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溶血磷脂酸受体2调控胃癌细胞SGC-7901侵袭迁移以及增殖凋亡马琳娜;张晨丽;任志恒;张晓;张煦【摘要】为探讨LPA2是否可调节胃癌细胞SGC-7901的侵袭迁移及增殖凋亡,将LPA2 siRNA和pcDNA3.1-LPA2表达载体转染SGC-7901,转染后利用Western blotting检测LPA2、E-cadherin及Vimentin蛋白表达情况,Transwell实验检测细胞侵袭迁移能力,MTS实验检测细胞增殖,流式细胞仪检测凋亡情况.结果表明LPA2 siRNA对胃癌细胞SGC-7901敲除成功后,细胞内的E-cadherin表达增高,Vimentin表达降低;同时其侵袭、迁移和增殖能力降低,凋亡能力升高.细胞SGC-7901过表达LPA2后,细胞内的E-cadherin表达降低,Vimentin表达增加,其侵袭、迁移和增殖能力升高,凋亡能力降低.可见LPA2可调控胃癌细胞SGC-7901侵袭迁移以及增殖凋亡,为胃癌的治疗提供新的靶点.【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2018(018)019【总页数】7页(P26-32)【关键词】胃癌;溶血磷脂酸受体2;侵袭;迁移;增殖;凋亡【作者】马琳娜;张晨丽;任志恒;张晓;张煦【作者单位】兰州大学基础医学院病理学研究所,兰州730000;兰州大学基础医学院病理学研究所,兰州730000;兰州大学基础医学院病理学研究所,兰州730000;兰州大学基础医学院病理学研究所,兰州730000;兰州大学基础医学院病理学研究所,兰州730000【正文语种】中文【中图分类】R735.2胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，是癌症死亡的第二大原因[1]。
胃癌的发病率具有明显的地域差异性。
中国、日本和韩国为胃癌多发区，约占世界比例的60% [2]。
甘肃省是中国胃癌高发省份之一, 2014年胃癌的发病率(63.80/10万)位列第一位[3]。
可见胃癌负担严重，应加强防治措施。
RNA 干扰沉默CXCR4基因对胃癌细胞SGC7901增殖和侵袭力的影响陆航刘学政孙巨峰1（广西医科大学人体解剖学教研室，广西南宁530021）〔摘要〕目的探讨特异性抑制胃癌细胞SGC7901中趋化因子受体4（CXCR4）的表达及RNA 干扰对胃癌细胞SGC7901细胞增殖及侵袭力的影响。
方法将腺病毒载体CXCR4-shRNA 转染至胃癌细胞SGC7901，RT-PCR 检测转染后CXCR4mRNA 的表达量；MTT 法检测癌细胞增殖情况；Transwell 小室侵袭实验对胃癌细胞侵袭力进行检测。
结果（1）成功将CXCR4-shRNA 重组腺病毒载体转染至胃癌细胞SGC7901；（2）空白组与对照组细胞增殖迅速，两组之间无显著性差异（P ＞0.05），实验组经腺病毒载体转染后细胞增殖程度显著减少，与前两组相比有显著性差异（P ＜0.05）；（3）shRNA-CXCR4腺病毒载体和空白组及对照组相比能显著抑制SGC7901细胞的侵袭力（P ＜0.05），抑制率为57.01%。
空白组与对照组相比无显著性差异（P ＞0.05）。
结论重组腺病毒载体CXCR4-shRNA 能有效抑制胃癌细胞SGC7901的侵袭，并在一定程度上抑制癌细胞增殖。
〔关键词〕RNA 干扰；胃癌细胞SGC7901；细胞增殖；细胞侵袭〔中图分类号〕R656.6〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）13-2764-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.13.043基金项目：辽宁省自然科学基金资助项目（No.201102124）1辽宁医学院附属第一医院普外科通讯作者：刘学政（1962-），男，教授，博士生导师，主要从事糖尿病视网膜病变的基础与临床研究。
第一作者：陆航（1975-），男，在读博士，副教授，副主任医师，硕士生导师，主要从事胃癌的基础与临床研究。
胃癌的侵袭和转移是其高死亡率的主要原因。
doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2020.21.013托芬那酸通过下调LOXL2表达抑制人胃癌SGC⁃7901细胞侵袭①程 琦 徐松涛 饶淑梅 马永超 (漯河医学高等专科学校,漯河462002) 中图分类号 R735.2 文献标志码 A 文章编号 1000⁃484X (2020)21⁃2624⁃05①本文受漯河医学高等学校创业创新发展能力提升工程项目(2019⁃LYZTD005)资助㊂作者简介:程 琦,女,硕士,讲师,主要从事胃癌的发病机制和临床防治方面的研究,E⁃mail:283222673@㊂[摘 要] 目的:观察托芬那酸(TA)对人胃癌SGC⁃7901细胞侵袭能力的影响,并探讨其作用机制㊂方法:用不同剂量的TA(0㊁3㊁6㊁12㊁24㊁48㊁96μmol /L)处理SGC⁃7901细胞24h 或48h,CCK⁃8法检测细胞活力,脂质体介导shRNA 转染靶向沉默LOXL 2基因,Transwell 检测侵袭细胞数,RT⁃PCR 检测LOXL2的mRNA 水平,Western blot 检测SP1㊁LOXL2㊁Snail㊁E⁃cad㊁MMP9蛋白水平㊂结果:TA 可剂量依赖性地抑制SGC⁃7901细胞活力(P <0.05),24h 和48h 的IC 50分别为78.06μmol /L 和50.72μmol /L;与对照组相比,0㊁3㊁6和12μmol /L TA 作用24h 后,SGC⁃7901细胞侵袭数显著减少(P <0.05),Snail㊁MMP9㊁SP1和LOXL2蛋白水平均显著降低(P <0.05),E⁃cad 蛋白水平显著升高(P <0.05),LOXL2的mRNA 水平显著降低(P <0.05),且呈现剂量依赖性;敲除LOXL 2基因可抑制SGC⁃7901细胞侵袭(P <0.05),下调Snail 和MMP9(P <0.05)㊁上调E⁃cad 蛋白水平(P <0.05)㊂结论:TA 可能通过下调SP1和LOXL2蛋白表达,进而下调Snail 和MMP9㊁上调E⁃cad 蛋白水平,最终抑制人胃癌SGC⁃7901细胞侵袭㊂[关键词] 托芬那酸;胃癌;SGC⁃7901细胞;侵袭;赖氨酰氧化酶样蛋白2Suppressing invasion of human gastric cancer SGC⁃7901cells by tolfenamic acid through inhibition of LOXL2CHENG Qi ,XU Song⁃Tao ,RAO Shu⁃Mei ,MA Yong⁃Chao .Luohe Medical College ,Luohe 462002,China[Abstract ] Objective :To investigate effects of tolfenamic acid (TA)on invasion in human gastric cancer SGC⁃7901cells andexplore its underlying mechanism.Methods :SGC⁃7901cells were treated with TA (0,3,6,12,24,48,96μmol /L)for 24h and 48h,cell viability was detected by CCK⁃8assay,shRNA plasmid targeting LOXL 2was transfected into SGC⁃7901cells by means of liposome assay,Transwell assay was used to determine ability of invasion.The mRNA expression level of LOXL2were measured by RT⁃PCR,Western blot was performed to analyze protein levels of SP1,LOXL2,Snail,E⁃cad and MMP9.Results :TA remarkably reduced cell viability of SGC⁃7901cells in a dose⁃dependent manner (P <0.05),and the IC 50during 24h and 48h was 78.06μmol /L and 50.72μmol /L pared with control,after exposed to TA (0,3,6and 12μmol /L)for 24h,numbers of invasive cells were significantly reduced (P <0.05),protein levels of SP1,LOXL2,Snail and MMP9were down⁃regulated (P <0.05),protein level of E⁃cad was up⁃regulated (P <0.05),mRNA level of LOXL2was decreased (P <0.05),in a dose⁃dependent manner.LOXL 2knockdown also inhibited invasion of SGC⁃7901cells (P <0.05),and down⁃regulated protein levels of Snail and MMP9(P <0.05),and up⁃regulated protein level of E⁃cad (P <0.05).Conclusion :TA down⁃regulates protein levels of Snail and MMP9,and up⁃regulates protein level of E⁃cad most likely through inhibiting expression of SP1and LOXL2protein,and ultimately lead to a decrease of invasive ability in human gastric SGC⁃7901cells.[Key words ] Tolfenamic acid;Gastric cancer;SGC⁃7901cells;Invasion;Lysyl oxidase⁃like 2 胃癌是威胁人类生命健康的主要恶性肿瘤之一㊂全世界每年死于胃癌的患者约78.3万例,死亡率仅次于肺癌,位居恶性肿瘤谱第二位[1]㊂我国每年新增胃癌患者约67.9万例,死亡49.8万例,成为我国癌症死亡的第二大原因[2]㊂90%以上癌症患者的死亡是由肿瘤细胞侵袭和远处转移导致的[3]㊂因此侵袭和转移是影响胃癌治疗效果和生存预后的重要制约因素㊂托芬那酸(tolfenamic acid,TA)是一种广泛应用的非甾体抗炎药,具有抗炎㊁镇痛㊁解热等作用[4]㊂近年来,TA 对癌症的化学预防作用已获大量临床和流行病学证据支持[5]㊂多项研究证实,TA 可通过抑制转录因子特异性蛋白1(specificity protein 1,SP1)表达发挥抗肿瘤作用,包括神经母细胞瘤㊁结肠癌㊁卵巢癌㊁尤文肉瘤和胰腺癌等[6⁃10]㊂赖氨酰氧化酶样蛋白2(lysyl oxidase⁃like2,LOXL2)是受SP1调控的下游分子,在胃癌的侵袭和转移过程中发挥重要作用[11⁃13]㊂但目前关于TA 对胃癌细胞迁移和侵袭的作用鲜有报道㊂本研究拟通过分子生物学方法观察TA对人胃癌SGC⁃7901细胞迁移和侵袭的影响,并探究其可能的生物学机制㊂1 材料与方法1.1 材料 人胃癌SGC⁃7901细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;胎牛血清(FBS)和RPMI1640培养基购自Hyclone公司;TA 