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化学工程师Chemical Engineer2021年第2期Sum305No.2分析测试DOI:10.16247/ki.23-1171/tq.20210214HPLC法同时测定清心莲子饮中黄苓昔及甘草酸铁两种成分的含量*陈忠新■*,苟鑫宇■*,李强2，解颖|，田明|(1.黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨150040;2.哈尔滨维科生物技术开发公司，黑龙江哈尔滨150069)摘要:建立高效液相色谱方法，以清心莲子饮中黄苓苷以及甘草酸铵两种成分为研究对象，对其进行含量测定;采用Elite C.8色谱柱，以不同的溶剂作为流动相，结果两种成分的R均大于0.9990,测定的含量分别为34.9566和4.6613mg-剂-1；实验仪器及测定方法结果良好，适用于清心莲子饮中黄苓苷以及甘草酸铵的含量测定，为该制剂的质量控制提供了依据。
关键词:HPLC;清心莲子饮;黄苓苷;甘草酸铵;含量测定中图分类号:R917文献标识码:ASimultaneous determination of Baicalin and Ammonium Glycyrrhizinatein Qingxinlianzi decoction by HPLC*CHEN Zhong-xin1,GOU Xin-yu1,LI Qiang2,XIE Ying1,TIAN Ming1(1.Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine,Harbin150040,China;2.Harbin Weike Biotechnology Development Company,Harbin150069,China)Abstract:To establish an HPLC method for the determination of Baicalin and Ammonium Glycyrrhizinate in qingxinlianzi decoction;Elite C column was used with different solvents as mobile phase,the R2of the two components were higher than0.9990,and the measured contents were34.9566and4.6613mg"dose-1;This method is suitable for the determination of baicalin and Ammonium Glycyrrhizinate in qingxinlianzi decoction,which provides a basis for the quality control of qingxinlianzi decoction.Key words:HPLC;Qingxinlianzi decoction;Baicalin;Ammonium Glycyrrhizinate;content determination清心莲子饮出自《太平惠民和剂局方》。
作者简介:施文娟,女,医师,主要从事妊娠期高血压疾病的诊断和干预方向的研究㊂ ә 通信作者,E -m a i l :x u c h a n ge n @163.c o m ㊂㊃论 著㊃D O I :10.3969/j.i s s n .1672-9455.2024.09.016血清P O D X L ㊁UMO D 和尿m A L B /C r 比值在妊娠期高血压疾病患者发生肾损伤中的诊断价值施文娟,沈春艳,徐常恩ә复旦大学附属妇产科医院产科,上海200090摘 要:目的 探讨血清足糖萼蛋白(P O D X L )㊁尿调节素(UMO D )水平和尿微量蛋白与尿肌酐(m A L B/C r )比值在妊娠期高血压疾病(H D C P )患者发生肾损伤中的诊断价值㊂方法 选取2021年1月至2022年12月在该院诊治的129例H D C P 患者作为H D C P 组,按H D C P 的诊断和分类标准将H D C P 患者分为妊娠期高血压组(51例)㊁子痫前期组(43例)和子痫组(35例),按照24h 尿蛋白定量水平将H D C P 患者分为非肾损伤组(80例)和肾损伤组(49例);另选取同期在该院体检的健康孕妇65例作为健康对照组㊂观察各组研究对象的血清P O D X L ㊁UMO D 水平和尿m A L B /C r 比值㊂采用多因素L o g i s t i c 回归分析H D C P 患者发生肾损伤的危险因素,绘制受试者工作特征(R O C )曲线评估血清P O D X L ㊁UMO D 水平和尿m A L B /C r 比值对H D C P 患者发生肾损伤的诊断价值㊂结果 H D C P 组血清P O D X L 和UMO D 水平低于健康对照组,而尿m A L B /C r 比值高于健康对照组,差异均有统计学意义(P <0.01)㊂子痫组血清P O D X L 和UMO D 水平明显低于子痫前期组和妊娠期高血压组,且子痫前期组低于妊娠期高血压组,差异均有统计学意义(P <0.01);子痫组尿m A L B /C r 比值明显高于子痫前期组和妊娠期高血压组,且子痫前期组高于妊娠期高血压组(P <0.01)㊂损伤组血清C r(s C r )㊁尿素氮水平和尿m A L B /C r 比值明显高于非肾损伤组,而肾损伤组血清G F R ㊁P O D X L 和UMO D 水平明显低于非肾损伤组,差异均有统计学意义(P <0.01);多因素L o gi s t i c 回归分析结果显示,血清P O D X L<11.16n g /m L 和UMO D<176.13m g/m L ,尿m A L B /C r 比值ȡ6.28是H D C P 患者发生肾损伤的危险因素(P <0.01)㊂R O C 曲线分析结果显示,3项指标联合检测的灵敏度为89.8%,特异度为81.2%,曲线下面积(A U C )为0.906,明显高于P O D X L (Z =3.828,P <0.001)㊁UMO D (Z =3.576,P <0.001)和m A L B /C r 比值(Z =3.101,P =0.002)单独诊断的A U C ,而3项指标单独诊断H D C P 患者发生肾损伤的A U C 比较,差异无统计学意义(P >0.05)㊂结论 血清P O D X L ㊁UMO D 和尿m A L B /C r 比值是评估H D C P 严重程度的指标,3项指标联合检测对H D C P 患者发生肾损伤具有较高的诊断价值㊂关键词:足糖萼蛋白; 尿调节素; 尿微量蛋白; 妊娠期高血压疾病; 肾损伤中图法分类号:R 714.246;R 692文献标志码:A文章编号:1672-9455(2024)09-1263-05D i a g n o s t i c v a l u e o f s e r u m P O D X L ,U M O D a n d u r i n a r y m A L B /C r i n r e n a l i n j u r y of h y p e r t e n s i v e d i s o r d e r c o m p l i c a t i ng p r e g n a n c yS H I W e n j u a n ,S H E N C h u n y a n ,X U C h a n g'e n әD e p a r t m e n t o f O b s t e t r i c s ,O b s t e t r i c s a n d G y n e c o l o g y H o s p i t a l o fF u d a n U n i v e r s i t y ,S h a n gh a i 200090,C h i n a A b s t r a c t :O b je c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e d i a g n o s t i c