(A液)43.85mL充分混匀定容至100ml2.POD反应液的配制：0.1M pH 6.0的磷酸缓冲液50ml于烧杯中，加入愈创木酚28μl，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30%H2O2 19μl混合，保存于冰箱中。

1、氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）2、POD（过氧化物酶）活性的测定——愈创木酚法3、CAT(过氧化氢酶)测定4、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定5、谷胧甘肽还原酶(GR)的活力测定:6、O2-产生速率的测定7、过氧化氢(H2O2)含量的测定——碘化钾分光光度法8、丙二醛（MDA）含量的测定9、还原型抗坏血酸（ASA）和脱氢抗坏血酸（DHA）的测定10、谷胱甘肽还原酶测定11、MDAR(单脱氢抗坏血酸还原酶)活性的测定12、可溶性总糖的测定13、考马斯亮蓝G-250染色法测定可溶性蛋白含量14、叶绿素含量的测定15、石蜡制片的制作16、激素Indole-3-Acetic Acid（IAA）、Abscisic Acid（ABA）、GA3和ZA的测定17、cDNA扩增片段长度多态性技术（cDNA-AFLP）18、3′/5′RACE 扩增基因全长19、根系活力的测定（TTC法）一氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）【实验原理】SOD是含金属辅基的酶。

高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应：由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。

并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。

核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。

当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。

通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm 波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。

反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。

【仪器、材料与试剂】（一）仪器1. 分光光度计2. 台式离心机（二）材料1. 磷酸氢二钠2. 磷酸二氢钠3. 甲硫氨酸4. EDTA-Na25. 核黄素6. 氮蓝四唑(NBT)7. 陶瓷小研钵8. 4-5ml 离心管9. 10ml 玻璃试管（三）试剂1. 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

常见生理指标的测定方法一、SOD1、称0.2g叶片（去叶脉）——研钵(加1mLPBS7.8）——定容至2mL离心管——离心（15000r，15min）——得上清液2、取1.5mLPBS7.8，Met、NBT、核黄素溶液EDTA-Na2各0.3mL，上清液0.1mL（对照管用0.1mLPBS7.8替代,2支）ddH2O0.5mL（温控25℃-35℃，光强4000Lx）——560nm处比色——计算二、POD、CAT称0.2g叶片（去叶脉）——研钵(加1mLPBS7.8）——定容至2mL离心管——离心（15000r，15min）——得上清液1、POD：加1mLH2O2，愈创木酚0.95mL，PBS7.0 1mL,上清液0.05mL——于470nm处比色——分析计算2、CA T：加1mL，H2O1.95mL,上清液0.05mL——于240处比色——计算三、MDA×1+1、外加离心管×11、0.5g——研钵（加2mL10%TCA）——研磨（8mL10%TCA）——定容至10mL离心管——离心（5000r，-min）——得上清液2、取2mL上清液（加2mLTBA,对照以水代替）——沸水浴15min——于450、532、600nm 处比色——计算四、叶绿素0.2g——25mL试管（加20mL提取液，丙醇：乙醇=2:1）——放置24h——于645、663nm处比色——计算五、蛋白质含量测定×2+1,外加离心管×11、标准曲线的制作取6支具塞试管按下表加入试剂，配制0--1000µg/mL牛血清蛋白液各1mL编号0 1 2 3 4 5蛋白标液mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0ddH2O 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0蛋白含量µg0 200 400 600 800 1000。

SOD,POD,CAT,MDA,可溶性蛋白用同一提取液。

磷酸缓冲液配制：A液（Na2HPO40.2M）:Na2HPO4.2H2O=35.61g(或Na2HPO4.12H2O=71.64g)定容1000MLB液（NaH2PO4 0.2M）:NaH2PO4.H2O=27.6g(或NaH2PO4.2H2O=31.21g)定容到1000ml浓度mol/l PH值A液体积ml B液体积ml 定容体积ml0.05 7.8 91.5 8.5 4000.1 7.5 84 16 2000.1 7.0 61 39 2000.1 6.0 12.3 87.7 2001/15 7.0 61 39 300130mmol/l甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml0.75mmol/l氮蓝四唑（NBT）溶液：称0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml避光保存0.1mmol/LEDTA-Na2溶液：取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml0.02mmol/l核黄素溶液：取0.00753g核黄素定容至1000ml避光保存反应液组成水：磷酸：Met：NBT：EDTA-Na2：FD=5：30：6：6：6：6150ml反应液的组成是水12.7ml+磷酸（0.05M,PH=7.8）76.3ml+Met15.25ml+NBT15.25ml+EDTA=Na215.25ml+FD15.25mlSOD：称取0.5g鲜样，加1ml磷酸缓冲液（0.05mol/L PH=7.8），冰浴研磨，研磨后再加入1ml缓冲液倒入离心管，再用2ml缓冲液冲洗研钵，倒入离心管中，平衡后低温（0-4℃）10000rpm离心后10min冷藏保存。

