v1.0可编辑可修改实验七杀菌剂生物活性测定方法——抑菌圈法
一、实验目的
学习并掌握杀菌剂的离体活性测定方法——抑菌圈法。
二、实验原理
抑菌圈法即水平扩散法基本原理是在已接种供试菌的琼脂培养基上施以少量抗菌性物质或杀菌剂，使之接触培养基和病菌，经定温培养一定时间后，因药剂的渗透扩散作用，施药部位周围因杀死了病菌而抑
制了其在培养基上的生长，从而产生了抑菌圈。在一定范围内，抑菌圈直径的平方或面积与药剂浓度的对
数呈直线函数关系，从而可比较供试样品杀菌活性大小。其最大优点是精确度高，操作简单，能较快得出
结果。但测定结果受药剂溶解性和扩散能力影响很大，具一定局限性。根据药剂施加在琼脂培养基表面方
式不同，又分为管碟法（牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法、滴下法等，其中以管碟法和滤纸片法应用最广。
三、实验材料
供试药剂：速克灵或扑海因。供试病原菌：番茄灰霉病菌。
实验器材：无菌水、无菌接种针、灭菌三角瓶、玻璃珠、灭菌双层纱布、75%酒精棉球、消毒摄子、移液管、试剂瓶、吸耳球、超净工作台、胶头滴管、尺子。
四、实验方法
采用管碟法。将供试药剂加于放置在琼脂培养基表面的用不锈钢制成的小圆筒（又称为牛津杯，一般
为外径 8 mm，内径 6 mm，高 10 mm）内，定温培养一定时间后测量抑菌圈大小。
1．配制药液：用灭菌蒸馏水将供试药剂配成一系列梯度浓度，一般5-7 个浓度。灭菌蒸馏水为对照。
2．制备一定“浓度”的供试菌悬浮液：如真菌，则宜用孢子悬浮液。在培养好的菌种上倒入10 mL 灭菌水，用接种针轻轻刮动平面孢子悬浮，倾于灭菌三角瓶内（事先装数粒玻璃珠）摇动 5 min ，将孢子悬浮液用灭菌双层纱布过滤入另一灭菌三角瓶内。用低倍（15× 20 倍）显微镜检查，调节孢子浓度，每视野
80-100 个孢子为宜；以上操作应在无菌条件下进行，动作要迅速准确。
3．浇制双层培养基：将装在试管内已灭菌的清水琼脂培养基10 mL溶化后，趁热倒入9 cm直径培养皿中，
水平冷凝。将适合供试菌生长发育的100 mL培养基熔化后冷至45-50 ℃左右后，迅速吸取10 mL菌液加入培养基中，充分混匀后，立即吸取 5 mL 带菌培养基加在已凝固的清水琼脂培养基上，并使之均匀地铺在
底层上。
4．注药用消毒镊子夹取不锈钢小管（即牛津杯，外径8.0mm、内径 6.0mm、高 10mm），每皿内按合适的间隔放置 6 个不锈钢小管，其中 1 个小管为对照，其余 5 管为 5 种不同浓度的药液（药液加至在管口形成
凸面），在适合的温度下培养。
6．结果检查培养一定时间后，取出用十字交叉法测量抑菌圈直径，并以抑菌圈的有无及抑菌圈大小评价
杀菌活性。若抑菌圈直径呈椭圆形，长短之差超过一个单位，最好舍去不要。
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八宝景天抑菌活性实验方案 1 材料与仪器 1.1 材料 八宝景天（茎、叶、花），采摘于吉林农业大学校园，去离子水洗净，阴干，经粉碎机粉碎(过40～60 目筛)，所得植物粉用密封袋于遮光处保存备用。 1.2 微生物 真菌：黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、黄瓜黑星病菌（Cladosporium cucumerinum）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum nigrum）由吉林省蔬菜花卉科学研究院提供。番茄叶霉病菌( Fulvia fulva )、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、甜瓜茎腐病菌(Fusarium gramimearum)、水稻立枯病菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黄瓜菌核病菌(Sclerotinia sclerrotium) 均由吉林农业大学农学院植物病理研究室提供。 1.3 试剂与仪器 95%乙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司 葡萄糖分析纯国药集团化学试剂有限公司 琼脂粉生化试剂天津科密欧化学试剂有限公司 马铃薯 JFSD-100粉碎机上海淀久中药机械制造有限公司 JJ200型精密电子天平美国双杰兄弟有限公司常熟双杰测试仪器厂HH-S数显恒温水浴锅江苏省金坛市医疗仪器厂 RE-2000旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂 SHZ-III型循环水真空泵上海亚荣生化仪器厂 TDL-5A低速大容量离心机上海悦丰仪器仪表有限公司 生化培养箱SPX-250型上海跃进医疗器械厂 ZKF035电热真空干燥箱上海实验仪器厂有限公司 KQ5200B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司 不锈钢手提式灭菌器上海申安医疗器械厂 超净工作台上海生物科技有限公司
农药生物测定复习题 名词解释 农药生物测定：是指运用特定的试验设计，利用生物的整体或离体的组织、细胞对农药（或某些化合物）的反应，并以生物统计为工具，分析供试对象在一定条件下的效应，来度量（判断或鉴别）某种农药的生物活性。 负温度系数的杀虫剂：在一定温度范围内，杀虫剂的毒效随温度的降低而升高，称为负温度系数的杀虫剂。如溴氰菊酯对伊蚊幼虫的毒力在10℃时比30℃时大7倍。 正温度系数的杀虫剂：在一定温度范围内，杀虫活性随温度升高而增强。如敌百虫。 标准目标昆虫：指被普遍采用的、具有一定代表性和经济意义以及抗药力稳定均匀的农药杀虫毒力和毒效指示试虫群体。 杀虫剂内吸毒力：药剂可通过植物根、茎、叶等部位吸收到植株内部，随着植物体液输导，当害虫取食植物或刺吸汁液时，药剂进入虫体并将之杀死。 熏蒸毒力：在适当气温下，利用有毒气体、液体或固体挥发产生的蒸气来毒杀害虫（或病菌）。