v a l u e of s e r u m p o d o c a l y x i n (P O D X L ),u r o m o d u l i n (UMO D )l e v e l s a n d u r i n a r y m i c r o -p r o t e i n t o u r i n a r y c r e a t i n i n e (m A L B /C r )r a t i o i n r e n a l i n j u r y i n h y pe r t e n -s i v e d i s o r d e r c o m p l i c a t i n g p r e g n a n c y (H D C P ).M e t h o d s A t o t a l o f 129p a t i e n t s w i t h H D C P w h o w e r e t r e a t e d i n t h e h o s p i t a l f r o m J a n u a r y 2021t o D e c e m b e r 2022w e r e s e l e c t e d a s H D C P g r o u p,w h i c h w a s d i v i d e d i n t o g e s t a t i o n a l h y p e r t e n s i o n g r o u p w i t h 51c a s e s ,p r e e c l a m p s i a g r o u p w i t h 43c a s e s a n d e c l a m p s i a g r o u p wi t h 35c a s e s a c c o r d i n g t o t h e c l a s s i f i c a t i o n s t a n d a r d o f g e s t a t i o n a l h y p e r t e n s i o n ,a n d n o n -r e n a l i n j u r y g r o u p wi t h 80c a s e s a n d r e n a l i n j u r y g r o u p w i t h 49c a s e s a c c o r d i n g t o t h e q u a n t i f i c a t i o n o f 24h u r i n a r y pr o t e i n ;65c a s e s o f h e a l t h y p r e g n a n t w o m e n w h o u n d e r w e n t p h y s i c a l e x a m i n a t i o n i n t h e h o s p i t a l d u r i n gt h e s a m e p e r i o d w e r e s e -l e c t e d a s h e a l t h y c o n t r o l g r o u p .T h e s e r u m P O D X L ,UMO D l e v e l s a n d u r i n a r y m AL B /C r v a l u e w e r e c o m -p a r e d i n a l l g r o u p s .B i n a r y L o g i s t i c r e g r e s s i o n a n a l y s i s w a s u s e d t o a n a l yz e t h e r i s k f a c t o r s f o r t h e o c c u r r e n c e o f r e n a l i n j u r y i n H D C P p a t i e n t s ,a n d r e c e i v e r o p e r a t i n g c h a r a c t e r i s t i c (R O C )c u r v e w a s a d o pt e d t o e v a l u a t e t h e d i a g n o s t i c r a t i o o f s e r u m P O D X L ,UMO D l e v e l s a n d u r i n a r y m AL B /C r r a t i o f o r t h e o c c u r r e n c e o f r e n a l i n j u r y i n H D C P p a t i e n t s .R e s u l t s T h e s e r u m P O D X L a n d UMO D l e v e l s i n t h e H D C P g r o u p we r e l o w e r t h a n ㊃3621㊃检验医学与临床2024年5月第21卷第9期 L a b M e d C l i n ,M a y 2024,V o l .21,N o .9t h o s e i n t h e h e a l t h y c o n t r o l g r o u p(P<0.01),a n d t h e u r i n a r y m A L B/C r r a t i o w a s h i g h e r t h a n t h a t i n t h e h e a l t h y c o n t r o l g r o u p(P<0.01).T h e s e r u m P O D X L a n d UMO D l e v e l s i n t h e e c l a m p s i a g r o u p w e r e s i g n i f i-c a n t l y l o w e r t h a n t h o s e i n t h e p r e e c l a m p s i a g r o u p a n d t h e g e s t a t i o n a l h y p e r t e n s i o n g r o u p(P<0.01),w h i l e t h e s e r u m P O D X L a n d UMO D l e v e l s i n t h e p r e e c l a m p s i a g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h o s e i n t h e g e s t a-t i o n a l h y p e r t e n s i o n g r o u p(P<0.01);t h e u r i n a r y m A L B/C r r a t i o i n t h e e c l a m p s i a g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i n t h e p r e e c l a m p s i a g r o u p a n d t h e g e s t a t i o n a l h y p e r t e n s i o n g r o u p(P<0.01),w h i l e t h e u r i n a-r y m A L B/C r r a t i o i n t h e p r e e c l a m p s i a g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i n t h e g e s t a t i o n a l h y p e r t e n s i o n g r o u p(P<0.01).T h e s e r u m l e v e l s o f s C r,B U N a n d u r i n a r y m A L B/C r r a t i o o f H D C P p a t i e n t s i n t h e r e n a l