毒素快速检测方法58页PPT

选取菌落数在 10 CFU～150 CFU 的平板，根据菌落形态分别计数霉菌 和酵母数霉菌蔓延生长覆盖整个平板 的可记录为多不可计。菌落数应采用 两个平板的平均数。
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2.1.4.1 结果
计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相 应稀释倍数计算。
若所有平板上菌落数均大于 150 CFU，则对稀释度最高的 平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落 数乘以最高稀释倍数计算。
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自从20 世纪 60 年代发现强致癌的黄曲霉毒素以 来,霉菌与霉菌毒素对食品的污染日益引起重视。我国 在2011 年颁布了国家标准 GB2761-2011食品中真菌毒 素限量,各级食品监督检测机构全面开展霉菌的检测工 作。
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62.1霉菌检测方法01 方法GB4789.15-2010 食 品微生物学检验霉 菌和酵母计数。
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2.1.5 镜检
B.1 检样的制备：取定量检样,加蒸馏水稀释至折光指数为 1.3447～ 1.3460（即浓度为7.9%～8.8%），备用。 B.2 显微镜标准视野的校正：将显微镜按放大率 90～125 倍调节标 准视野，使其直径为 1.382 mm。 B.3 涂片：洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液，用玻璃棒均匀的 摊布于计测室，以备观察。 B.4 观测：将制好之载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测， 一般每一检样观察 50 个视野，同一检样应由两人进行观察。 B.5 结果与计算：在标准视野下，发现有霉菌菌丝其长度超过标准 视野（1.382mm)的1/6或三根菌丝总长度超过标准视野的1/6（即测 微器的一格）时即为阳性（+），否则为阴性（-），按100个视野计， 其中发现有霉菌菌丝体存在的视野数，即为霉菌的视野百分数。

射性同位素对工作人员有一定的伤害，废弃物又不易处理，这些不
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利因素限制了该法的广泛应用。
2.酶免疫技术(EIA )
❖酶免疫技术是用酶标记的已知抗原或抗体，检测 标本中的相应抗体或抗原，将抗原抗体反应的特异 性与酶催化反应的专一性相结合的免疫检测技术。
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酶联免疫吸附法
（enzyme
linked immunosorbant assay， ELISA）
❖ 加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有 色产物，产物的量与标本中受检物质的量直 接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性 或定量分析。
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ELISA原理图
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ELISA基本的实验过程
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❖ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体
❖在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体 ②酶标记的抗原或抗体 ③酶作用的底物
❖ 农药残留量是施药后的必然现象，但如果超过最大
残留量，对人畜产生不良影响或通过食物链对生态
系统中的生物造成毒害，则称为农药残留毒性（简
称残毒）。
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❖ 目前，我国农药残留较为突出的是蔬菜中的农 药残留问题。近年来蔬菜被农药污染的情况有 增无减，有机磷农药残留尤为突出。
有机磷农药多为磷酸酯类 或硫代磷酸酯： 对硫磷（1605）、内吸 磷（1059）、马拉硫磷 （4049）、乐果、敌百 虫、敌敌畏。
❖ 酶联免疫吸附法是把抗原抗体反应的特异性和酶的 高效催化作用有机结合起来的一种免疫检测技术。
❖ 将已知抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯板)上 进行酶免疫反应，检测相应的抗体或抗原。
❖ 应用：食品中毒素的测定、食品有害微生物的快速 检测、食品中农药残留的检测、食品中抗生素残留 的检测 （如氯霉素）

贝类毒素简介
神经性贝类毒素
危害范围较小。
活性成分为短裸甲藻毒素A，B，半短 裸甲藻毒素。
贝类毒素简介
神经性贝类毒素
中毒症状：主要为消化系统不适症状，
包括反胃、呕吐、下痢及腹痛，并伴 随着畏寒、头痛、发热等，症状至多 持续2-3天。一般并不会造成死亡， 其愈后良好。
贝类毒素简介
健忘性贝类毒素
鱼类毒素简介
胆毒鱼类