熏蒸毒力测定：测定杀虫剂从昆虫气孔或气门进入呼吸系统而引起试虫中毒致死的熏杀毒力。化学保护：用药剂处理植物和植物环境，在病菌侵入寄主植物前发挥药效，保护植物不受病菌侵染的措施。 化学治疗：在病原菌侵入植物之后使用杀菌剂消灭病菌，使植物不再发病。将药剂内吸到植物内部起作用。 化学免疫：植物通过药剂的作用，使植物具有对病菌的抵抗能力，避免或减轻病菌的侵害。杀菌剂的离体活性测定：只包括病原菌和药剂而不包括寄主或寄主植物的培养皿内测定方法，通常根据病菌与药剂接触后的反应，如孢子不萌发、不长菌丝等来作为毒力评判的标准。 杀菌剂的活体活性测定：包括病原菌、药剂和寄主植物在内的活性测定，通常以寄主植物的发病情况（普遍程度、严重程度）来评判药剂的毒力。 致死中量(LD50)(medium lethal dosage)：指杀死供试昆虫群体内50%的个体所需要的药剂剂量。指一定条件下，可致供试生物半数死亡机会的药剂剂量，表示单位：mg/kg、μg/g或μg/头。 致死中浓度(LC50)(medium lathal concentration)：指杀死供试昆虫群体内50%的个体所需要的药剂浓度。 校正死亡率：采用Abbort(1975)校正死亡率公式，以去除自然死亡对结果的影响。校正死亡率（%）=（处理组死亡率—对照组死亡率）/（1—对照组死亡率）
v1.0 可编辑可修改 1 实验七杀菌剂生物活性测定方法——抑菌圈法 一、实验目的 学习并掌握杀菌剂的离体活性测定方法——抑菌圈法。 二、实验原理 抑菌圈法即水平扩散法基本原理是在已接种供试菌的琼脂培养基上施以少量抗菌性物质或杀菌剂，使之接触培养基和病菌，经定温培养一定时间后，因药剂的渗透扩散作用，施药部位周围因杀死了病菌而抑制了其在培养基上的生长，从而产生了抑菌圈。在一定范围内，抑菌圈直径的平方或面积与药剂浓度的对数呈直线函数关系，从而可比较供试样品杀菌活性大小。其最大优点是精确度高，操作简单，能较快得出结果。但测定结果受药剂溶解性和扩散能力影响很大，具一定局限性。根据药剂施加在琼脂培养基表面方式不同，又分为管碟法（牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法、滴下法等，其中以管碟法和滤纸片法应用最广。 三、实验材料 供试药剂：速克灵或扑海因。供试病原菌：番茄灰霉病菌。 实验器材：无菌水、无菌接种针、灭菌三角瓶、玻璃珠、灭菌双层纱布、75%酒精棉球、消毒摄子、移液管、试剂瓶、吸耳球、超净工作台、胶头滴管、尺子。 四、实验方法 采用管碟法。将供试药剂加于放置在琼脂培养基表面的用不锈钢制成的小圆筒（又称为牛津杯，一般为外径8 mm，内径6 mm，高10 mm）内，定温培养一定时间后测量抑菌圈大小。 1．配制药液：用灭菌蒸馏水将供试药剂配成一系列梯度浓度，一般5-7个浓度。灭菌蒸馏水为对照。2．制备一定“浓度”的供试菌悬浮液：如真菌，则宜用孢子悬浮液。在培养好的菌种上倒入10 mL灭菌水，用接种针轻轻刮动平面孢子悬浮，倾于灭菌三角瓶内（事先装数粒玻璃珠）摇动5 min，将孢子悬浮液用灭菌双层纱布过滤入另一灭菌三角瓶内。用低倍（15×20倍）显微镜检查，调节孢子浓度，每视野80-100个孢子为宜；以上操作应在无菌条件下进行，动作要迅速准确。 3．浇制双层培养基：将装在试管内已灭菌的清水琼脂培养基10 mL溶化后，趁热倒入9 cm直径培养皿中，水平冷凝。将适合供试菌生长发育的100 mL培养基熔化后冷至45-50℃左右后，迅速吸取10 mL菌液加入培养基中，充分混匀后，立即吸取5 mL带菌培养基加在已凝固的清水琼脂培养基上，并使之均匀地铺在底层上。 4．注药用消毒镊子夹取不锈钢小管（即牛津杯，外径8.0mm、内径6.0mm、高10mm），每皿内按合适的间隔放置6个不锈钢小管，其中1个小管为对照，其余5管为5种不同浓度的药液（药液加至在管口形成凸面），在适合的温度下培养。 6．结果检查培养一定时间后，取出用十字交叉法测量抑菌圈直径，并以抑菌圈的有无及抑菌圈大小评价杀菌活性。若抑菌圈直径呈椭圆形，长短之差超过一个单位，最好舍去不要。
农药生物测定复习题 名词讲明 农药生物测定：是指运用特定的试验设计，利用生物的整体或离体的组织、细胞对农药（或某些化合物）的反应，并以生物统计为工具，分析供试对象在一定条件下的效应，来度量（判定或鉴不）某种农药的生物活性。 负温度系数的杀虫剂：在一定温度范畴内，杀虫剂的毒效随温度的降低而升高，称为负温度系数的杀虫剂。如溴氰菊酯对伊蚊幼虫的毒力在10℃时比30℃时大7倍。 正温度系数的杀虫剂：在一定温度范畴内，杀虫活性随温度升高而增强。如敌百虫。 标准目标昆虫：指被普遍采纳的、具有一定代表性和经济意义以及抗药力稳固平均的农药杀虫毒力和毒效指示试虫群体。 杀虫剂内吸毒力：药剂可通过植物根、茎、叶等部位吸取到植株内部，随着植物体液输导，当害虫取食植物或刺吸汁液时，药剂进入虫体并将之杀死。 熏蒸毒力：在适当气温下，利用有毒气体、液体或固体挥发产生的蒸气来毒杀害虫（或病菌）。熏蒸毒力测定：测定杀虫剂从昆虫气孔或气门进入呼吸系统而引起试虫中毒致死的熏杀毒力。化学爱护：用药剂处理植物和植物环境，在病菌侵入寄主植物前发挥药效，爱护植物不受病菌侵染的措施。 化学治疗：在病原菌侵入植物之后使用杀菌剂消灭病菌，使植物不再发病。将药剂内吸到植物内部起作用。 化学免疫：植物通过药剂的作用，使植物具有对病菌的抗击能力，幸免或减轻病菌的侵害。杀菌剂的离体活性测定：只包括病原菌和药剂而不包括寄主或寄主植物的培养皿内测定方法，通常依照病菌与药剂接触后的反应，如孢子不萌发、不长菌丝等来作为毒力评判的标准。 杀菌剂的活体活性测定：包括病原菌、药剂和寄主植物在内的活性测定，通常以寄主植物的发病情形（普遍程度、严峻程度）来评判药剂的毒力。 致死中量(LD50)(medium lethal dosage)：指杀死供试昆虫群体内50%的个体所需要的药剂剂量。指一定条件下，可致供试生物半数死亡机会的药剂剂量，表示单位：mg/kg、μg/g或μg/头。 致死中浓度(LC50)(medium lathal concentration)：指杀死供试昆虫群体内50%的个体所需要的药剂浓度。 校正死亡率：采纳Abbort(1975)校正死亡率公式，以去除自然死亡对结果的阻碍。校正死亡率（%）=（处理组死亡率—对比组死亡率）/（1—对比组死亡率）