i n-j u r y g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s e i n t h e n o n-r e n a l i n j u r y g r o u p(P<0.01),w h i l e t h e s e r u m G F R,P O D X L a n d UMO D l e v e l s i n t h e r e n a l i n j u r y g r o u p w e r e s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h o s e i n t h e n o n-r e n a l i n j u r y g r o u p(P<0.01).T h e r e s u l t s o f t h e b i n a r y L o g i s t i c r e g r e s s i o n a n a l y s i s s h o w e d t h a t P O D X L<11.16 n g/m L a n d UMO D<176.13m g/m L,m A L B/C r r a t i oȡ6.28w e r e r i s k f a c t o r s f o r r e n a l i n j u r y i n H D C P p a-t i e n t s(P<0.01).R O C c u r v e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e s e n s i t i v i t y o f t h e s e r u m P O D X L,UMO D l e v e l s a n d u r i-n a r y m A L B/C r r a t i o w a s89.8%,t h e s p e c i f i c i t y w a s81.2%,a n d t h e a r e a u n d e r t h e c u r v e(A U C)w a s0.906, w h i c h w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h e A U C o f i n d i v i d u a l i n d i c a t o r s o f P O D X L(Z=3.828,P<0.001), UMO D(Z=3.576,P<0.001)a n d m A L B/C r r a t i o(Z=3.101,P=0.002),w h e r e a s t h e c o m p a r i s o n o f t h e A U C s a m o n g t h e t h r e e i n d i c a t o r s a l o n e h a d n o s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P>0.05).C o n c l u s i o n T h e s e r u m P O D X L,UMO D a n d u r i n a r y m A L B/C r r a t i o a r e i n d i c a t o r s f o r t h e s e v e r i t y o f H D C P,a n d c o m b i n e d d e-t e c t i o n o f t h e a b o v e i n d i c a t o r s h a s h i g h d i a g n o s t i c v a l u e f o r t h e o c c u r r e n c e o f r e n a l d a m a g e i n H D C P p a t i e n t s.K e y w o r d s:p o d o c y l y x i n; u r o m o d u l i n; u r i n a r y m i c r o p r o t e i n; h y p e r t e n s i v e d i s o r d e r c o m p l i c a t i n g p r e g n a n c y;r e n a l i n j u r y妊娠期高血压疾病(H D C P)是一种妊娠期特有的疾病,其发病率为5%~10%,严重影响母婴的健康,是导致产妇死亡的第2大原因[1]㊂随着病情的不断发展,会造成脏器损伤,其中肾损伤最为常见,目前判断肾损伤常用的指标为肾小球滤过率(G F R)和尿微量蛋白(m A L B),但这些指标的灵敏度较低,出现异常时已经有60%~70%肾单位出现损伤,因此选择灵敏度高的血液指标成为学者们研究的热点[2]㊂24h 蛋白尿诊断早期肾损伤具有较高的灵敏度和特异度,但患者对留取24h尿液的依从性差,且检测时间长,易受到运动㊁尿路感染和高血压等多种因素影响,因此目前学者们大多认可采用随机m A L B/尿肌酐(C r)比值(m A L B/C r)来替代24h尿蛋白[3]㊂足细胞是肾小球脏层的重要组成部分,也在尿液的形成中具有重要作用,足糖萼蛋白(P O D X L)是判断足细胞损伤的重要标志物,也对判断肾损伤具有较高的临床价值[4];尿调节素(UMO D)是一种广泛存在于尿液中的抗炎蛋白,与多种肾病的形成具有密切联系,近年来对肾损伤有较高的诊断价值[5]㊂本研究探讨了P O D X L㊁UMO D水平和m A L B/C r比值在H D C P患者发生肾损伤的诊断价值,以期为临床诊疗提供依据㊂现报道如下㊂1资料与方法1.1一般资料选取2021年1月至2022年12月在本院诊治的129例H D C P患者作为H D C P组,年龄24~35岁,平均(30.58ʃ1.55)岁;孕周28~40周,平均(30.47ʃ1.44)周;孕次1~3次,平均(1.58ʃ0.25)次;根据H D C P的诊断和分类标准[6]将H D C P 患者分为妊娠期高血压组(51例)㊁子痫前期组(43例)和子痫组(35例);根据24h尿蛋白定量水平将H D C P患者分为非肾损伤组(<0.3g,80例)和肾损伤组(0.3~2.0g,49例)㊂另选取同期在本院体检的65例健康孕妇作为健康对照组,年龄24~35岁,平均(30.18ʃ1.89)岁;孕周28~40周,平均(30.40ʃ1.55)周;孕次1~3次,平均(1.69ʃ0.34)次㊂纳入标准:H D C P患者均符合‘妊娠期高血压疾病诊治指南(2020)“[6]中的相关诊断标准;均为单胎妊娠㊂排除标准:有原发性高血压㊁肾病㊁糖尿病和重度贫血等病史者;服用影响肾脏功能药物者;智力下降或者有精神性疾病者;合并肝炎㊁结核病和肺炎等急㊁慢性感染性疾病者㊂H D C P组和健康对照组研究对象的年龄㊁孕周和孕次比较,差异均无统计学意义(P> 0.05),具有可比性㊂所有研究对象均签署知情同意书㊂本研究经本院医学伦理委员会审核通过(批号:f c k y y-2020-0067)㊂1.2方法1.2.1血液标本留取和检测 H D C P组入院后第2天和健康对照组于体检当天抽取空腹肘静脉血约5 m L,在室温下静置5m i n后,以3000r/m的速度离心4m i n,离心半径为15c m,取上层血清放置于 80ħ的冰箱中待测㊂采用酶联免疫吸附试验测定血清P O D X L和UMO D水平㊂1.2.2尿液标本的留取和检测 H D C P组入院后第2天和健康对照组体检当天收集清晨中段尿液5m L,㊃4621㊃检验医学与临床2024年5月第21卷第9期 L a b M e d C l i n,M a y2024,V o l.21,N o.9放置于试管中,离心,将上清液封存在冷冻试管中㊂采用免疫比浊法测定m A L B 水平,采用酶法测定C r水平,采用脲酶法测定尿素氮(B U N )水平;检测仪器采用自动生化分析仪(日立,型号:7600)㊂并通过M D R D 公式计算出G F R ㊂1.2.3 观察指标 (1)观察H D C P 组和健康对照组血清P O D X