取相同型号的试管，加入20μl上清液（2支对照管加缓冲液），分别加3ml反应液，其中一支对照放于暗处，其余在4000lux下反应20-30min（温度高时时间短，温度低时时间长）后再560nm下进行比色。

处理前叶绿素含量测定山豆根（2号菌）A663nm A645nm实验1号0.570.762实验2号0.09910.836实验3号 1.0220.807实验4号 1.0130.796对照1号 1.1550.083对照2号 1.0860.866金钱草（13号菌）（实验1号 1.1370.0431实验2号 1.1870.0451实验3号 1.1940.456实验4号 1.620.652实验5号 1.6240.653实验6号 1.2380.468对照1号0.703 1.387对照2号0.921 1.347对照3号0.6930.959对照4号0.807 1.328CAT含量的测定称0.5g叶片+ml缓冲液研磨 波长240nm记录6次数据山豆根（2号菌）提取液ml第一分钟第二分钟第三分钟第四分钟无菌对照1号 2.60.2320.2440.250.257无菌对照2号 2.80.2520.2820.270.276正常 3.40.2530.2660.2660.251轻度干旱 3.40.2830.2950.3080.312中度干旱 3.60.2310.240.2410.246重度干旱 3.60.3510.3670.340.319金钱草（13号菌）3无菌对照1号 3.80.2730.2920.2750.291无菌对照2号 3.80.2230.2290.2330.236正常 3.80.3130.3190.3070.297轻度干旱 3.40.2280.250.2650.262中度干旱 3.60.3150.3130.3210.314 SOD含量测定 波长：560nm山豆根(2号菌)提取液总体积ml结果无菌对照1 2.60.026无菌对照2 2.80.019轻度干旱 3.40.024中度干旱 3.60.022重度干旱 3.60.06正常 3.40.046金钱草（13号菌）无菌对照 3.80.054正常 3.80.043中度干旱 3.60.081轻度干旱 3.40.017第一次测量叶绿素含量测定山豆根（2号菌）A663nm A645nm重度干旱0.9750.627无菌0.6350.752中度干旱0.6350.452轻度干旱0.2560.638正常 1.509 1.076金钱草（13号菌）正常0.2210.161中度干旱0.4950.382无菌 1.097 1.174轻度干旱0.8630.785POD含量的测定 A470 0.5g+5ml缓冲液 取0.5ml提取液+4.5ml缓冲液稀释金钱草（2号菌）第一分钟第二分钟第三分钟第四分钟无菌（溶液稀释20倍）0.208 1.796 1.959 2.046轻度干旱（溶液稀释100倍）0.065 1.065 1.538 1.77轻度干旱（溶液稀释100倍）0.207 1.292 1.721 1.959正常（溶液稀释100倍）0.127 1.569 1.8862正常（溶液稀释100倍）山豆根（13号菌）重度干旱（稀释50倍）0.159 1.065 1.538 1.745中度干旱（溶液稀释100倍）0.382 1.569 1.9212中度干旱（溶液稀释100倍）0.141 1.467 1.594 1.72轻度干旱（溶液稀释100倍）0.398 1.854 2.046 2.097轻度干旱（溶液稀释100倍）0.327 1.644 1.959 2.084第一次第二次第三次第四次第五次CAT测定 240nm 15s后读数每隔30s金钱草（2号菌）轻度干旱0.3450.3450.3310.3450.36轻度干旱0.1270.1810.170.1590.148正常0.1510.1510.1650.1540.132正常0.1540.1430.150.1650.143无菌0.1020.1120.1220.1320.143中度干旱0.1320.1430.1650.1430.143中度干旱0.1220.1020.1220.1020.112山豆根（13号菌）重度干旱0.0980.1060.1060.1060.115重度干旱0.150.1690.1490.1690.159无菌0.1890.1990.2090.1990.22无菌0.1890.1990.2090.1990.22无菌0.2430.2430.2310.2430.266中度干旱0.1790.2090.2090.1990.179轻度干旱0.1990.1990.220.2310.278轻度干旱0.2540.2430.2310.3170.345第五分钟第六分钟0.2720.2610.260.2760.2580.2610.2920.3020.2490.2940.2730.2380.2930.2890.2460.2530.2930.305第五分钟第六分钟2.155 2.3011.8862.2222.046 2.1552.301 2.3981.824 1.8862.097 2.1551.824 1.9212.222 2.3012.223 2.301第六次0.3450.1590.1540.1540.1540.1321.320.1320.150.148 0.220.220.2540.231 0.1890.189 0.3750.331 0.2780.278。