常见的微生物检测 方法
摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同
时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：
琼脂打孔法（琼脂打孔抑菌圈实验） 一、试验原理 利用抑菌剂不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用。试验通过抑菌圈大小以判断其是否具有抑菌能力。本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的鉴定。 二、试验器材、化学试剂及菌种 培养皿、试管、5uL～50uL 微量移液器，100uL～1000uL微量移液器以及配套的枪头、10mL离心管、游标卡尺、涂布棒、麦氏比浊管、电动混合器、水浴锅、超净工作台、高压灭菌锅、鼓风干燥箱、生化培养箱、电热炉营养琼脂培养基、PBS缓冲液、无菌水、95%乙醇。 菌种：溶血性链球菌、溶血性葡萄球菌、李斯特菌、结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、吸附性绿脓杆菌、大肠杆菌 三、试验步骤 1、实验工器具准备及灭菌 在锥形瓶中配置营养琼脂培养基，用电热炉加热煮沸至澄清状态，盖好塞子，同PBS 缓冲液、无菌水、配套枪头、涂布棒、离心管一同放入高压灭菌锅中灭菌，121℃杀菌25min。将培养皿用牛皮纸包好和试管一起放入鼓风干燥箱中灭菌，170℃杀菌2h。实验前超净工作台及操作室使用前需用紫外灯杀菌30min以上。 2、倒培养皿 将培养基及培养皿放置到60℃后开始倒培养皿，培养基使用前摇匀，每个培养皿倒15～20mL左右，倒好后水平静置至完全凝固。 3、菌悬液的制备 从冰箱取出需要测试的菌种活化0.5h 后，加入5mL 的PBS缓冲液将斜面上，在手掌上轻轻振打80次，使菌株完全冲下，倒入试管中轻轻摇匀。吸取1mL 的菌液加入到4mL 的PBS缓冲液中，再吸取1mL稀释的菌悬液依次进行5倍梯度稀释，选择108CFU/mL左右的菌
悬液或106CFU/mL左右的孢子悬浮液（对比0.5麦氏比浊管），将选好的菌悬液十倍系列稀释后选第二支试管（即浓度约为106/CFU/mL左右的菌悬液或104CFU/mL左右的孢子悬浮液）进行试验。 4、试验菌的接种 用移液枪吸取浓度为 106cfu/mL 试验菌悬液0.1mL ，将其接种到已经倒好的营养琼脂培养皿内，用涂布棒涂布均匀（注意涂布棒每次使用后在酒精灯下灭菌，涂布时动作轻不要刮破培养基），盖好培养皿。 5、抑菌剂的配置 用分析天平准确称量1g样品于灭菌后的15mL离心管内，加入10mL溶剂（无菌纯水、95%乙醇等），摇匀使溶解（根据情况可使用电动混合器摇匀或放入水浴锅中加热使溶解）。溶解后吸取上清液对倍稀释样品，可根据情况决定稀释几次，一般稀释6～10次。若样品是液体，可直接对倍稀释。 6、添加抑菌剂 6.1在培养皿上打三个孔，用10～100uL的枪头打孔，打完孔用无菌针头将琼脂孔中的培养基挑出（打孔时一次打孔，不能转动枪头，以防琼脂圈裂缝，影响药液扩散以致抑菌圈不均匀，每次无菌针头挑完后都要酒精灯烧一下灭菌）。各孔中心之间相距 25mm以上，与培养皿的周缘相距 15mm 以上。用微量移液器吸取抑菌剂20uL 到琼脂孔内（三个孔为一组），盖好培养皿。 6.2 用不加抑菌剂的培养皿、加入配抑菌剂时的溶剂做阳性对照，用未接种菌的培养皿做阴性对照。 7、培养培养皿并观察抑菌效果 于37℃生化培养箱中正置培养，培养16h～18h 观察结果。用游标卡尺测量抑菌圈的直径并记录。注：每个培养皿做一个浓度，测量抑菌圈时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌圈进行。测量其直径应以抑菌圈外沿为界。 四、试验结果 各浓度抑菌剂抑菌圈直径（mm）
微生物细胞大小测定 一、实验目的 了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和使用原理，掌握微生物细胞大小的测定方法。 二、实验原理 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下来测量。 用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。 目镜测微尺（图-1 ）是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50 等分，或把10 mm长度刻成 100 等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上( 此处正好与物镜放大的中间像重叠) 来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际 表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正， 以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小方格所代表的相对长度。 镜台测微尺（图20-2 ）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm 等分为 100 格，每格长 l0 μ m（即 0.0lmm ），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上， 图 1 目镜测微尺图2镜台测微尺 由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野， 镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真 实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺 每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大 倍数下测量微生物大小。 