L ㊁UMO D 水平和尿m A L B /C r 比值变化;(2)H D C P 患者发生肾损伤的影响因素;(3)血清P O D X L ㊁UMO D 水平和m A L B /C r 比值对H D C P 患者发生肾损伤的诊断价值㊂1.3 统计学处理 采用S P S S 20.0统计软件进行数据分析㊂符合正态分布的计量资料以x ʃs 表示,两组间比较采用t 检验,多组间比较采用单因素方差分析㊂计数资料以例数或百分率表示,两组间比较采用χ2检验㊂采用多因素L o gi s t i c 回归分析H D C P 患者发生肾损伤的危险因素,绘制受试者工作特征(R O C )曲线评估血清P O D X L ㊁UMO D 和尿m A L B /C r 比值对H D C P 患者发生肾损伤的诊断价值㊂以P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结 果2.1 H D C P 组和健康对照组血清P O D X L ㊁UMO D水平和尿m A L B /C r 比值比较 H D C P 组血清P O D X L 和UMO D 水平低于对照组,而尿m A L B /C r比值高于对照组,差异均有统计学意义(P <0.01)㊂见表1㊂2.2 妊娠期高血压组㊁子痫前期组㊁子痫组血清P O D X L ㊁UMO D 水平和尿m A L B /C r 比值比较 子痫组血清P O D X L 和UMO D 水平明显低于子痫前期组和妊娠期高血压组,且子痫前期组低于妊娠期高血压组,差异均有统计学意义(P <0.05);子痫组的尿m A L B /C r 比值明显高于子痫前期组和妊娠期高血压组,且子痫前期组高于妊娠期高血压组,差异均有统计学意义(P <0.05)㊂见表2㊂表1 H D C P 组和健康对照组血清P O D X L ㊁UMO D 水平和尿m A L B /C r 比值比较(x ʃs )组别n P O D X L (n g /m L )UMO D (m g/L )m A L B /C r 比值H D C P 组12911.16ʃ3.68164.96ʃ53.136.28ʃ1.26健康对照组6515.95ʃ4.64281.77ʃ57.461.63ʃ0.31t -7.254-14.06229.276P<0.001<0.001<0.0012.3 肾损伤组和非肾损伤组患者的临床资料比较肾损伤组血清C r (s C r )㊁B U N 水平和尿m A L B /C r 比值明显高于非肾损伤组,而肾损伤组的G F R ㊁P O D X L和UMO D 水平明显低于非肾损伤组,差异均有统计学意义(P <0.01)㊂两组体质量指数(B M I )和尿量比较,差异均无统计学意义(P >0.05)㊂见表3㊂表2 妊娠期高血压组㊁子痫前期组㊁子痫组血清P O D X L ㊁UMO D 水平和尿m A L B /C r 比值比较(x ʃs )组别nP O D X L(n g /m L )UMO D(m g /L )m A L B /C r 比值妊娠期高血压组5114.54ʃ2.51215.17ʃ39.395.16ʃ0.62子痫前期组439.52ʃ2.75a142.87ʃ28.41a 6.53ʃ0.94a 子痫组358.26ʃ1.74a b 118.94ʃ27.71a b7.61ʃ0.72a bF 85.082102.417109.723P<0.001<0.001<0.001注:与妊娠期高血压组比较,a P <0.05;与子痫前期组比较,bP <0.05㊂表3 肾损伤组和非肾损伤组患者的临床资料比较(x ʃs )组别nB M I(k g/m 2)尿量(m L /k g ㊃h )s C r(μm o l /L )B U N(m m o l /L )G F R(m L /m i n )P O D X L(n g /m L )U M O D(m g /L )m A L B /C r 比值肾损伤组4924.56ʃ1.431.71ʃ0.34105.54ʃ30.1310.35ʃ1.4578.44ʃ16.629.42ʃ2.44133.63ʃ33.997.04ʃ1.14非肾损伤组8024.27ʃ1.621.73ʃ0.5290.84ʃ28.319.56ʃ1.1085.62ʃ15.6412.23ʃ3.90184.16ʃ53.755.82ʃ1.09t 1.010-0.3342.7943.488-2.468-5.038-6.5406.090P0.3150.7390.0060.0010.015<0.001<0.001<0.0012.4 H D C P 患者发生肾损伤的多因素L o gi s t i c 回归分析 以H D C P 患者是否发生肾损伤为因变量(肾损伤=1,非肾损伤=0),以表3中差异由统计学意义的指标作为自变量(各指标按H D C P 患者的平均值为临界值进行赋值:s C rȡ55.14μm o l /L=1,<55.14μm o l /L =0;B U Nȡ9.86mm o l /L =1,<9.86mm o l /L =0;G F Rȡ82.89m L /m i n =1,<82.89m L /m i n =0;P O D X L ȡ11.16n g /m L =1,<11.16n g/m L=0);UMO Dȡ176.13m g /L=1,<176.13m g/L=0;m A L B /C r 比值ȡ6.28=1,<6.28=0)进行多因素L o gi s t i c 回归分析,结果显示,血清P O D X L<11.16n g /m L 和UMO D<176.13m g/m L ,尿m A L B /C r 比值ȡ6.28是H D C P 患者发生肾损伤的危险因素(P <0.01)㊂见表4㊂2.5 血清P O D X L ㊁UMO D 水平和尿m A L B /C r 比值单独及联合检测对H D C P 患者发生肾损伤的诊断价值 以肾损伤组作为阳性标本,非肾损伤组作为阴性标本进行R O C 曲线分析,结果显示,血清P O D X L ㊁UMO D 和尿m A L B /C r 比值单独检测诊断H D C P 患者发生肾损害的曲线下面积(A U C )分别为0.730㊁㊃5621㊃检验医学与临床2024年5月第21卷第9期 L a b M e d C l i n ,M a y 2024,V o l .21,N o .90.781㊁0.783㊂以3项指标建立方程:Y =-0.23ˑX P O D X L -0.03ˑX UMO D +1.13ˑX m A L B /C r 比值-0.47㊂R O C 曲线分析结果显示,血清P O D X L ㊁UMO D 和尿m A L B /C r 比值联合检测诊断H D C P 患者发生肾损伤的灵敏度为89.8%,特异度为81.2%,A U C 为0.906,明显高于P O D X L (Z =3.828,P <0.001)㊁UMO D (Z =3.576,P <0.001)和m A L B /C r 比值(Z =3.101,P =0.002)单独诊断的A U C ,而3项指标单独诊断H D C P 患者发生肾损伤的A U C 比较,差异无统计学意义(P >0.05)㊂见表5㊁图1㊂表4 H D C P 患者发生肾损伤的多因素L o gi s t i c 回归分析因素βS E W a l dχ2P O RO R 的95%C Is C r0.0170.0102.8500.0911.0170.997~1.037B U N 0.3030.2112.0610.1511.3540.895~2.049G F R-0.0180.0161.3690.2420.9820.952~1.012P O D X L -0.2250.0788.3020.0040.7990.686~0.931UMO D -0.0320.00814.651<0.0010.9690.953~0.984m A L B /C r1.0250.25815.736<0.0012.7871.679~4.620表5 血清P O D X L ㊁UMO D 和尿m A L B /C r 比值单独及3项指标联合检测对H D C P 患者发生肾损伤的诊断价值指标最佳截断值灵敏度(%)特异度(%)A U C A U C 的95%C