购自Selleck公司;CCK⁃8试剂盒购自武汉博士德生物公司;结晶紫染色液㊁TRIzol试剂㊁RIPA裂解液和ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;Matrigel基质胶和Transwell小室购自Corning公司;靶向LOXL2的shRNA干扰质粒(pRS⁃LOXL2)和无义对照质粒(pRS⁃scrambled)购自美国Origene公司;脂质体(Lipofectamine®2000)购自Invitrogen公司;逆转录⁃聚合酶链式反应(RT⁃PCR)试剂盒购自大连宝生物公司;兔抗人SP1㊁LOXL2㊁Snail㊁E⁃钙黏蛋白(E⁃cadherin,E⁃cad)㊁基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9,MMP9)㊁GAPDH单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自Abcam公司;LOXL2㊁GAPDH引物由大连宝生物公司合成㊂1.2 方法1.2.1 细胞培养 SGC⁃7901细胞用含10%FBS 的RPMI1640培养液置于37℃㊁5%CO2的细胞培养箱中培养;每2d换液1次,待细胞覆盖率达到90%时按1∶3比例传代1次㊂1.2.2 药物配制 将TA溶于二甲基亚砜(DMSO)制成100mmol/L的储备液㊂实验前用完全培养液稀释至所需浓度,其中DMSO的终浓度为0.1%,对照组为含0.1%DMSO的细胞培养液㊂1.2.3 CCK⁃8法检测细胞活力 将SGC⁃7901细胞以5000个/孔接种于96孔板,常规培养24h;去上清,加入100μl含不同剂量TA(0㊁3㊁6㊁12㊁24㊁48㊁96μmol/L)的细胞培养液,每个剂量设5个复孔,常规培养24h或48h;每孔加入10μl CCK⁃8溶液, 37℃孵育1h,用酶标仪检测各孔450nm处OD值;依据公式计算细胞活力,细胞活力(%)=(OD药物组/ OD对照组)×100%,采用SPSS18.0软件的Probit回归模型计算半数抑制浓度(IC50)㊂1.2.4 Transwell法检测细胞侵袭 以不同剂量TA (0㊁3㊁6㊁12μmol/L)处理SGC⁃7901细胞24h,然后收集各组细胞,用无血清RPMI1640培养基制成密度为2×105个/ml的细胞悬液;用RPMI1640培养基按1∶5比例稀释Matrigel基质胶,取50μl加至上室底部,37℃孵育1h;下室中加入600μl含10% FBS的RPMI1640培养基,上室中加入200μl细胞悬液,在37℃㊁5%CO2条件下培养24h;用棉签擦去上室内的细胞,甲醇固定30min,0.1%结晶紫染色20min;显微镜下计数上室下表面附着的侵袭细胞㊂1.2.5 质粒转染 用Lipofectamine®2000将质粒pRS⁃LOXL2和pRS⁃scrambled分别转染SGC⁃7901细胞,细胞转染按说明书进行;转染pRS⁃LOXL2质粒的SGC⁃7901细胞命名为shLOXL2组,转染pRS⁃scrambled质粒的SGC⁃7901细胞命名为shControl 组;转染48h后,收集各组细胞进行后续实验㊂1.2.6 RT⁃PCR检测mRNA水平 用TRIzol试剂提取总RNA,取2μg总RNA进行反转录,反转录条件:42℃60min,70℃15min㊂取2μl进行PCR反应,反应条件为:94℃1min,94℃30s,60℃30s, 72℃1min,32个循环㊂引物采用Primer premier 5.0软件设计,经Blast验证㊂LOXL2上游引物:5′⁃CTGCAAGTTCAATGCCGAGT⁃3′,下游引物:5′⁃AGTTTTGGCCACACACCATC⁃3′;GAPDH上游引物: 5′⁃AATTCCATGGCACCGTCAAG⁃3′,下游引物:5′⁃GGGCAGAGATGATGACCCTT⁃3′㊂PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下拍照㊂1.2.7 Western blot法检测蛋白水平 收集各组细胞,加入RIPA裂解细胞提取总蛋白,采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度;用5×上样缓冲液稀释蛋白样本,沸水浴10min,SDS⁃PAGE电泳并转移至PVDF膜,用5%脱脂奶粉室温封闭1h;加入一抗LOXL2(1∶1000稀释)㊁Snail(1∶1000稀释)㊁E⁃cad(1∶1000稀释)㊁MMP9(1∶1000稀释)和GAPDH(1∶2000稀释),4℃孵育过夜,TBST洗膜2次;加入二抗(1∶5000稀释)室温孵育1h,TBST 洗膜2次;加入ECL工作液进行发光反应,用化学发光成像系统分析仪拍照㊂1.3 统计学处理 采用SPSS18.0软件进行统计学处理,实验数据以x±s表示;两组间比较采用t检验;多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)㊂ImageJ1.45s软件分析条带灰度值㊂以P<0.05表示差异有统计学意义㊂2 结果2.1 TA对SGC⁃7901细胞活力的影响 如图1所示,经不同剂量TA 作用24h 或48h 后,与对照组相比,24㊁48和96μmol /L TA 组细胞活力均显著降低(P <0.05),且随药物剂量的增加呈下降趋势;3㊁6和12μmol /L TA 组细胞活力与对照组相比差异无统计学意义(P >0.05)㊂24h 和48h 的IC 50分别为78.06μmol /L 和50.72μmol /L㊂图1 TA 对SGC⁃7901细胞活力的抑制作用Fig.1 Inhibiting effect of TA on cell viability of SGC⁃7901cellsNote:*.P <0.05vs control group;#.P <0.05vs 24μmol /L TA group;△.P <0.05vs 48μmol /L TAgroup.图2 TA 抑制SGC⁃7901细胞侵袭Fig.2 TA suppressed invasion of SGC⁃7901cellsNote:*.P <0.05vs control group;#.P <0.05vs 3μmol /L TA group;△.P <0.05vs 6μmol /L TAgroup.