即 三、实验器材 1．活材料：酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae) 、枯草杆菌(Baccillus subtilis) 染色标本片。 2．器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、擦镜纸。 四、实验方法 1．目镜测微尺的校正把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板 上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微 尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再 使两尺的“ 0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度 之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长l0 μ m，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。
利用吸附法测定壳聚糖无纺布抑菌性能试验方案 一、实验原理：本实验参考了国标GB/T20944方法，根据我们的材料特性进行了微调。即：选取革兰氏阴性菌（大肠杆菌（25922））和革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌（25923））两类代表性指示微生物。将测试材料浸泡在活化好的菌悬液（浓度控制为107CFU/ml）中，设置不同处理时间，稀释涂布，平板单菌落计数，计算无纺布材料的抑菌性能。 二、实验方法： 2.1试验菌种的活化 1）冻干粉接种至大豆蛋白肉汤(TSB)培养基，37℃培养24h。一部分用于抑菌试验，另一部分用于划线接种至斜面或平皿冷藏保藏（可保藏1个月）。 2）培养液稀释。活化好的菌悬液用稀释液稀释20倍，取1ml培养液添加到19ml稀释液（应提前灭菌）中。 3）式样预处理。大小合适的试样饱和吸水，灭菌处理。（周教授负责） 4）菌悬液洗涤。将稀释好的菌悬液转移到试样中，分别震荡15min 和30min，为防止微生物传代，影响试验结果，立即放入冰箱冷藏。 5）洗涤液梯度稀释。处理后的洗涤液立即梯度稀释到10-1, 10-2,10-3,10-4和10-5。具体方法：取1ml洗涤原液加入9ml稀释液此时为10-1梯度；取1ml稀释后的10-1菌液加入到9ml稀释液，此时为
10-2梯度；······。 6）涂布。分别取10-3,10-4和10-5的稀释液200ul涂布到平板（计数培养基，简称EA），每个处理做2个平行，37℃，培养24-48h，计数。 7）抑菌效果评价。参照GB/T20944。 三、试验简易流程 注：如果活化后的菌液浓度较高，可取10-4、10-5和10-6梯度稀释液涂布。
抑菌圈实验说明 抑菌圈法是衡量杀菌防霉剂效果的一种方式，主要用于测定杀菌防霉剂对细菌、霉菌、酵母菌的抑菌作用，是定性或半定量的方法。通过杀菌防霉剂在琼脂平板上的扩散能力来初步筛选更有效的杀菌防霉剂品种。 用具和材料 霉菌培养皿，无菌吸管（或针筒），圆片滤纸（直径2cm），带玻璃珠的无菌水，带过滤漏斗的三角牌，镊子，接种针（环），熔化状态的琼脂培养基（最好保温于45℃左右水浴中），一定浓度的药剂，供试验用的菌种。 试验过程 1.用接种环挑取各试管斜面的菌种于带玻璃珠的无菌水中，用手振荡数分钟使孢子分散， 过滤后制成混合孢子悬液。 2.用无菌吸管（或针筒）向各培养皿中注入一定浓度的混合孢子悬浮液0.5mL。 3.向各培养皿内注入15Ml~20ml的熔化状琼脂培养基（约45℃），将菌液与培养基混合均 匀，待其冷却。 4.用镊子将圆片滤纸在不同浓度的防霉剂中浸渍片刻，取出置于带菌培养基平板的中央， 盖上盖子 5.置适宜温度下，培养2~3d，观察滤纸片圆片周围抑菌圈的有无及大小。 注意事项 1.所有的操作用具和材料都要事先做灭菌处理，操作必须在无菌室（或无菌箱）内于火焰 旁进行。 2.霉菌、细菌、酵母菌等各种微生物都必须分别配置混合菌液，即这里指的混合菌液是霉 菌或酵母菌等诸种菌的分别混合液，并非霉菌、细菌和酵母菌的混合液。 3.混合菌液的浓度一般为106~108cfu/mL. 4.倒入培养皿的琼脂培养基温度不能太高（一般为45℃左右），否则会引起微生物死亡。 也不能太低，因为琼脂会很快凝结，以致搅拌不均匀，影响试验结果。 5.各种微生物的最适生长温度不同（例如霉菌一般为25~30℃，细菌一般为32~37℃等）， 恒温培养时宜分开放置。 结果评判 由于滤纸圆片所吸附的药液慢慢向四周扩散，因此在滤纸片的周围就出现清晰的抑菌圈（加入该防霉剂对供试菌有抑制效果）。抑菌圈的大小代表药剂抗菌力的高低。在一定的药剂浓度范围内，药剂的浓度越高则抑菌圈的直径越大。此法同样适合于测定单个菌的抗菌效果。