I P O D X L 12.28n g/m L 91.850.00.7300.645~0.805UMO D 172.55m g/L 93.956.20.7810.700~0.849m A L B /C r 比值6.7465.383.70.7830.702~0.851P O D X L +UMO D +m A L B /C r 比值-89.881.20.9060.841~0.950注:-表示无数据㊂图1 血清P O D X L ㊁UMO D 和尿m A L B /C r 比值单独及联合检测诊断H D C P 患者发生肾损伤的R O C曲线3 讨 论H D C P 主要为全身小血管痉挛和内皮功能障碍引起全身血液灌注障碍导致的病理生理改变㊂在内脏器官中肾脏对缺血㊁缺氧较为敏感,是H D C P 患者最常见的受累器官,早期监测肾脏受损对于早期治疗具有重要的临床意义㊂本研究发现,H D C P 组血清P O D X L 水平明显低于健康对照组(P <0.05),并且P O D X L 水平随着H D C P 严重程度升高而降低,说明P O D X L 与H D C P 严重程度有关,与相关文献报道血清P O D X L 是评估H D C P 严重程度的指标的结果一致[7]㊂足细胞足突之间的蛋白质构成了肾小球滤过膜的最外层屏障,当足细胞发生空泡样改变而造成滤过屏障损伤,是引起肾损伤的重要机制,足细胞损伤在肾损伤中的价值逐渐受到学者们的重视[8]㊂糖萼结构起维持足细胞和壁层上皮细胞之间分隔的作用,是维持足突和缝隙隔膜结构的基础作用,对肾小球结构和功能维持具有重要作用[9]㊂P O D X L 是糖萼结构的标记蛋白与肾小球损伤具有密切关系,是作为足细胞损伤的特异性标志物[10]㊂本研究发现肾损伤组的血清P O D X L 水平明显低于非肾损伤组(P <0.01),且多因素L o gi s t i c 回归分析发现血清P O D X L<11.16n g/m L 是H D C P 患者发生肾损伤的危险因素(P <0.01)㊂本研究R O C 曲线分析结果显示,血清P O D X L 为12.28n g/m L 时诊断H D C P 患者发生肾损伤的灵敏度为91.8%,特异度为50.0%,A U C 为0.730,说明血清P O D X L 对H D C P 患者发生肾损伤具有较高的诊断价值㊂本研究结果显示,H D C P 组血清UMO D 水平明显低于健康对照组(P <0.01),并且UMO D 水平随着H D C P 严重程度升高而降低,说明UMO D 是评估H D C P 严重程度的指标㊂UMO D 是一种糖蛋白,由640个氨基酸组成,在肾小管髓袢和远曲小管细胞合成和释放,在尿液中呈一定表达水平[11]㊂本研究结果显示,肾损伤组血清UMO D 水平明显低于非肾损伤组(P <0.01),且多因素L o g i s t i c 回归分析结果发现血清UMO D<176.13m g/m L 是H D C P 患者发生肾㊃6621㊃检验医学与临床2024年5月第21卷第9期 L a b M e d C l i n ,M a y 2024,V o l .21,N o .9损伤的危险因素(P<0.01),与相关研究结果一致[12]㊂有研究表明,血清UMO D水平在评估肾脏的生理状态㊁预测肾功能不全方面的临床价值明显高于其他指标,在胰腺炎合并急性肾损伤的早期阶段血清UMO D水平明显降低,说明肾脏皮髓交接处肾小管出现明显损害,导致合成和释放UMO D出现明显降低,故认为血清UMO D是预测肾损伤的早期指标[12-13]㊂本研究R O C曲线分析结果显示,血清UMO D为172.55m g/L时诊断H D C P患者发生肾损伤的灵敏度为93.9%,特异度为56.2%,A U C为0.781,说明UMO D对H D C P患者发生肾损伤具有较高的诊断价值,与相关文献报道血清UMO D是预测H D C P发生肾损伤的指标的结果一致[14],而对低于临界值的患者是否需要进一步临床处理,需要进一步研究㊂本研究结果显示,H D C P组尿m A L B/C r比值明显高于健康对照组(P<0.01),并且m A L B/C r比值随着H D C P严重程度的升高而升高,说明尿m A L B/ C r比值是评估H D C P严重程度的指标㊂m A L B是早期评估肾脏损伤的重要指标,其为带负电荷的大分子蛋白,一般不能通过肾小球滤过膜,因此在尿液中含量很少㊂在肾脏受损的早期,肾小球的滤过膜通透性增加,在尿液中可以检测到少量的m A L B[15]㊂C r一直是用于监测肾脏功能的指标,由于其灵敏度较差,在s C r出现异常时往往肾脏已经损伤较重,故s C r在肾损伤的监测中具有一定的局限性㊂有研究证实m A L B/C r比值在诊断早期肾损伤方面明显优于B U N㊁C r和尿常规等传统指标,可用于早期肾损伤的检测[16]㊂本研究显示肾损伤组尿m A L B/C r比值明显高于非肾损伤组(P<0.01),且多因素L o g i s t i c回归分析发现,尿m A L B/C r比值ȡ6.28是H D C P患者发生肾损伤的危险因素(P<0.01)㊂R O C曲线分析结果显示,m A L B/C r为6.74时诊断H D C P患者发生肾损伤的灵敏度为65.3%,特异度为83.7%, A U C为0.783,说明m A L B/C r比值在H D C P患者发生肾损伤中具有较高的诊断价值㊂另外,本研究还发现P O D X L㊁UMO D和m A L B/C r比值联合诊断H D C P患者发生肾损伤的灵敏度为89.8%,特异度为81.2%,A U C为0.906,明显高于单项指标诊断的A U C,说明3项指标在诊断H D C P发生早期肾损伤方面具有一定的互补性,但其确切机制需要进一步研究㊂但由于本研究病例数较少,结果可能存在偏倚,今后将需要进一步扩大病例数进一步研究验证㊂总之,血清P O D X L㊁UMO D水平和尿m A L B/C r 比值是评估H D C P严重程度的指标,3项指标联合检测对H D C P患者发生肾损伤具有较高的诊断价值㊂参考文献[1]陈晓婕,韩晴.妊娠期高血压疾病基因多态性研究进展[J].基层医学论坛,2023,27(2):111-113.[2]Z HA N G Y,P E I Y,L I N.A M e t a-a n a l y s i s o f t h e d i f f e r-e n c e s i n s e r u m l i p i d l e v e l s b e t w e e n p r e g n a n t w o m e n w i t h h y p e r t e n s i v e d i s o r d e r c o m p l i c a t i n g p r e g n a n c y a n d n o n h y-p e r t e n s i v e d i s o r d e r c o m p l i c a t i n g p r e g n a n c y[J].B i o m e d R e s I n 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C l i n,M a y2024,V o l.21,N o.9。
中国卫生产业“三白灌肠液”是该院肛肠科开发的用于治疗肠炎的院内制剂,临床应用多年,疗效显著,为进一步造福广大病患,该院决定对该院内制剂进行新药临床前研究,在新药研制过程中,我们对质量标准进行建立,制定了防风中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷含量测定方法,现报道如下。
1仪器与试药1.1仪器岛津20AT 型液相(日本岛津),超声波清洗机(昆山市超声波仪器有限公司)。
1.2试药乙腈为色谱纯(美国Fisher 公司),升麻素苷对照品(111522-201209)、5-O -甲基维斯阿米醇苷对照品(111523-201208),均购于中国药品生物制品检定所。
三白灌肠液由长春中医药大学附属医院实验研究中心提供。