图3 TA 对SGC⁃7901细胞中Snail ㊁E⁃cad ㊁MMP9㊁SP1和LOXL2蛋白水平的影响Fig.3 Effect of TA on protein levels of Snail ,E⁃cad ,MMP9,SP1and LOXL2in SGC⁃7901cellsNote:*.P <0.05vs control group;#.P <0.05vs 3μmol /L TA group;△.P <0.05vs 6μmol /L TA group.2.2 TA 对SGC⁃7901细胞侵袭的影响 如图2所示,与对照组相比,3㊁6和12μmol /L TA 组侵袭细胞数均显著减少(P <0.05),且随着药物剂量的增加而减少(P <0.05)㊂2.3 TA 对侵袭相关蛋白水平的影响 如图3所示,与对照组相比,经不同剂量TA(3㊁6㊁12μmol /L)处理24h 后,SGC⁃7901细胞中Snail㊁MMP9㊁SP1和LOXL2蛋白水平均显著下降(P <0.05),且随TA 剂量的增加呈下降趋势(P <0.05);E⁃cad 蛋白水平则随TA 剂量的增加逐渐升高(P <0.05)㊂2.4 TA 对LOXL2的mRNA 水平的影响 如图4所示,与对照组相比,3㊁6和12μmol /L TA 组LOXL2的mRNA 水平均显著下降(P <0.05),且随TA 剂量的增加呈下降趋势(P <0.05)㊂图4 TA 剂量依赖性下调LOXL2的mRNA 水平Fig.4 TA down⁃regulated mRNA level of LOXL2in adose⁃dependent mannerNote:*.P <0.05vs control group;#.P <0.05vs 3μmol /L TA group;△.P <0.05vs 6μmol /L TAgroup.图5 敲除LOXL 2基因对LOXL2㊁Snail ㊁E⁃cad 和MMP9蛋白水平的影响Fig.5 Effect of LOXL 2gene knockout on protein levels ofLOXL2,Snail ,E⁃cad and MMP9Note:*.P <0.05vs shControlgroup.图6 敲除LOXL 2基因抑制SGC⁃7901细胞侵袭Fig.6 Knockout of LOXL 2gene inhibited invasion of SGC⁃7901cellsNote:*.P <0.05vs shControl group.2.5 敲除LOXL2基因对侵袭相关蛋白水平的影响 如图5所示,与shControl组相比,shLOXL2组LOXL2㊁Snail和MMP9蛋白水平均显著下降(P< 0.05),E⁃cad蛋白水平显著升高(P<0.05)㊂2.6 敲除LOXL2基因对SGC⁃7901细胞侵袭的影响 如图6所示,与shControl组相比,shLOXL2组侵袭细胞数明显减少(P<0.05)㊂3 讨论有研究证实,TA可通过下调Slug蛋白表达抑制人鼻咽癌细胞迁移和侵袭[14]㊂本研究显示,高剂量TA(>12μmol/L)对人胃癌SGC⁃7901细胞活力具有显著抑制作用,并呈现剂量和时间依赖性㊂为避免细胞活力受损对细胞侵袭能力的影响,本实验采用低剂量TA(3㊁6㊁12μmol/L)处理SGC⁃7901细胞24h,然后行Transwell实验检测细胞侵袭㊂结果显示,TA可剂量依赖性地抑制SGC⁃7901细胞侵袭,这可能与其下调SP1㊁LOXL2㊁Snail和MMP9蛋白水平,上调E⁃cad蛋白水平有关㊂多项研究表明,LOXL2在恶性肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥重要作用,包括胰腺癌㊁乳腺癌㊁肾癌和肝癌等[15⁃18]㊂Kasashima等[13]研究表明,胃癌病理组织中LOXL2蛋白水平与局部侵袭范围㊁淋巴结转移㊁肝转移和腹膜转移呈正相关,敲除LOXL2基因可显著抑制人胃癌OCUM⁃12细胞和NUGC细胞侵袭㊂动物实验也证实,抑制LOXL2可阻止裸鼠胃癌移植瘤向肺转移[12]㊂本研究显示, TA可剂量依赖性地下调SGC⁃7901细胞中LOXL2的mRNA水平,敲除LOXL2基因可抑制SGC⁃7901细胞侵袭并下调Snail和MMP9蛋白水平并上调E⁃cad蛋白水平㊂E⁃cad是一种钙依赖性跨膜糖蛋白,其胞内段通过连环素锚定在细胞骨架上,使相邻细胞形成稳定连接,其表达下调或缺失是肿瘤细胞发生上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的重要标志之一㊂研究表明,E⁃cad蛋白表达上升会导致癌细胞侵袭能力减弱[19]㊂敲除LOXL2基因可上调肾癌细胞中E⁃cad蛋白表达从而抑制其迁移和侵袭[17]㊂Snail是一种具有锌指结构的转录因子,可直接结合E⁃cad基因启动子的E⁃box作用元件,从而抑制其表达[20]㊂LOXL2高表达可通过上调Snail蛋白表达促进肝癌细胞侵袭和转移[18]㊂Zhu 等[21]研究证实,下调Snail蛋白和上调E⁃cad蛋白会抑制人胃癌SGC⁃7901细胞侵袭㊂本研究表明, TA可能通过下调LOXL2/Snail通路促进E⁃cad蛋白表达,这可能是TA抑制SGC⁃7901细胞侵袭的机制之一㊂Hong等[17]研究证实,敲除LOXL2基因可抑制肾癌细胞中MMP9蛋白表达㊂MMP9属基质金属蛋白酶超家族成员,可高效降解Ⅳ型胶原蛋白㊂Ⅳ型胶原蛋白是构成细胞外基质和基底膜的主要成分,而细胞外基质和基底膜是防御恶性肿瘤细胞向周围组织侵袭的天然屏障㊂恶性肿瘤细胞可通过分泌MMP9破坏细胞外基质和基底膜的完整性,侵犯周围组织㊁进而侵入血管和淋巴管向远处转移㊂Wei 等[22]研究显示,上调MMP9蛋白表达可增强SGC⁃7901细胞的侵袭能力㊂本研究表明,TA可剂量依赖性地抑制MMP9蛋白表达,这可能与TA下调LOXL2表达有关㊂综上所述,TA可在体外抑制人胃癌SGC⁃7901细胞侵袭,这可能与其抑制SP1和LOXL2表达,进而下调Snail和MMP9蛋白水平,上调E⁃cad蛋白水平有关㊂本研究为丰富TA的抗肿瘤侵袭作用提供新的实验依据㊂参考文献:[1] Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,et al.Global cancer statistics2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for36cancers in185countries[J].CA Cancer J Clin,2018,68(6):394⁃424.