生物量测定方法1树木生物量测定方法 1.1树木生物量的组成 一木树的生物量可以分为地下及地上两部分，地下部分是指树根系的生物量（WR）；地上部分主要包括树干生物量（WS）、枝生物量（WB）和叶生物量（WL）。在生物量的测定中，除称量各部分生物量的干重量外，有时还要计算它们占全树总生物量干重的百分数，此百分数称为分配比。树干占地上部分的分配比最大（一般为65～70%），而枝叶部分的分配比约各占15%左右。 与材积测定相比，生物量测定的对象更为复杂，测定的部分也多，因而使得生物量的测定工作即复杂又困难。但是树木生物量与树木胸径、树高等测树因子之间也有着密切的关系，这些关系也为树木生物量测定提供了依据。在树木生物量测定中，树冠量的大小与形状对枝、叶量的多少有着显著的影响，因此，在实际工作中，要研究反映冠形和冠量的因子，常用的因子有冠长率、树冠圆满度、树冠投影比等因子，这些因子的意义如下： ⑴冠长率是冠长与树高之比 ⑵树冠圆满度是冠幅与冠长之比。用以表明树冠的圆满程度，此值愈大愈圆满，反之而树冠狭长。 ⑶树冠投影比是冠幅与胸径之比。用以表明树木营养面积的相对大小，此值愈大则树木占有的相对空间愈大。 上述这些因子在枝叶生物量测定、估计及分析比较中起着较大的辅助作用。而且，这些因子与胸径、树高等测树因子之间有着密切的相关关系，这为利用测树因子直接估测树木生物量提供了依据。 1.2树木生物量鲜重和干重的测定 树体在自然状态下含水时的重量称为鲜重，它是砍伐后立即称量的重量。干燥后去掉结晶水的重量称为干重。在外业中只能测得树木的鲜重，然后采用各种方法将鲜重换算为干重，最常用的换算方法是计算树木的干重比（），即， 而（11-8） 式中可用取样测定获得。 （1）树干干重的测定方法 ①木材密度法
v1.0可编辑可修改实验七杀菌剂生物活性测定方法——抑菌圈法 一、实验目的 学习并掌握杀菌剂的离体活性测定方法——抑菌圈法。 二、实验原理 抑菌圈法即水平扩散法基本原理是在已接种供试菌的琼脂培养基上施以少量抗菌性物质或杀菌剂，使之接触培养基和病菌，经定温培养一定时间后，因药剂的渗透扩散作用，施药部位周围因杀死了病菌而抑 制了其在培养基上的生长，从而产生了抑菌圈。在一定范围内，抑菌圈直径的平方或面积与药剂浓度的对 数呈直线函数关系，从而可比较供试样品杀菌活性大小。其最大优点是精确度高，操作简单，能较快得出 结果。但测定结果受药剂溶解性和扩散能力影响很大，具一定局限性。根据药剂施加在琼脂培养基表面方 式不同，又分为管碟法（牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法、滴下法等，其中以管碟法和滤纸片法应用最广。 三、实验材料 供试药剂：速克灵或扑海因。供试病原菌：番茄灰霉病菌。 实验器材：无菌水、无菌接种针、灭菌三角瓶、玻璃珠、灭菌双层纱布、75%酒精棉球、消毒摄子、移液管、试剂瓶、吸耳球、超净工作台、胶头滴管、尺子。 四、实验方法 采用管碟法。将供试药剂加于放置在琼脂培养基表面的用不锈钢制成的小圆筒（又称为牛津杯，一般 为外径 8 mm，内径 6 mm，高 10 mm）内，定温培养一定时间后测量抑菌圈大小。 1．配制药液：用灭菌蒸馏水将供试药剂配成一系列梯度浓度，一般5-7 个浓度。灭菌蒸馏水为对照。 2．制备一定“浓度”的供试菌悬浮液：如真菌，则宜用孢子悬浮液。在培养好的菌种上倒入10 mL 灭菌水，用接种针轻轻刮动平面孢子悬浮，倾于灭菌三角瓶内（事先装数粒玻璃珠）摇动 5 min ，将孢子悬浮液用灭菌双层纱布过滤入另一灭菌三角瓶内。用低倍（15× 20 倍）显微镜检查，调节孢子浓度，每视野 80-100 个孢子为宜；以上操作应在无菌条件下进行，动作要迅速准确。 3．浇制双层培养基：将装在试管内已灭菌的清水琼脂培养基10 mL溶化后，趁热倒入9 cm直径培养皿中， 水平冷凝。将适合供试菌生长发育的100 mL培养基熔化后冷至45-50 ℃左右后，迅速吸取10 mL菌液加入培养基中，充分混匀后，立即吸取 5 mL 带菌培养基加在已凝固的清水琼脂培养基上，并使之均匀地铺在 底层上。 4．注药用消毒镊子夹取不锈钢小管（即牛津杯，外径8.0mm、内径 6.0mm、高 10mm），每皿内按合适的间隔放置 6 个不锈钢小管，其中 1 个小管为对照，其余 5 管为 5 种不同浓度的药液（药液加至在管口形成 凸面），在适合的温度下培养。 6．结果检查培养一定时间后，取出用十字交叉法测量抑菌圈直径，并以抑菌圈的有无及抑菌圈大小评价 杀菌活性。若抑菌圈直径呈椭圆形，长短之差超过一个单位，最好舍去不要。 1
微生物自主实验 常见抑菌食品的抑菌效果探究 姓名： 学号： 组别： 同组人员： 实验日期：
摘要：本实验对日常生活中常见的抑菌食品大蒜、生姜、洋葱、和辣椒的抑菌效果进行了研究，利用平板涂布菌种（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌），再铺上沾有不同食物汁液的滤纸片，恒温培养后通过测定抑菌圈的大小探究四种物质对三种菌的抑菌效果。 一、实验背景 我们平常食用的一些食物具有一定的抑菌作用，本实验选用的抑菌食品有：大蒜、生姜、洋葱和辣椒。 1、大蒜：大蒜中的蒜素具有抑菌和杀菌作用，是目前所知的最好天然广谱抗菌食品。常吃大蒜可防治流感、细菌性痢疾、脑炎、大叶性肺炎、伤寒等传染病。大蒜制膏涂抹外伤局部，能防治感染且加速伤口愈合。 2、生姜：生姜中含有萜类化合物,如姜油醇、姜油酮、龙脑柠檬醛等,它们都具有较强的杀菌作用。 3、洋葱：洋葱中含有植物杀菌素如大蒜素等，因而有很强的杀菌能力。嚼生洋葱可以预防感冒。 4、辣椒：辣椒中含有辣椒素，它是使辣椒呈现辣味的物质，有关研究表明辣椒素具有一定的抑菌作用。 二、实验目的 通过所学的微生物实验技能，简单探讨和检测几种常见抑菌食品的抑菌、杀菌效果。 三、实验材料 1.菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。 2.培养基：1000ml牛肉膏蛋白胨固体培养基(牛肉膏 3.0g , 蛋白胨 10.0g, NaCl 5.0g, 琼脂20g, 水1000mL, pH7.4-7.6 ) 100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基(牛肉膏0.3g, 蛋白胨1g, NaCl 0.5g ,水100mL, pH7.4-7.6)。 3.抑菌食品：大蒜、生姜、洋葱、辣椒。 4.仪器及用具：电子秤、烧杯、电磁炉、三角瓶、无菌水、涂布器、纱布、滤菌膜、注射器、无菌培养皿（12个）、酒精灯、移液枪、枪头、圆滤纸片、镊子、37℃、离心管（5mL）、恒温摇床，恒温培养箱等。