中毒原因：胆汁中含有组胺、胆盐 及氧化物。

鱼胆中毒主要是胆汁毒素严重损伤 肝、肾，造成肝脏变性坏死和肾小 管损害。脑细胞、心血管与神经系 统亦有改变。
鱼类毒素简介
肝毒鱼类


原因：维生素A中毒。 症状：初期为胃肠道症状，以后有 皮肤症状，如鳞状脱皮，自口唇周 围及鼻部开始，逐渐蔓及四肢和躯 干，重者毛发脱落。此外，还有结 膜充血、剧烈头痛等症状。
免疫亲和柱法-最新国标法
该法可以采用配套的荧光仪进行检测，也可 以和高效液相色谱法结合，解决标准物污染和操
作过程繁复等问题。
免疫亲和柱法
该种方法有着较好的权威性和通用性，且为 国外多个组织认可，被列为标准方法，如：

美国公职分析化学家协会（AOAC）
美国农业部联邦谷物检测中心（FGIS）、国际 纯粹与应用化学协会（IUPAC）、美国食品药品 行政署（US-FDA）、美国农业部（USDA） 在国内被认证的机构：中国出入境检验检疫局 （CIQ）、中华人民共和国国家标准（GB）


伏马毒素

伏马毒素的存在极其广泛。主要污染玉米及 其制品，偶尔在高粱、大米和豌豆中发现。 伏马毒素与疯牛病病毒、二恶英、O-157大 肠杆菌和氯丙酮五种污染物被当今世界认为 是危及人类食品安全的五大热点。

1、鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响 鲎试剂的质量：抗干扰才干，稳定性； 鲎试剂灵敏度标示值的准确性 。
1〕、鲎试剂灵敏度的误差
能否用细菌内毒素国家规范品标定？
标示值能否准确？
不同厂家的鲎试剂虽然标示值〔λ〕一样，但 依然存在较大的误差。比如，标示值为0.5EU/ml 的鲎试剂，有的真实灵敏度能够是0.65EU/ml； 而另一个厂家的鲎试剂能够是0.30EU/ml时，按 0.5-2λ误差规范都是合格产品，但对同一检品 在一样的稀释倍数下，这两个厂家的鲎试剂产品 对内毒素的检出程度却不同。
复溶0.5ml鲎试剂时，在旋涡混合器上点击 1-3秒，促进鲎试剂的溶解。
➢由于凝集反响是不可逆的，所以在反响 过程中及察看结果时应留意不要使试管 遭到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性 结果。
➢进展干扰实验时，规范对照系列和含内 毒素的供试品溶液系列应同时进展，并 运用同一支细菌内毒素规范品。
➢在进展鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和 供试品细菌内毒素检查时，各个实验中 要求的对照应同时进展，并在实验有效 的情况才干进展计算和判别。
三、售后技术效力专业，技术优势明显 细菌内毒素检查法在我国已开展了十多年，
经过许许多多专家学者的努力，目前该行业 曾经获得了非常重要的成果，但是该领域依 然有许多我们无法处理问题的存在，它并不 想我们想象的那么简单，这些问题的存在严 重妨碍了该行业的进一步开展，我们将与客 户的交流以及客户咨询的相关问题，进展一 次归纳总结。经过任务中出现的问题有必要 对以下情况进展交流，以加强对细菌内毒素 检查法的正确了解，同时纠正一些错误的观 念。
3、实验器皿的影响 器皿的计量管理〔校正〕 器皿的选择规范 器皿的正确处置
1〕、器皿的选择规范
鲎实验对器皿的要求：刻度准确；内 外表光滑；易于清理。细菌内毒素检查实 验不宜选用注射器，最好运用经过校正的 刻度玻璃吸管或吸嘴。注射器刻度不准确， 内壁磨沙面吸附内毒素，而且要特别留意 注射器针头引入的铁离子对实验结果的干 扰，故不宜选用注射器。