[2] Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115⁃132. 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RNA干扰MBP-1基因对胃癌细胞SGC-7901增殖影响耿晢;姚海燕;韩跃武【期刊名称】《国际检验医学杂志》【年(卷),期】2014(000)024【摘要】目的：探讨 MBP-1（c-myc promter binding protein 1，MBP-1）基因表达沉默对胃癌细胞株 SGC-7901细胞增殖影响。
方法实验分3组：空白对照组（未转染胃癌细胞）、阴性对照组（转染错义序列）和干扰组（转染 MBP-1 shRNA）。
设计2条针对MBP-1基因的小干扰 RNA 片段及1条阴性对照siRNA，并构建入 pSIREN-retroQ 质粒。
将构建的重组 pSIREN-retroQ 质粒通过 Lipofectamine 2000脂质体转染胃癌 SGC-7901细胞，嘌呤霉素筛选稳转株细胞。
Real time PCR 和 Western blot 分别检测MBP-1表达。
MTT 法对 MBP-1干扰后 SGC-7901细胞增殖进行检测。
结果通过 PCR 扩增阳性克隆及测序，说明已成功构建MBP-1干扰及对照重组 pSIREN-retroQ 质粒。
通过Lipofectamine 2000脂质体将重组质粒转染胃癌 SGC-7901细胞，并通过嘌呤霉素筛选2周，说明已成功构建 MBP-1干扰及对照 SGC-7901稳转株细胞。
Real time PCR 检测，干扰组 MBP-1 mRNA 相对表达量与空白对照组相比显著下调（P ＜0.05）。
Western blot 检测 MBP-1蛋白表达，干扰组 MBP-1表达量与空白对照组相比也都显著下调。
MTT 法检测结果表明，MBP-1干扰组细胞在48、72、96和120 h 增殖能力比空白对照组都有显著的升高（P ＜0.05）。
结论下调MBP-1基因表达能明显促进胃癌细胞 SGC-7901的增殖，从而为胃癌基因治疗提供了新靶点。
【总页数】4页(P3300-3303)【作者】耿晢;姚海燕;韩跃武【作者单位】兰州大学基础医学院生物化学及分子生物学研究所，甘肃兰州730000;兰州大学基础医学院生物化学及分子生物学研究所，甘肃兰州 730000;兰州大学基础医学院生物化学及分子生物学研究所，甘肃兰州 730000【正文语种】中文【相关文献】1.hvrdC基因表达水平对胃癌细胞SGC-7901增殖影响的实验研究 [J], 杨庭松;王旭东;申晓军;魏国;黄盛东;袁扬;毕建威2.siRNA沉默mdm2基因对胃癌细胞SGC-7901增殖和Rb基因蛋白表达的影响[J], 杨海霞;成诗银;米建强;王亮;杨国栋;徐继业3.慢病毒介导的αB-晶状体蛋白基因沉默对胃癌细胞SGC-7901增殖和迁移能力的影响 [J], 张峰;赵达;侯小明;袁得峰;张彦军;金延玲;李敏4.靶向沉默Notch1基因对胃癌细胞SGC-7901增殖和侵袭的影响 [J], 魏光兵;常远鸿;王康;仇广林;柴明明5.基于对SGC-7901细胞Survivin、Bcl-2基因的调控探讨益气化瘀散结方影响胃癌细胞增殖凋亡的作用机制 [J], 裴俊文;孙太振;蒋立峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2020.21.013托芬那酸通过下调LOXL2表达抑制人胃癌SGC⁃7901细胞侵袭①程 琦 徐松涛 饶淑梅 马永超 (漯河医学高等专科学校,漯河462002) 中图分类号 R735.2 文献标志码 A 文章编号 1000⁃484X (2020)21⁃2624⁃05①本文受漯河医学高等学校创业创新发展能力提升工程项目(2019⁃LYZTD005)资助㊂作者简介:程 琦,女,硕士,讲师,主要从事胃癌的发病机制和临床防治方面的研究,E⁃mail:283222673@㊂[摘 要] 目的:观察托芬那酸(TA)对人胃癌SGC⁃7901细胞侵袭能力的影响,并探讨其作用机制㊂方法:用不同剂量的TA(0㊁3㊁6㊁12㊁24㊁48㊁96μmol /L)处理SGC⁃7901细胞24h 或48h,CCK⁃8法检测细胞活力,脂质体介导shRNA 转染靶向沉默LOXL 2基因,Transwell 检测侵袭细胞数,RT⁃PCR 检测LOXL2的mRNA 水平,Western blot 检测SP1㊁LOXL2㊁Snail㊁E⁃cad㊁MMP9蛋白水平㊂结果:TA 可剂量依赖性地抑制SGC⁃7901细胞活力(P <0.05),24h 和48h 的IC 50分别为78.06μmol /L 和50.72μmol /L;与对照组相比,0㊁3㊁6和12μmol /L TA 作用24h 后,SGC⁃7901细胞侵袭数显著减少(P <0.05),Snail㊁MMP9㊁SP1和LOXL2蛋白水平均显著降低(P <0.05),E⁃cad 蛋白水平显著升高(P <0.05),LOXL2的mRNA 水平显著降低(P <0.05),且呈现剂量依赖性;敲除LOXL 2基因可抑制SGC⁃7901细胞侵袭(P <0.05),下调Snail 和MMP9(P <0.05)㊁上调E⁃cad 蛋白水平(P <0.05)㊂结论:TA 可能通过下调SP1和LOXL2蛋白表达,进而下调Snail 和MMP9㊁上调E⁃cad 蛋白水平,最终抑制人胃癌SGC⁃7901细胞侵袭㊂[关键词] 托芬那酸;胃癌;SGC⁃7901细胞;侵袭;赖氨酰氧化酶样蛋白2Suppressing invasion of human gastric cancer SGC⁃7901cells by tolfenamic acid through inhibition of LOXL2CHENG Qi ,XU Song⁃Tao ,RAO Shu⁃Mei ,MA