2方法与结果2.1升麻苷与5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量测定[1-10]2.1.1色谱条件迪马C18色谱柱,规格4.6×250mm ;DOI :10.16659/ki.1672-5654.2015.32.124HPLC 法测定三白灌肠液中升麻素苷及5-O-甲基维斯阿米醇苷含量李庆杰1,王莲萍2,李国峰11.长春中医药大学附属医院,吉林长春130021;2.吉林农业大学,吉林长春130118[摘要]目的建立三白灌肠液的含量测定方法。
方法采用高效液相色谱法测定了升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量。
结果升麻素苷在0.045~0.375μg 范围内具有良好的线性关系r =0.999;5-O-甲基维斯阿米醇苷在0.09~0.75μg 范围内具有良好的线性关系r =0.999。
结论该方法简便、精确、重现性好,可用于该制剂的质量控制。
[关键词]三白灌肠液;含量测定;高效液相色谱[中图分类号]R286[文献标识码]A[文章编号]1672-5654(2015)11(b )-0124-03Quantitative Determination of Cmiicifugoside and 5-o -methylvisamm Ios-De in SanBai Enema by HPLCLI Qing-jie 1,WANG Lian-ping 2,LI Guo-feng 11.Affiliated Hospital of Chaugchuu University of Chinese Medicine,Chaugchun ,Jilin Province,130021China ;2.Jilin Agri ⁃cultural University,Changchun ,Jilin Province,130118China[Abstract]Objective To establish the quality Standards of SanBai enema.Mothods prim -O -glucosylcimifugin,5-O -methylvisammioside in SanBai enema were Determine by HPLC.Results The linear relationship was good when prim-O-glucosylcimifugin was at the range of 0.045~0.375μg (r =0.999),and 5-O-methylvisammioside was at the range of 0.09~0.75μg (r =0.999).Conclusion The method developed is simple and accurate with good reproducibility,and the method canbe used for quality control of SanBai enema[Key words]SanBai enema ;Determine ;HPLC[基金项目]吉林省科技支撑计划项目(20130206058YY )。
河南大学学报医学版㊃药学研究㊃纳米胶束中阿霉素和槲皮素含量测定方法的建立朱姣姣,郭秀春,陈云龙,邓勇,彭先飞,周丕俊,蒲晓辉河南大学药学院,河南开封475004摘要目的:建立纳米胶束中三苯基膦-阿霉素和槲皮素含量的高效液相色谱测定方法㊂方法:纳米胶束中三苯基膦-阿霉素和槲皮素含量的测定采用H y p e r s i l C18色谱柱(250ˑ4.6mm,5μm),以纯甲醇为流动相A,以0.3%磷酸水溶液(p H3.0)为流动相B,梯度洗脱(0~9m i n,60%A,检测波长λ=373n m;9~10m i n,60%Aң80%A;10~15m i n,80% A,检测波长λ=480n m);流速:1.0m L㊃m i n-1;柱温:30ħ;进样量:20μL㊂结果: 三苯基膦-阿霉素的线性回归方程为Y=4153.3x+8505.2(R2=0.9999),线性范围为2~64μg㊃m L-1,槲皮素线性回归方程为Y=81230x-23677 (R2=0.9999),线性范围为0.5~40μg㊃m L-1㊂三苯基膦-阿霉素和槲皮素在线性范围内线性关系良好㊂在保留时间内未见其他干扰峰,该方法的精密度㊁稳定性㊁方法回收率和加样回收率均较好㊂结论:该方法可用于同时测定三苯基膦-阿霉素和槲皮素的含量㊂关键词三苯基磷-阿霉素;槲皮素;高效液相色谱法;含量测定中图分类号R284.1E s t a b l i s h m e n t o f am e t h o d o l o g y f o r t h e d e t e r m i n a t i o no fT P P-D O Xa n d Q u e i nn a n om i c e l l e s i nv i t r oZ H U J i a o j i a o G U O X i u c h u n C H E N Y u n l o n g D E N G Y o n g P E N G X i a n f e i Z H O UP i j u n P U X i a o h u iS c h o o l o fP h a r m a c y H e n a nU n i v e r s i t y K a i f e n g475004C HNA b s t r a c t O b j e c t i v e T o e s t a b l i s ham e t h o d f o r t h ed e t e r m i n a t i o no fT P P-D O Xa n dQ u e i nn a n o m i c e l l e sb y H P L CM e t h o d s H y p e r s i lC18c o l u m n250ˑ46mm 5μm w a su s e d0-9m i n m o b i l e p h a s e w a s m e t h a n o l03% p h o s p h o r i c a c i d p H3060ʒ40V V d e t e c t i o nw a v e l e n g t hλ=373n m 10-15m i n m o b i l e p h a s ew a sm e t h a n o l 03%p h o s p h o r i ca c i d p H3080ʒ20V V d e t e c t i o n w a v e l e n g t hλ=480n m f l o w r a t e10m L m i n C o l u m n t e m p e r a t u r e30ħ F l o wr a t e10m L m i n I n j e c t i o nv o l u m e20μL T h e p r e c i s i o n s t a b i l i t y m e t h o dr e c o v e r y a n d s a m p l e r e c o v e r y o f t h em e t h o dw e r e i n v e s t i g a t e d a n dt h ed r u g l o a d i n g a n de n c a p s u l a t i o nr a t eo f t h en a n o m i c e l l e sw e r ea l s od e t e r m i n e d T h e l i n e a r r e g r e s s i o ne q u a t i o no fT P P-D O X w a sY=41533x+85052R2=09999a n dt h el i n e a r r a n g ew a s2~64μg m L-1 Q u e l i n e a r r e g r e s s i o ne q u a t i o n i sY=81230X-23677R2=09999t h e l i n e a r r a n g e i s05~40μg m