当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检 查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试 验。 当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验 环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时， 须进行干扰试验。

干扰实验
进行干扰试验一般步骤
供试品限值确定 根据鲎试剂的灵敏度确定MVD范围（供试品溶液浓度范围） 预试验（初筛试验）确定样品最大不干扰浓度 正式干扰试验

干扰实验
当Es 在0.5λ～2λ（包括0.λ和2λ）及Et 在0.5Es～2Es（包 括0.5Es和2Es）时，则认为供试品在该浓度下无干扰作用， 可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。 当Et不在0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）时，则认为供 试品在该浓度下干扰实验。应使用适宜方法排除干扰，如 可将供试品进行更大倍数稀释（不超过MVD ）。

干扰实验
4、当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验有效。 当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对 照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此 稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数 进行正式干扰实验。 5、当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性，或供 试品阳性对照不为阳性时，说明供试品对内毒素与鲎试剂 的反应存在干扰，则应对供试品进行更大稀释倍数（不得 超过MVD=CL/λ0.03 ），或通过其他适宜的方法（如过滤、 中和、透析或加热处理等）排除干扰。 6、当供试品的内毒素限值单位为EU/mg或EU/U活性单位 时，应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰浓度（即 稀释倍数下溶液的浓度），以mg/ml或活性单位/ml表示。

实验原理
利用鲎试剂与微量内毒素产 生凝集反应的现象，以判断 供试品中细菌内毒素的限量 是否符合规定的一种方法。

《细菌内毒素检查法》 PPT课件
本课程将介绍细菌内毒素检查法的原理、种类、检测方法、应用领域、优势 和局限性以及实施过程，以及其在研究领域中的发展趋势。
细菌内毒素的危害
1 健康危害
因某些细菌种群大量滋生 释放内毒素而导致食物中 毒、中毒性休克等健康问 题。
2 环境危害
有些细菌内毒素难以处理 且对环境造成危害，例如 鱼类致病性细菌产生的内 毒素对水质造成危害。
3 经济危害
某些细菌内毒素对食品安 全造成威胁，导致企业经 济损失。
检测方法
酶联免疫吸附法
基于免疫抗原抗体对，可检测 极低浓度内毒素。
化学检测法
基于内毒素的化学性质，但存 在交叉反应等缺点。
电子显微镜法
可直接观察细胞内毒素的形态 和分布，但检测精度较低。
生物学检测法
基于细胞生物活性特性，能够 反映细胞内毒素的毒性，但耗 时、费力。
应用领域
食品安全
应用于食品卫生监测和食品 安全评价，确保食品安全。
环境监测
帮助研究水质、土壤污染、 制药废水等环境问题的解决。
医疗诊断
辅助疾病的早期诊断和治疗， 特别是针对慢性病。
优势和局限性
优势
• 检测灵敏度高 • 检测方法多样化 • 结果直观、准确
局限性
• 样品处理条件严格 • 存在交叉反应 • 检测过程较复杂
新材料技术
开发出更为灵敏、可靠、高通量、 低成本的检测材料。
实施过程
1
样品处理
对待检样品进行预处理，获取检测样品。
2
检测方法选择
根据不同检测目的，综合选择检测方法。
3
试剂准备
选择合适的试剂，按照比例配制好所需试剂。
4仪器操作使用合源自的仪器，操作细菌内毒素检测。发展趋势