Yong⁃Chao .Luohe Medical College ,Luohe 462002,China[Abstract ] Objective :To investigate effects of tolfenamic acid (TA)on invasion in human gastric cancer SGC⁃7901cells andexplore its underlying mechanism.Methods :SGC⁃7901cells were treated with TA (0,3,6,12,24,48,96μmol /L)for 24h and 48h,cell viability was detected by CCK⁃8assay,shRNA plasmid targeting LOXL 2was transfected into SGC⁃7901cells by means of liposome assay,Transwell assay was used to determine ability of invasion.The mRNA expression level of LOXL2were measured by RT⁃PCR,Western blot was performed to analyze protein levels of SP1,LOXL2,Snail,E⁃cad and MMP9.Results :TA remarkably reduced cell viability of SGC⁃7901cells in a dose⁃dependent manner (P <0.05),and the IC 50during 24h and 48h was 78.06μmol /L and 50.72μmol /L pared with control,after exposed to TA (0,3,6and 12μmol /L)for 24h,numbers of invasive cells were significantly reduced (P <0.05),protein levels of SP1,LOXL2,Snail and MMP9were down⁃regulated (P <0.05),protein level of E⁃cad was up⁃regulated (P <0.05),mRNA level of LOXL2was decreased (P <0.05),in a dose⁃dependent manner.LOXL 2knockdown also inhibited invasion of SGC⁃7901cells (P <0.05),and down⁃regulated protein levels of Snail and MMP9(P <0.05),and up⁃regulated protein level of E⁃cad (P <0.05).Conclusion :TA down⁃regulates protein levels of Snail and MMP9,and up⁃regulates protein level of E⁃cad most likely through inhibiting expression of SP1and LOXL2protein,and ultimately lead to a decrease of invasive ability in human gastric SGC⁃7901cells.[Key words ] Tolfenamic acid;Gastric cancer;SGC⁃7901cells;Invasion;Lysyl oxidase⁃like 2 胃癌是威胁人类生命健康的主要恶性肿瘤之一㊂全世界每年死于胃癌的患者约78.3万例,死亡率仅次于肺癌,位居恶性肿瘤谱第二位[1]㊂我国每年新增胃癌患者约67.9万例,死亡49.8万例,成为我国癌症死亡的第二大原因[2]㊂90%以上癌症患者的死亡是由肿瘤细胞侵袭和远处转移导致的[3]㊂因此侵袭和转移是影响胃癌治疗效果和生存预后的重要制约因素㊂托芬那酸(tolfenamic acid,TA)是一种广泛应用的非甾体抗炎药,具有抗炎㊁镇痛㊁解热等作用[4]㊂近年来,TA 对癌症的化学预防作用已获大量临床和流行病学证据支持[5]㊂多项研究证实,TA 可通过抑制转录因子特异性蛋白1(specificity protein 1,SP1)表达发挥抗肿瘤作用,包括神经母细胞瘤㊁结肠癌㊁卵巢癌㊁尤文肉瘤和胰腺癌等[6⁃10]㊂赖氨酰氧化酶样蛋白2(lysyl oxidase⁃like2,LOXL2)是受SP1调控的下游分子,在胃癌的侵袭和转移过程中发挥重要作用[11⁃13]㊂但目前关于TA 对胃癌细胞迁移和侵袭的作用鲜有报道㊂本研究拟通过分子生物学方法观察TA对人胃癌SGC⁃7901细胞迁移和侵袭的影响,并探究其可能的生物学机制㊂1 材料与方法1.1 材料 人胃癌SGC⁃7901细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;胎牛血清(FBS)和RPMI1640培养基购自Hyclone公司;TA 购自Selleck公司;CCK⁃8试剂盒购自武汉博士德生物公司;结晶紫染色液㊁TRIzol试剂㊁RIPA裂解液和ECL化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;Matrigel基质胶和Transwell小室购自Corning公司;靶向LOXL2的shRNA干扰质粒(pRS⁃LOXL2)和无义对照质粒(pRS⁃scrambled)购自美国Origene公司;脂质体(Lipofectamine®2000)购自Invitrogen公司;逆转录⁃聚合酶链式反应(RT⁃PCR)试剂盒购自大连宝生物公司;兔抗人SP1㊁LOXL2㊁Snail㊁E⁃钙黏蛋白(E⁃cadherin,E⁃cad)㊁基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9,MMP9)㊁GAPDH单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自Abcam公司;LOXL2㊁GAPDH引物由大连宝生物公司合成㊂1.2 