L-1R e s u l t s T h e r ew a s a g o o d l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e p e a ka r e a a n dc o n c e n t r a t i o no f T P P-D O Xa n dQ u e i n l i n e a r r a n g e N oo t h e r i n t e r f e r e n c e p e a kw a s o b s e r v e dd u r i n g t h e r e t e n t i o n t i m e T h em e t h o dh a sg o o d p r e c i s i o n s t a b i l i t y m e t h o d r e c o v e r y a n d a d d i t i o n r e c o v e r y C o n c l u s i o n T h i s m e t h o d c a n b e u s e d f o rs i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o no fT P P-D O Xa n dQ u eK e y w o r d s T P P-D O X Q u e h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y c o n t e n t d e t e r m i n a t i o n㊃69㊃J o u r n a l o fH e n a nU n i v e r s i t y M e d i c a l S c i e n c e2023422收稿日期:2022-12-18基金项目:国家自然科学基金(U190410650);河南大学学生创新创业训练计划项目(20211020006)作者简介:朱姣姣(2000-),女,学士㊂研究方向:药物新剂型㊂通信作者,E-m a i l:p g h425@163.c o mCopyright©博看网. All Rights Reserved.阿霉素(d o x o r u b i c i n,D O X)是一种广泛应用于肿瘤临床治疗的广谱抗肿瘤药㊂但是,因其毒副作用大且具有心脏毒性及较高的耐药性,从而限制了D O X的临床使用[1]㊂研究表明,通过酰胺键将亲脂性阳离子三苯基膦(t r i p h e n y l p h o s p h i n e,T P P)结合到抗肿瘤药物D O X上形成小分子结合物T P P-D O X,不仅具有良好的线粒体靶向功能,而且增强了D O X的抗肿瘤活性,有效克服肿瘤多药耐药(m u l t i d r u g r e s i s t a n c e,M D R)[2],对乳腺癌㊁结直肠癌等均有比较好的效果[3]㊂槲皮素(q u e r c e t i n,Q u e)是一种天然黄酮[4],具有抗炎㊁抗氧化㊁抗菌㊁抗肿瘤[5-7]等药理作用㊂除此之外,Q u e还具有免疫调节作用,主要是基于能抑制肿瘤坏死因子T N F-α和白细胞介素I L-1β等促炎因子的分泌,以此来减轻炎症反应,提高机体免疫力㊂相关研究[8]表明,Q u e具有良好的逆转多药耐药性的作用,主要是可以降低多药耐药相关蛋白过度表达的肿瘤细胞对肿瘤药物的外排作用㊂Q u e也可通过下调肿瘤耐药相关分子P-g p㊁B C R P㊁M R P1等的表达,抑制化疗药物的外排而逆转肿瘤M D R[9]㊂Z i e l e n i e c k i JL[10]等人通过实验发现,Q u e 能明显的增强K B-M R P细胞内D O X的荧光强度,并且Q u e大大降低了M R P1过度表达所导致的肿瘤多药耐药㊂Q u e对四氯化碳诱导的肝损伤具有治疗解毒作用[11]㊂T P P-D O X有线粒体靶向功能,具有良好的抗肿瘤活性,但单一用药治疗肿瘤细胞常常会引起机体耐药性问题,继而对其治疗效果产生影响㊂Q u e 因为其自身的抗耐药作用,作用于耐药细胞M C F-7/A D R,通过抑制P糖蛋白的表达,可以剂量依赖性抑制D O X外排,逆转D O X的多药耐药性㊂由此可见,联合用药可以在一定程度上缓解肿瘤细胞多药耐药的问题㊂近年来,很多学者将Q u e和D O X 联用用于各种癌细胞的耐药性研究,结果均表明将Q u e和D O X联用可显著增强抗癌效果[12-14]㊂D O X 和Q u e通过联合用药,既能提高Q u e的生物利用度,又能实现药物在肿瘤组织的同时靶向,降低D O X的毒性,有效逆转药物对肿瘤细胞的耐药性㊂本课题组在前期制剂研究中,先设计合成了具有还原敏感性且良好生物相容性的两亲性嵌段共聚物聚乙二醇单甲醚-去氧胆酸-二硫键-聚天冬氨酸苄酯(m P E G-D C A-S S-n p s,简称M D S P),以及无还原敏感性的对比聚合物聚乙二醇-去氧胆酸-丁二酸酐-聚天冬氨酸苄酯(m P E G-D C A-C C-n p s,简称M D-C P),再以M D S P和M D C P为材料,选用T P P-D O X 和Q u e作为模型药物,制备共载T P P-D O X和Q u e 的纳米胶束M D S P-T D-Q u e和M D C P-T D-Q u e,联合应用于肿瘤的治疗㊂本文目的旨在建立测定纳米胶束中T P P-D O X和Q u e的含量测定方法,并应用于纳米胶束的载药量和包封率测定,以便为纳米胶束的质量控制提供有效的分析方法㊂1仪器与试药1.1实验仪器紫外可见光分光光度计(U V-2600,日本岛津公司);高效液相色谱仪(W a t e r s2695-2489型,,上海沃特世科技有限公司);精密酸度计(P H S-3C型,杭州美尼特自动化仪表有限公司),超声波清洗仪(A S3120,北京泰元达精密清洗机)㊂1.2实验材料阿霉素(批号:J Z19122710,上海易恩化学技术有限公司),槲皮素(批号:J Z1706201,陕西晨明生物科技有限公司),色谱甲醇(批号:S00722-081089,苏州欧特化工有限公司),磷酸(批号:20191104,天津市德恩化学试剂有限公司);冰乙酸(批号: 20160328,成都瑞芬思科技有限公司),M D S P㊁M D-C P聚合物材料(实验室自制),T P P-D O X(实验室自制),三乙胺(批号:20160805,南京绿点化工有限公司)㊂2方法与结果2.1纳米胶束的制备采用溶剂挥发法制备以M D S P和M D C P为材料的共载T P P-D O X和Q u e的混合纳米胶束M D-S P-T D-Q u e和M D C P-T D-Q u e㊂精密称取10m g 聚合物材料和1m g药物(T P P-D O X和Q u e为1ʒ1),用1m L甲醇+1m L丙酮使其完全溶解,将其缓慢滴加到盛有15m L超纯水的小烧杯中,以1900 r∙m i n-1的转速搅拌搅拌直至有机溶剂挥发完全,用超声波细胞粉碎机处理,离心后收集上清液,即得胶束溶液㊂2.2检测波长的选择精密量取40m g T P P-D O X,10m g Q u e,10m g M D C P,10m g M D S P溶解于色谱甲醇中,用超声法将其完全溶解后稀释成合适浓度的样品,用微孔无菌滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液㊂用纯甲醇㊃79㊃河南大学学报(医学版),2023,42(2)Copyright©博看网. All Rights Reserved.