土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态,可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、Ｃ／Ｎ、土壤呼吸强度与纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标: 1、土壤微生物量(Ｍiｅｒoｂia lBiomａｓｓ,MＢ) 能代表参与调控土壤能量与养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量,一般指土壤中体积小于５Χ１０3um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前,熏蒸法就是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎,它就是将待测土壤经药剂熏蒸后,土壤中微生物被杀死,被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CＯ2,根据释放出的CO２:的量与微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外,还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大,不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等,均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤: (1)土壤前处理与熏蒸 (2)提取 将熏蒸土壤无损地转移到２０0mL聚乙烯塑料瓶中,加入１00mＬ0、5mol·L－１K2SO4(图水比为１:4;w:v),振荡3０ｍiｎ(3０0ｒｅv·min-1),用中速定量滤纸过滤于12５mL 塑料瓶中。熏蒸开始的同时,另称取等量的3份土壤于20０ｍL聚乙烯塑料瓶中,直接加入100mｌL0、5mol·L-1Ｋ2ＳO４提取;另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 (3)测定 吸取10ｍL上述土壤提取液于150mL消化管(24mmх295mｍ)中,准确加入10mL0、018 mｏｌ·L－1K2Cｒ２O7—12ｍol·L－1H2SＯ4溶液,加入2～３玻璃珠或瓷片,混匀后置于１75±1℃磷酸浴中煮沸１０min(放入消化管前,磷酸浴温度应调至１７9℃,放入后温度恰好为１７5℃)。冷却后无损地转移至１5０mL三角瓶中,用去离子水洗涤消化管３~5次使溶液体积约为80mL,加入一滴邻菲罗啉指示剂,用０、05mol·L-1硫酸亚铁标准溶液滴定,溶液颜色由橙黄色变为蓝色,再变为红棕色,即为滴定终点。 (４)结果计算
抑菌试验操作规程 1．范围 本规程适用于所有益生菌抑菌活性的测定。 2．试验前准备 设备及器材：高温蒸汽灭菌锅，超净工作台，酒精灯，恒温摇床，恒温水浴锅，恒温培养箱，平皿（直径9cm），牛津杯（内径6mm，外径8mm，高10mm），移液管（10ml），微量移液器及吸头（1ml、200ul）。 3．操作步骤 3.1 病原菌的制备 3.1.1 病原菌：鸡致病性大肠杆菌，鸡致病性大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。 3.1.2病原菌扩培：在超净工作台内，挑取一环病原菌接种于100 ml无菌的营养肉汤培养基中，接种完毕，将三角瓶臵于摇床内固定，37℃，200 rpm，培养8~12h，即为扩培好的病原菌悬液。 3.2 检测样品的制备 3.2.1 乳酸菌扩培：在超净工作台内，用5ml无菌生理盐水洗下菌苔，按1%的接种量，接种于一定体积的适宜培养基中，接种完毕，将三角瓶臵于恒温培养箱内，37℃静臵培养24~48h，即为扩培好的乳酸菌菌悬液。 3.2.2 芽孢杆菌扩培：在超净工作台内，用5ml无菌生理盐水洗下菌苔，按1%的接种量，接种于一定体积的适宜培养基中，接种完毕，将三角瓶臵于恒温摇床内固定，在适宜条件下培养14~18h，即为扩培好的芽孢杆菌菌悬液。 3.2.3 无细胞发酵上清液的制备：在超净工作台内，吸取扩培好的乳酸菌（或芽孢杆菌）菌悬液10ml，移入到无菌的50ml离心管中，旋紧离心管盖，于8000 rpm/min，离心15min，离心结束后，于超净工作台中，吸取5ml上清液，用孔径为0.22μm的无菌滤器过滤，即为无细胞发酵上清液。 3.3 双层平板的制备 3.3.1 制备琼脂含量为2.0%的MH肉汤培养基，冷却至60℃左右，用无菌吸管准确量取10ml该培养基，加入到水平放臵的无菌平皿中，洁净工作台中晾干；3.3.2 用无菌镊子取6个事先灭过菌的牛津杯均匀放在上述倒有琼脂的平皿中，
生物量测定方法 1树木生物量测定方法 1.1树木生物量的组成 一木树的生物量可以分为地下及地上两部分，地下部分是指树根系的生物量（WR）；地上部分主要包括树干生物量（WS）、枝生物量（WB）和叶生物量（WL）。在生物量的测定中，除称量各部分生物量的干重量外，有时还要计算它们占全树总生物量干重的百分数，此百分数称为分配比。树干占地上部分的分配比最大（一般为65～70%），而枝叶部分的分配比约各占15%左右。 与材积测定相比，生物量测定的对象更为复杂，测定的部分也多，因而使得生物量的测定工作即复杂又困难。但是树木生物量与树木胸径、树高等测树因子之间也有着密切的关系，这些关系也为树木生物量测定提供了依据。在树木生物量测定中，树冠量的大小与形状对枝、叶量的多少有着显著的影响，因此，在实际工作中，要研究反映冠形和冠量的因子，常用的因子有冠长率、树冠圆满度、树冠投影比等因子，这些因子的意义如下： ⑴冠长率是冠长与树高之比 ⑵树冠圆满度是冠幅与冠长之比。用以表明树冠的圆满程度，此值愈大愈圆满，反之而树冠狭长。 ⑶树冠投影比是冠幅与胸径之比。用以表明树木营养面积的相对大小，此值愈大则树木占有的相对空间愈大。 上述这些因子在枝叶生物量测定、估计及分析比较中起着较大的辅助作用。而且，这些因子与胸径、树高等测树因子之间有着密切的相关关系，这为利用测树因子直接估测树木生物量提供了依据。 1.2树木生物量鲜重和干重的测定 树体在自然状态下含水时的重量称为鲜重，它是砍伐后立即称量的重量。干燥后去掉结晶水的重量称为干重。在外业中只能测得树木的鲜重，然后采用各种方法将鲜重换算为干重，最常用的换算方法是计算树木的干重比（），即， 而（11-8） 式中可用取样测定获得。 （1）树干干重的测定方法 ①木材密度法