坏的很少；即使是 200℃高温加热，也不能 这些方法专一性差, 灵敏度低, 一般只作为化学分析法的佐证。
黄曲霉菌产毒要求的温度为12℃~42℃，最适温度为25.
完全正确破坏。一般黄曲霉毒素的裂解温度 同时在国内被认证的机构： 中国出入境检验检疫局（CIQ）、中华人民共和国国家标准（GB）
1、防霉：最好的预防方法是防止粮食等食物的霉变。 最新国标方法“免疫亲和柱法”较好的解决了上面的不足，该种方法可以采用配套的荧光仪进行检测，也可以和高效液相色谱法结合
为280℃，黄曲霉毒素 B1 的裂解温度为 ，解决标准物污染和操作过程繁复等问题。
一次摄入后约1周将大部分排出。
268℃。 样品用甲醇和水混合液进行萃取,随后进行衍生化处理,处理后溶解于流动相,进行液相色谱测定。
黄曲霉毒素M1是动物摄入黄曲霉毒素B1后在体内经羟基化代谢的产物，一部分从尿和乳汁排出，一部分存在于动物的可食部分，如乳 、肝、蛋类、肾、血和肌肉中，其中以乳最为常见。 黄曲霉菌产毒要求的温度为12℃~42℃，最适温度为25. 其原理是:样品经提取、浓缩、薄层分离后,在365 nm波长的紫外光照射下,黄曲霉毒素B1、B2产生紫色荧光,G1、G2产生绿色荧光,然 后根据其在薄层板上显示的荧光的最低检出量来定量。 黄曲霉毒素M1是动物摄入黄曲霉毒素B1后在体内经羟基化代谢的产物，一部分从尿和乳汁排出，一部分存在于动物的可食部分，如乳 、肝、蛋类、肾、血和肌肉中，其中以乳最为常见。
为了开发一种简单、快速、灵敏、准确的分析方法, VICAM(维康)公司与哈佛大学、麻省理工学院、约翰－霍普金斯大学、AOAC、
料，中药等产品中；黄曲霉毒素M1是动物摄入 FDA、FGIS、 农业部等著名大学和政府机构通力合作，发明研制了一系列以单克隆免疫亲和柱为分离手段，用荧光计、紫外灯作为

胆毒鱼类
鱼类毒素简介
中毒原因：胆汁中含有组胺、胆盐 及氧化物。
鱼胆中毒主要是胆汁毒素严重损伤 肝、肾，造成肝脏变性坏死和肾小 管损害。脑细胞、心血管与神经系 统亦有改变。
肝毒鱼类
鱼类毒素简介
原因：维生素A中毒。
症状：初期为胃肠道症状，以后有 皮肤症状，如鳞状脱皮，自口唇周 围及鼻部开始，逐渐蔓及四肢和躯 干，重者毛发脱落。此外，还有结 膜充血、剧烈头痛等症状。
（此时味最美）
河豚毒素的毒性
（1）机制：抑制神经细胞膜的Na+离子 通道，阻断神经冲动的传导，使肌肉麻痹。
（2）潜伏期：10min~3h，一般为 30~60min。
唇、舌、手指逐渐变得麻痹，进而加重， 恶心、呕吐；随后说话困难，运动失调， 血压、体温下降；最后呼吸衰竭而死。
二.河豚毒素的毒性
广泛分布于热带、亚热带海区 2.外形：
身体浑圆，头胸部大，腹尾部小，背上有鲜艳的斑纹 或色彩，体表无鳞，口腔内有明显的2对门牙。
河豚鱼
身体浑圆，头胸 部大，腹尾部小
河豚毒素的分布
（1）毒素浓度由高到低依次为： 卵巢、鱼卵、肝脏、肾脏、眼睛、皮肤、
血液，肌肉中含量低。
（2）河豚毒素含量依季节而变： 春夏季：毒性最强 冬季：卵巢、鱼卵中毒素浓度最高
第二节 真菌毒素及其检测方法
真菌毒素概述
由真菌产生的具有毒性的次生代谢产物，广泛污染农 作物、食品及饲料等植物性产品。
已发现300种真菌毒素，具有代表性的有黄曲霉毒素， 赫曲霉毒素A，玉米赤霉烯酮、麦角生物碱等。
真菌毒素中毒症及其特点
定义
人、畜禽食用被真菌毒素污染的食品或饲料 后发生的中毒现象，称真菌毒素中毒症，包括肝 脏毒性、肾脏毒性、神经毒性等。