方法1.2.1 细胞培养 SGC⁃7901细胞用含10%FBS 的RPMI1640培养液置于37℃㊁5%CO2的细胞培养箱中培养;每2d换液1次,待细胞覆盖率达到90%时按1∶3比例传代1次㊂1.2.2 药物配制 将TA溶于二甲基亚砜(DMSO)制成100mmol/L的储备液㊂实验前用完全培养液稀释至所需浓度,其中DMSO的终浓度为0.1%,对照组为含0.1%DMSO的细胞培养液㊂1.2.3 CCK⁃8法检测细胞活力 将SGC⁃7901细胞以5000个/孔接种于96孔板,常规培养24h;去上清,加入100μl含不同剂量TA(0㊁3㊁6㊁12㊁24㊁48㊁96μmol/L)的细胞培养液,每个剂量设5个复孔,常规培养24h或48h;每孔加入10μl CCK⁃8溶液, 37℃孵育1h,用酶标仪检测各孔450nm处OD值;依据公式计算细胞活力,细胞活力(%)=(OD药物组/ OD对照组)×100%,采用SPSS18.0软件的Probit回归模型计算半数抑制浓度(IC50)㊂1.2.4 Transwell法检测细胞侵袭 以不同剂量TA (0㊁3㊁6㊁12μmol/L)处理SGC⁃7901细胞24h,然后收集各组细胞,用无血清RPMI1640培养基制成密度为2×105个/ml的细胞悬液;用RPMI1640培养基按1∶5比例稀释Matrigel基质胶,取50μl加至上室底部,37℃孵育1h;下室中加入600μl含10% FBS的RPMI1640培养基,上室中加入200μl细胞悬液,在37℃㊁5%CO2条件下培养24h;用棉签擦去上室内的细胞,甲醇固定30min,0.1%结晶紫染色20min;显微镜下计数上室下表面附着的侵袭细胞㊂1.2.5 质粒转染 用Lipofectamine®2000将质粒pRS⁃LOXL2和pRS⁃scrambled分别转染SGC⁃7901细胞,细胞转染按说明书进行;转染pRS⁃LOXL2质粒的SGC⁃7901细胞命名为shLOXL2组,转染pRS⁃scrambled质粒的SGC⁃7901细胞命名为shControl 组;转染48h后,收集各组细胞进行后续实验㊂1.2.6 RT⁃PCR检测mRNA水平 用TRIzol试剂提取总RNA,取2μg总RNA进行反转录,反转录条件:42℃60min,70℃15min㊂取2μl进行PCR反应,反应条件为:94℃1min,94℃30s,60℃30s, 72℃1min,32个循环㊂引物采用Primer premier 5.0软件设计,经Blast验证㊂LOXL2上游引物:5′⁃CTGCAAGTTCAATGCCGAGT⁃3′,下游引物:5′⁃AGTTTTGGCCACACACCATC⁃3′;GAPDH上游引物: 5′⁃AATTCCATGGCACCGTCAAG⁃3′,下游引物:5′⁃GGGCAGAGATGATGACCCTT⁃3′㊂PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下拍照㊂1.2.7 Western blot法检测蛋白水平 收集各组细胞,加入RIPA裂解细胞提取总蛋白,采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度;用5×上样缓冲液稀释蛋白样本,沸水浴10min,SDS⁃PAGE电泳并转移至PVDF膜,用5%脱脂奶粉室温封闭1h;加入一抗LOXL2(1∶1000稀释)㊁Snail(1∶1000稀释)㊁E⁃cad(1∶1000稀释)㊁MMP9(1∶1000稀释)和GAPDH(1∶2000稀释),4℃孵育过夜,TBST洗膜2次;加入二抗(1∶5000稀释)室温孵育1h,TBST 洗膜2次;加入ECL工作液进行发光反应,用化学发光成像系统分析仪拍照㊂1.3 统计学处理 采用SPSS18.0软件进行统计学处理,实验数据以x±s表示;两组间比较采用t检验;多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)㊂ImageJ1.45s软件分析条带灰度值㊂以P<0.05表示差异有统计学意义㊂2 结果2.1 TA对SGC⁃7901细胞活力的影响 如图1所示,经不同剂量TA 作用24h 或48h 后,与对照组相比,24㊁48和96μmol /L TA 组细胞活力均显著降低(P <0.05),且随药物剂量的增加呈下降趋势;3㊁6和12μmol /L TA 组细胞活力与对照组相比差异无统计学意义(P >0.05)㊂24h 和48h 的IC 50分别为78.06μmol /L 和50.72μmol /L㊂图1 TA 对SGC⁃7901细胞活力的抑制作用Fig.1 Inhibiting effect of TA on cell viability of SGC⁃7901cellsNote:*.P <0.05vs control group;#.P <0.05vs 24μmol /L TA group;△.P <0.05vs 48μmol /L TAgroup.图2 TA 抑制SGC⁃7901细胞侵袭Fig.2 TA suppressed invasion of SGC⁃7901cellsNote:*.P <0.05vs control group;#.P <0.05vs 3μmol /L TA group;△.P <0.05vs 6μmol /L TAgroup.