杀菌剂开发中的室内生物测定 杨晓凡1,吴祥为2,黄德智2,花日茂2 (1.安徽工程科技学院,安徽芜湖241000;2.安徽农业大学资源与环境学院,安徽合肥230036) 摘要 针对杀菌剂开发中的室内生物测定,探讨了活体和离体的相互关系,生物测定类型的选择问题,同时从多角度阐述了杀菌剂生物测定的创新途径。 关键词 杀菌剂开发;生物测定 中图分类号 S482.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2006)01-0087-02 Summ ary of Bioassay in the P rocess of Discovering and Developing N ew Fungicide YANG X iao2fan et al (Anhui University of T echn ology and Science,W uhu,Anhui241000) Abstract Bioassay plays an im portant role during the process of discovering and developing new classes of fungicides.In this paper,traditional fungicidal bioassay was summ arized.In addition,the fungicidal bioassay selection and its inn ovation way were als o elab orated as tw o focal points.And the research herein was provided as the useful reference for fungicides discovery in China. K ey w ords Fungicides;Bioassay 在农用杀菌剂研发过程中,药剂、病原菌和寄主及其相互影响始终是关注的重点,而室内生物测定是联系三者的纽带之一。杀菌剂在其早期的开发中,无论是初筛还是复筛,都必须不断地对化合物进行生物测定,从而确定研究的效果及下一步的筛选方向。 1 传统的生物测定 1.1 活体和离体 在目前杀菌剂的研究、开发中,应用最普遍的是离体(In vitro)和活体(In viv o)两大传统室内生物测定技术。传统离体生物测定技术,即病原菌脱离寄主(感菌植物等)在人工培养基或无培养基的条件下,直接和药剂接触,观察药剂生物活性大小和类型。离体生物测定主要有附着法、抑菌圈法、孢子萌发法、最低浓度法、生长速率法和干重法等[1]。离体条件下反映的仅是供试药剂和病原菌的关系。所以观察的指标(菌丝生长速率、抑菌圈大小和孢子萌发率等)是供试药剂对病原菌直接毒力的表现。 20世纪60年代,日本理化研究所研究并开发了防治水稻纹枯病及其他真菌性病害的多氧霉素(P oly oxin),它的发现在很大程度上取决于“植株喷洒法”的建立。自此,活体成为农用杀菌剂研究的传统生物测定技术。活体生物测定,即在室内控制条件下,于病原菌和活体寄主共存体系中观察药剂生物活性大小和类型。活体测定法按测试材料主要有器官接种试验、种子杀菌剂药效试验、果实防腐剂生物测定等;按作用方式又可分为先接种后药剂处理的治疗作用试验和先药剂处理后接种的保护作用试验。活体条件下,环境因素易于控制,主要反映的是特定环境下病原菌、寄主和药剂三者关系,病原菌活性受药剂和寄主生物双重影响,所观察的指标(病斑大小、发病率等)是病原菌、寄主和药剂的综合表现。 1.2 离体和活体的关联及选择 离体反映的是药剂对病原生物的直接毒力大小,活体反映特定环境条件下药剂在活体上的药效大小。离体生物测定快捷、灵敏、易操作;活体生物测定相对耗力、耗物、周期长,程序复杂。如果离体和活体所反映的杀菌剂生物活性一致,人们更希望用离体代替活体, 基金项目 安徽省高等学校青年教师科研资助计划项目(2005jq1063)。作者简介 杨晓凡(1978-),男,安徽寿县人,硕士,讲师,从事生物农药研究。 收稿日期 2005208228但事实上,有些杀菌剂应用离体有效,活体测定无效,而有些杀菌剂采用活体有效,离体测定却不表现毒力。20世纪70年代以前开发的稻瘟病防治药剂如灭瘟素(Blasticidins)、春日霉素(K asugamycin)、异稻瘟净(I BP)、克瘟散(E DDP)等无论离体、活体试验都具有较强的活性。但70年代后开发的防治药剂如噻菌灵(thiabendaz ole)、三环唑(T ricyclaz ole)、四氯苯酞(Fthalide)、灭瘟唑(S21901)等在离体条件下几乎不表现活性,但是在稻株上却显示极高的防治效果。所以正确选择生物测定方式在杀菌剂开发中往往具有决定性作用。 (1)作用方式。药剂不是直接杀死或抑制病原菌,而是提高植物抗病性或诱导植物抗病性,以达到防治病害的目的,应考虑活体生物测定[24]。 (2)作用机理。如开发黑色素合成抑制剂(M BI)类杀菌剂,这类非杀菌性杀菌剂,由于其不阻碍分生孢子萌发,但抑制附着壁的黑色素的形成而使侵入能力下降,所以研究中应选用活体生物测定;20世纪70年代后开发的作用点单一的内吸性杀菌剂离体表现大都不如活体显著,所以开发内吸性杀菌剂,应以活体测定为主。 (3)药剂开发类型。日用防腐剂、仓储防霉剂、铲除剂类杀菌剂的生测应优先考虑离体,判断其直接毒力的大小;土壤类杀菌剂的开发,如苯基酰胺类CG A8000应以离体测定为主[5];开发保护性杀菌剂可采用离体抑制孢子萌发测定法。 (4)同一生物测定类型,存在不同的选择方法。离体测定中,有的抑制孢子萌发,有的抑制菌丝生长或导致异常芽管的形成,抑制菌丝生长的不宜用抑制孢子萌发法测定,如春日霉素只能抑制菌丝蛋白质的合成,不能抑制孢子萌发。活体测定中要考虑活体对药剂的吸收方式不同,有的要叶面喷洒,有的应考虑土壤处理或营养液处理。 在杀菌剂的开发过程中,对筛选化合物的理化性质及作用机制不明,会给筛选过程中的生测选择带来困难。对于随机合成筛选,发现活性化合物很大程度上依靠机遇,化合物的活性及作用机制是不可预测的[6],应考虑“活体优先”原则。从天然产物筛选杀菌活性成分,初筛时活性含量、成分、稳定性等未明,离体测定相对敏感,复筛及下一步的分离纯化过程中应采用活体、离体相结合的方式共同追踪活性物 安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.S ci.2006,34(1):87-88 责任编辑 孙红忠 责任校对 孙红忠
实验十一抗生素的抑菌试验 一目的要求 1、掌握纸片法测定抗生素抗菌作用的基本方法 2、了解抗生素的抗菌谱 二实验原理 抗生素是某些植物与微生物生长到对数期前后所产生的次生代谢产物，其在低浓度下可其它微生物生长具抑制作用或杀死作用的物质。抗生素对敏感微生物的作用机理分为抑制细胞壁的形成、破坏细胞膜的功能、干扰蛋白质合成及阻碍核酸的合成。 由于不同微生物对不同抗生素的敏感性不一样，抗生素的作用对象就有一定的范围，这种作用范围成为抗生素的抗菌谱，作用对象广的抗生素称为广谱抗生素，作用对象少的抗生素称为窄谱抗生素。而且当某种抗生素长时间用于敏感微生物生长后，即使同一种菌的不同菌株对不同药物的敏感性也常发生改变，甚至出现耐药菌株，亦即产生抗性菌株，则抗生素将失去对抗性菌株生长的抵制，只以采用新的抗生素才可能控制抗性菌株的生长与繁殖，因而不断开发新的抗生素是保健人类身体健康的重要工作。新抗生素产生菌的分离筛选应通过拮抗菌发酵，然后以发酵产物进行抗菌活性实验，根据实验结果而获得产新抗生素的菌株。微生物代谢产物的抗菌活性常以管碟法与纸法进行检测，根据透明抑菌圈的有无与大小作为依据。 三实验器材 1、菌种枯草杆菌、大肠杆菌。 2、培养基MH（Mueller-Hintion）琼脂。 3、试剂青霉素、链霉素。 四方法步骤 1、无菌滤纸片以孔径6mm打孔器将滤纸打为圆形纸片，放入培养皿内，121℃蒸汽湿热灭菌，100℃烘干2h。 2、抗生素溶液制备将取适量青霉素、链霉素，以无菌水溶解。 3、指示菌悬浮液的制备枯草杆菌、大肠杆菌斜面菌种分别以无菌水洗下菌苔细胞，到入无菌三角瓶内，制备适宜浓度的细胞悬浮液。 4、混菌平板制备取批示菌细胞悬浮液1mL加入无菌培养皿内，再加入温度为43~45℃的PDA培养基或牛肉膏蛋白胨琼脂培养基20mL，立即振荡使细胞与培养基混合均匀，静置冷凝。 5、平板加抗生素溶液将滤纸片在抗生素溶液中充分浸泡2min以上，然后将纸片放于混菌平板上，每皿呈三角形放3点，每点贴放纸片2张。 6、培养与观察将平板放于33℃左右的温度培养，每24h测量一次透明抑菌圈直径，共测量3次。
抑菌圈直径和MIC解释标准 缩写: ATCC，美国模式菌种保藏所;CAMHB，调节过阳离子的Mueller-Hinton 肉汤;FDA，美国食品和药品管理局;MHA， Mueller-Hinton琼脂;MIC，最低抑菌浓度;MRS，耐甲氧西林葡萄球菌;MRSA，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;MOD-SA，修饰的金黄色葡萄球菌;PBP，青霉素结合蛋白;PCR，聚合酶链反应;QC，质量控制;VRSA，耐万古霉素金黄色葡萄球菌;vanA，万古霉素耐药基因。BHI，脑心浸液;AST，抗菌药物敏感性试验; ATCC，美国模式菌种保藏所;BSC，生物安全柜; BSL-2，二级生物安全水平;BSL-3，三级生物安全水平;CAMHB，调节过阳离子的 MuellerHinton 肉汤;CDC，疾病预防控制中心;CFU，菌落形成单位;LHB，溶解马血; MHA，Mueller-Hinton琼脂; MIC，最低抑菌浓度;QC，质量控制。 抑菌圈直径和MIC解释标准 铜绿假单胞菌抑菌圈直径和MIC解释标准 试验条件 培养基: 纸片扩散法:MHA 肉汤稀释法:CAMHB 琼脂稀释法: MHA 接种物: 生长法或直接菌落悬液法，相当于 0.5麦氏标准 孵育: 35, 2 ?C;空气环境 纸片扩散法:16 -18 h 稀释法:16 - 20 h (1)对于纸片扩散法，直径150mm平板最大放置12只，直径100mm平板放置5只进行试验(见M02第9.2节)。测量抑菌圈直径(用肉眼判读)，包括纸片直径。保
持平板在反射光照明的、非反射黑的背景上方几英寸，肉眼观察无明显生长的地区作为抑菌圈边缘。在抑菌圈边缘借助放大镜才能观察到的微小菌落生长可忽略不计。 (2)用纸片扩散法和稀释法能可靠地测定分离于囊性纤维化病人的铜绿假单胞菌的敏感性，但在作为敏感结果报告前，应将孵育时间延长至24小时。 (3)所有抗菌药物在延长治疗期间可致铜绿假单胞菌发生耐药。因此，初次分离的敏感菌株在开始治疗后3~4 不动杆菌属抑菌圈直径和MIC解释标准 试验条件 培养基:纸片扩散法: MHA 肉汤稀释法: CAMHB 琼脂稀释法: MHA 接种物:生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准 孵育: 35,2?C;空气环境;20-24h，所有方法 由于培养基中可能存在拮抗剂，甲氧苄啶和磺胺类药物抑菌圈内可允许出现菌株轻微生长;因此，在测量抑菌圈直径时可忽视轻微生长 (20%或较少的菌苔)而测量较明显抑制的边缘。 (2)对四环素敏感的菌株被认为对多西环素和米诺环素也敏感。然而，某些对四环素中介或耐药的菌株可以对多西环素或米诺环素或二者敏感。 洋葱伯克霍尔德菌抑菌圈直径和MIC解释标准 试验条件 培养基:纸片扩散法: MHA 肉汤稀释法:CAMHB 琼脂稀释法: MHA