酶液提取:称取鲜叶样品。

0.5g于预冷的研钵中，加lml0.05mol/1 pH7.0磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。

将提取液于10000转/分冷冻离心20分钟，上清液用于测定SOD, POD, CAT活力测定及丙二醛含量测定。

SOD：测定SOD活性的试剂配制及用量:①磷酸缓冲液(PH7.8) 0.05moI/L 3.1m1，空白为3.2m1;②EDTA-Na21mg/m1 0.2mL;③L一甲硫氨酸20mg/mL 0.2m1;④核黄素0.1 mg/ml，吸取上清液0.2m1;⑤NBT lmg/ml 0.2m1;⑥提取酶液0.1ml，空白不加酶液。

反应总体积为4m1,第1组、4000Lx光照30min，遮黑布终止反应。

第2组、黑暗处理30 min。

置560nm处测定光密度。

SOD活性单位以抑制NBT光化还原50%作为一个酶活性单位(u)，按以下公式计算SOD活性:式中，Ack为照光管的吸光度值;AE为遮光管的吸光度值:V为样品液总体积((ml);Vt为测定时样品用量(ml); W为样品鲜重。

POD：在试管中依次加入4m1 0.3%愈创木酚(0.02mo1/1 pH6磷酸缓冲液配置)、50ul酶液、50 ul0.3%H202，摇匀，立即计时，1分钟后在470nm波长下比色，每1分钟记录一次吸光度值，连续记录5分钟。

以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)，按下式计算过氧化物酶活性:式中:d A470为反应时间内吸光度的变化:Vt为提取液总体积(ml); W为样品鲜重(g); Vs为测定时取用酶液体积(ml); t为反应时间(min) 。

CAT取酶提取液50 u 1，加入3m1 0.05 mol/1 pH7.0磷酸缓冲液，再加入0.3%H2O2200 u1，迅速摇匀，立即计时，1分钟后在UV-754分光光度计的240nm波长下比色，每1分钟记录一次吸光度值，连续记录5分钟。

常见生理指标测定用方法――SOD、POD、CAT、可溶性蛋白、叶绿素、电导率、可溶性糖、MDA、脯氨酸、叶片含水量SOD酶液可用于SOD、POD、CAT、可溶性蛋白指标的测定，即POD、CAT、可溶性蛋白三个指标不用再取叶片。

SOD酶液的提取。

每个重复称取去叶脉的叶片组织约0.25g。

剪碎放入预先冷却好的研钵中，加入少量(2-3 ml，因总体积只有9 ml，还要冲洗2次)的磷酸缓冲液(0.05 mol/L，PH=7.8)（不加PVP）研磨成匀浆，然后倒入10 ml的带刻度的塑料离心管中（预先洗好晾干），并用此磷酸缓冲液定容到9 ml。

在3000转，4℃高速离心机（提前4℃预冷一下，设好4℃后提前空转运行一下）中离心15分钟，将提取的酶液放入置有冰袋的塑料盒中，低温保存，备用。

宜用酶液将4个指标当天测完，切记。

实验一氮蓝四唑(NBT)法测定SOD活力（优先1-用材0.25 g）1.实验原理超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它的反应产物可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560 nm处有最大吸收。

而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制甲腙的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

据此可以计算出酶活性大小。

2. 材料、仪器设备及试剂（一）材料叶片。

（二）仪器设备高速台式离心机，分光光度计，微量进样器（要注意测试一下是否准确，用玻璃移液管来对比），荧光灯（反应试管处照度为4000 lx），我们用的光照培养箱，33%的光照下，上数第二个架子中间位置为4000 lx。