图3 TA 对SGC⁃7901细胞中Snail ㊁E⁃cad ㊁MMP9㊁SP1和LOXL2蛋白水平的影响Fig.3 Effect of TA on protein levels of Snail ,E⁃cad ,MMP9,SP1and LOXL2in SGC⁃7901cellsNote:*.P <0.05vs control group;#.P <0.05vs 3μmol /L TA group;△.P <0.05vs 6μmol /L TA group.2.2 TA 对SGC⁃7901细胞侵袭的影响 如图2所示,与对照组相比,3㊁6和12μmol /L TA 组侵袭细胞数均显著减少(P <0.05),且随着药物剂量的增加而减少(P <0.05)㊂2.3 TA 对侵袭相关蛋白水平的影响 如图3所示,与对照组相比,经不同剂量TA(3㊁6㊁12μmol /L)处理24h 后,SGC⁃7901细胞中Snail㊁MMP9㊁SP1和LOXL2蛋白水平均显著下降(P <0.05),且随TA 剂量的增加呈下降趋势(P <0.05);E⁃cad 蛋白水平则随TA 剂量的增加逐渐升高(P <0.05)㊂2.4 TA 对LOXL2的mRNA 水平的影响 如图4所示,与对照组相比,3㊁6和12μmol /L TA 组LOXL2的mRNA 水平均显著下降(P <0.05),且随TA 剂量的增加呈下降趋势(P <0.05)㊂图4 TA 剂量依赖性下调LOXL2的mRNA 水平Fig.4 TA down⁃regulated mRNA level of LOXL2in adose⁃dependent mannerNote:*.P <0.05vs control group;#.P <0.05vs 3μmol /L TA group;△.P <0.05vs 6μmol /L TAgroup.图5 敲除LOXL 2基因对LOXL2㊁Snail ㊁E⁃cad 和MMP9蛋白水平的影响Fig.5 Effect of LOXL 2gene knockout on protein levels ofLOXL2,Snail ,E⁃cad and MMP9Note:*.P <0.05vs shControlgroup.图6 敲除LOXL 2基因抑制SGC⁃7901细胞侵袭Fig.6 Knockout of LOXL 2gene inhibited invasion of SGC⁃7901cellsNote:*.P <0.05vs shControl group.2.5 敲除LOXL2基因对侵袭相关蛋白水平的影响 如图5所示,与shControl组相比,shLOXL2组LOXL2㊁Snail和MMP9蛋白水平均显著下降(P< 0.05),E⁃cad蛋白水平显著升高(P<0.05)㊂2.6 敲除LOXL2基因对SGC⁃7901细胞侵袭的影响 如图6所示,与shControl组相比,shLOXL2组侵袭细胞数明显减少(P<0.05)㊂3 讨论有研究证实,TA可通过下调Slug蛋白表达抑制人鼻咽癌细胞迁移和侵袭[14]㊂本研究显示,高剂量TA(>12μmol/L)对人胃癌SGC⁃7901细胞活力具有显著抑制作用,并呈现剂量和时间依赖性㊂为避免细胞活力受损对细胞侵袭能力的影响,本实验采用低剂量TA(3㊁6㊁12μmol/L)处理SGC⁃7901细胞24h,然后行Transwell实验检测细胞侵袭㊂结果显示,TA可剂量依赖性地抑制SGC⁃7901细胞侵袭,这可能与其下调SP1㊁LOXL2㊁Snail和MMP9蛋白水平,上调E⁃cad蛋白水平有关㊂多项研究表明,LOXL2在恶性肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥重要作用,包括胰腺癌㊁乳腺癌㊁肾癌和肝癌等[15⁃18]㊂Kasashima等[13]研究表明,胃癌病理组织中LOXL2蛋白水平与局部侵袭范围㊁淋巴结转移㊁肝转移和腹膜转移呈正相关,敲除LOXL2基因可显著抑制人胃癌OCUM⁃12细胞和NUGC细胞侵袭㊂动物实验也证实,抑制LOXL2可阻止裸鼠胃癌移植瘤向肺转移[12]㊂本研究显示, TA可剂量依赖性地下调SGC⁃7901细胞中LOXL2的mRNA水平,敲除LOXL2基因可抑制SGC⁃7901细胞侵袭并下调Snail和MMP9蛋白水平并上调E⁃cad蛋白水平㊂E⁃cad是一种钙依赖性跨膜糖蛋白,其胞内段通过连环素锚定在细胞骨架上,使相邻细胞形成稳定连接,其表达下调或缺失是肿瘤细胞发生上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的重要标志之一㊂研究表明,E⁃cad蛋白表达上升会导致癌细胞侵袭能力减弱[19]㊂敲除LOXL2基因可上调肾癌细胞中E⁃cad蛋白表达从而抑制其迁移和侵袭[17]㊂Snail是一种具有锌指结构的转录因子,可直接结合E⁃cad基因启动子的E⁃box作用元件,从而抑制其表达[20]㊂LOXL2高表达可通过上调Snail蛋白表达促进肝癌细胞侵袭和转移[18]㊂Zhu 等[21]研究证实,下调Snail蛋白和上调E⁃cad蛋白会抑制人胃癌SGC⁃7901细胞侵袭㊂本研究表明, TA可能通过下调LOXL2/Snail通路促进E⁃cad蛋白表达,这可能是TA抑制SGC⁃7901细胞侵袭的机制之一㊂Hong等[17]研究证实,敲除LOXL2基因可抑制肾癌细胞中MMP9蛋白表达㊂MMP9属基质金属蛋白酶超家族成员,可高效降解Ⅳ型胶原蛋白㊂Ⅳ型胶原蛋白是构成细胞外基质和基底膜的主要成分,而细胞外基质和基底膜是防御恶性肿瘤细胞向周围组织侵袭的天然屏障㊂恶性肿瘤细胞可通过分泌MMP9破坏细胞外基质和基底膜的完整性,侵犯周围组织㊁进而侵入血管和淋巴管向远处转移㊂Wei 等[22]研究显示,上调MMP9蛋白表达可增强SGC⁃7901细胞的侵袭能力㊂本研究表明,TA可剂量依赖性地抑制MMP9蛋白表达,这可能与TA下调LOXL2表达有关㊂综上所述,TA可在体外抑制人胃癌SGC⁃7901细胞侵袭,这可能与其抑制SP1和LOXL2表达,进而下调Snail和MMP9蛋白水平,上调E⁃cad蛋白水平有关㊂本研究为丰富TA的抗肿瘤侵袭作用提供新的实验依据㊂参考文献:[1] Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,et al.Global cancer statistics2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for36cancers in185countries[J].CA Cancer J Clin,2018,68(6):394⁃424.[2] Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115⁃132. 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