叶绿素含量采用无水乙醇的方法测定超氧化物歧化酶SOD活性采用邻苯三酚自氧化法测定过氧化物酶POD活性采用愈创木酚法测定过氧化氢酶采用过氧化氢法测定丙二醛采用硫代巴比妥酸法测定蛋白质含量采用考马斯亮蓝法每次测定重复3次，取平均值测定方法一．SOD，CAT及POD活性的测定分别取0.4ｇ材料于预冷的研钵中，加入8 ml预冷的50 mmol-1磷酸缓冲液（pH 7.8）（甲液：取Na2HPO4 35.9g，加水溶解，并稀释至500mL 乙液：取NaH2PO4 2.76g，加水溶解，并稀释至100mL 取上述甲液91.5mL和乙液8.5mL，混合摇匀即得。

先加2ml, 在冰浴下研磨成匀浆后，将匀浆转入10ml离心管，再用6ml冲洗），10000 rpm离心15 min，取上清液定容至10ml后于4℃保存。

上清液用于可溶性蛋白质含量、SOD活性及POD活性的测定。

SOD活性测定1.显色反应取5mL指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按表47–1加入各溶液。

混匀后，给1支对照管照上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20-30 min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，使酶活性高低适当调整反应时间)。

当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表47–1中各试剂(酶液和核黄素除外)按比例混合后一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变。

液蒸馏水0.5总体积 3.33.SOD活性测定至反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应。

以遮光的对照管作为空白，分别在560nm 下测定各管的OD值，计算SOD活性。

3.<结果计算>已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。

SOD总活性[u/g(FW)]=式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。

比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。

缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液1.SOD的测定方法加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3ml NBT: 0.3ml EDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml试剂配制：(1) 0.05mol/L PBS：pH7.8(2) 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml(3) 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)(4) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml(5) 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml(避光保存) 注：（1）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管(2) 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值2.MDA的测定方法试剂配制：（1）5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml（2）0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml方法：酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却，10000r/min离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制：（1）0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A(0.2mmol/L的HAc溶液)—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中B(0.2mmol/L的NaAc溶液)—（2）0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中（临用前配制）（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml（临用前配制）方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液（5min值为500-800即可）—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min4.CAT的测定方法试剂配制：(1) 50mmol/L的PBS（pH7.0） (2) 0.3% H2O2—1ml H2O2定容至100ml 方法：(1)以不加H2O2的50mmol/L的PBS（pH7.0）为空白把A240调零(2)50ul酶液—3ml 50mmol/L的PBS（pH7.0）—0.2ml 0.3% H2O2—迅速颠倒混匀，开始计时—1min后在240nm下比色，1次/1min(连续读取5min)。

1叶绿素含量测定取样0.2g左右，剪碎，放入黑色胶卷盒中加20ml等量丙酮乙醇混合液（0号调零管：20ml等量丙酮乙醇混合液），48h以后，待材料变白，取上清夜于440、645、663nm处测其OD 值。

计算：叶绿素a含量C＝12.7d663-2.69d645叶绿素b含量C＝22.9d645-4.68d663叶绿素总含量C＝20.2d645+8.02d663类胡罗卜素含量C＝4.7d440-0.27(叶绿素a含量+叶绿素b含量)2脯氨酸含量的测定配药：(1)3%磺基水杨酸溶液: 6g----200ml(2)2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/l磷酸经3：2混合，作为溶剂进行配制。

冰乙酸 90ml85%磷酸（15mol/l）24ml用去离子水定溶至60ml茚三酮 3.75g测定：（1）脯氨酸提取：取不同处理的剪碎叶片0.5g，分别置于大试管中，加入5ml 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min.(2)取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml显色液（0号调零管：2ml 冰乙酸+3ml显色液+2ml去离子水），于沸水浴中加热40min.(3)取出冷却后向各试管加入5ml甲笨充分振荡，以萃取红色物质。

静置，待分层后吸取甲笨层，以0号管为对照在波长520nm下比色。

计算: 从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量。

Y = ( C * V ) / ( A * W )式中：C――提取液中脯氨酸含量（由标准曲线求得），ug;V――提取液总体积，5 mlA――测定时所吸取的体积，2ml;W――样品量，g;Y――脯氨酸含量（干重或鲜重），ug/g.SOD,POD,MDA酶和可溶性蛋白质的配药：3个重复，1SOD1 pH7.8磷酸缓冲液:(a)14.4gNa2HPO4·12H2O溶于400mL水中取366mL；（b）6.24gNaH2PO4·2H2O溶于400mL水中取34mL;两液混成400mL，即为pH7.8磷酸缓冲液。