河南大学学报医学版溶液作为空白对照,在200~600n m波长范围内对供试品溶液进行紫外扫描,考察载体材料M D S P㊁M D C P以及药物T P P-D O X和Q u e的紫外吸收情况,扫描图谱如图1所示㊂图1载体材料与游离药物的紫外扫描图谱由图1可知,在设定的扫描波长200~600n m之间,T P P-D O X在480n m处有最大吸收峰,Q u e的最大吸收峰在373n m,而载体材料M D S P和M D C P在373n m和480n m处无吸收峰㊂因此,本实验选用480n m作为T P P-D O X的最佳紫外吸收波长,373n m作为Q u e的最佳紫外吸收波长,同时可避免载体材料的干扰㊂刘慧娜[2]利用紫外分光光度计在200~800n m范围内对T P P-D O X进行波长扫描,也发现T P P-D O X在480n m处有最大吸收㊂这与本文通过紫外波长扫描所确定的T P P-D O X的检测波长一致,均为480n m㊂2.2H P L C的色谱条件色谱柱:H y p e r s i l C18色谱柱(250ˑ4.6mm,5μm);流动相:以纯甲醇为流动相A,以0.3%磷酸水溶液(p H3.0)为流动相B,梯度洗脱(0~9m i n,60%A,检测波长λ=373n m;9~10m i n,60%Aң80%A;10~15m i n,80%A,检测波长λ=480n m);流速:1.0m L㊃m i n-1;柱温:30ħ;进样量:20μL㊂2.3专属性实验称取T P P-D O X和Q u e各50m g,用色谱甲醇溶解至适宜浓度,0.22μm有机滤膜过滤,按照2.2项下的色谱条件进样,记录色谱图,结果如图2所示㊂图2T P P-D O X(A)和Q u e(B)的高效液相色谱图从图2可知,T P P-D O X的保留时间t=10.634m i n,Q u e的保留时间t=8.461m i n,专属性良好㊂2.4标准曲线的建立精密称取5m g T P P-D O X置于25m L容量瓶中,先用少量甲醇溶解,再用甲醇定容至刻度得到0.2m g∙m L-1的T P P-D O X储备液㊂用移液管精密量取10m L的储备液,置于25m L容量瓶中,甲醇定容至刻度,得到浓度为0.08m g∙m L-1的T P P-D O X母液㊂再用甲醇将母液分别稀释成浓度为2㊁4㊁8㊁16㊁32㊁64μg∙m L-1的溶液,按照2.2项下的色谱条件进样,记录相应的峰面积㊂以进样浓度(X)为横坐标,T P P-D O X的峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归,得到T P P-D O X的线性回归方程,结果见图3(a)㊂精密称取10m g Q u e置于50m L容量瓶中,先用少量甲醇溶解,再用甲醇定容至刻度得到0.2m g∙m L-1的Q u e储备液㊂用移液管精密量取12.5m L储备液,置于50m L容量瓶中,甲醇定容至刻度,得到浓度为0.05m g∙m L-1的Q u e母液㊂再用甲醇将母液分别稀释成浓度为0.5㊁1㊁2㊁4㊁5㊁10㊁20㊁40μg∙m L-1的溶液,按照2.2项下的色谱条件进样,记录相应的峰面积㊂以进样浓度(X)为横坐标,Q u e的峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归,得到Q u e的线性回归方程,结果见图3(b)㊂如图3所示,横坐标X代表药物浓度,纵坐标㊃89㊃J o u r n a l o fH e n a nU n i v e r s i t y M e d i c a l S c i e n c e2023422Copyright©博看网. All Rights Reserved.Y 代表峰面积,再通过峰面积Y 对浓度X 进行线性回归,最终得到T P P -D O X 的线性回归方程为:Y=4153.3x +8505.2(R 2=0.9999),线性范围为2~64μg ∙m L -1㊂Q u e 的线性回归方程Y=81230x-23677(R 2=0.9999),线性范围为0.5~40μg ∙m L -1㊂结果表明,结果表明:在线性范围内T P P -D O X 和Q u e 的色谱峰面积与浓度具有良好的线性关系㊂2.5 精密度实验分别配制浓度为16μg ∙m L -1的T P P -D O X 和20μg ∙m L -1的Q u e 溶液6等份,在2.2条件下分别进样20μL,分别在日内及日间对其重复测定,考察精密度,然后记录所测得的色谱峰面积,并通过2.4项下所得的线性方程计算浓度,最后计算出其日内和日间的相对标准偏差(R S D)值,具体数据见表1㊂图3 T P P -D O X (a )和Q u e (b)的标准曲线图表1 T P P -D O X 和Q u e 日内和日间精密度结果(n =6)项目药品平均浓度/(μg ∙m L -1)R S D /%日内精密度T P P -D O X 16.090.82Q u e20.160.90日间精密度T P P -D O X 16.240.92Q u e 20.130.88经计算得出,T P P -D O X 和Q u e 溶液的日内R S D 分别为0.82%,0.90%(n =6),日间R S D 分别为0.92%,0.88%(n =6),R S D 均小于1%,结果表明高效液相色谱法检测T P P -D O X 和Q u e 浓度的精密度良好,符合‘中国药典“2020版的规定㊂2.6 稳定性实验分别取浓度为16μg ∙m L -1的TP P -D O X 溶液和20μg ∙m L -1的Qu e 溶液,分别在室温下放置2㊁4㊁6㊁8㊁10㊁12h 后,在2.2条件下分别进样20μL ,测定其相应的色谱峰面积,将结果带入2.4项下所得的线性回归方程中,计算其R S D 值,具体数据见表2㊂表2 不同时间内T P P -D O X 和Q u e 稳定性结果(n =3)药品浓度/(μg ∙m L -1)2h 4h6h8h10h12h平均值R S D /%T P P -D O X1616.0216.0315.8716.0416.0115.9015.980.3616.0115.9916.0616.0316.0215.9616.010.2815.9816.0516.0216.0015.9516.1016.010.30Q u e 2020.0320.1020.0520.0719.9420.1320.050.3820.0620.0219.9920.0320.0519.9720.0230.3119.9720.1219.9820.0119.9720.0620.0120.29通过对中间浓度T P P -D O X 和Q u e 在不同时间段2㊁4㊁6㊁8㊁10㊁12h 内的稳定性进行考察,其R S D 值均小于1%,结果表明该方法具有较好的稳定性㊂2.7 方法回收率实验分别取浓度为2μg ∙m L -1㊁16μg ∙mL -1㊁32μg ∙m L -1的T D 溶液和2μg ∙m L -1㊁20㊃99㊃河南大学学报(医学版),2023,42(2)Copyright ©博看网. All Rights Reserved.河南大学学报医学版μg∙m L-1㊁40μg∙m L-1的Q u e溶液,每个浓度平行三份,在2.2条件下分别进样20μL,测定其相应的色谱峰面积,带入2.4项下所得的线性回归方程中,计算T P P-D O X和Q u e浓度,最后计算回收率及R S D值,具体数据见表3㊂表3T P P-D O X和Q u e不同浓度的方法回收率实验(n=3)药品加入量/μg∙m L-1)测的量/μg∙m L-1)平均回收率(%)R S D/%T P P-D O X22ʃ0.52100ʃ1.260.241616ʃ0.35100ʃ1.020.033232ʃ0.34100ʃ1.010.18Q u e22ʃ0.45100ʃ1.220.302020ʃ0.24100ʃ1.010.254040ʃ0.65100ʃ1.020.20结果如表3所示,T P P-D O X和Q u e在低㊁中㊁高三个不同浓度的方法回收率在98.21~101.43之间,均符合药典规定,R S D值均小于0.5%,结果表明回收率良好㊂2.8加样回收率实验精密称取10m g载体材料M D C P㊁M D S P,按照制备的制剂含量的80%㊁100%㊁120%加入D O X原料药和Q u e原料药,用适量色谱甲醇溶解,在2.2条件下分别进样20μL,测定其相应的色谱峰面积,带入2.4项下所得的线性回归方程中,计算T P P-D O X和Q u e浓度,最后计算回收率及R S D值,具体数据见表4㊂表4加样回收率结果(n=3)药品加入量/μg∙m L-1)测的量/μg∙m L-1)平均回收率(%)R S D/%T P P-D O X34.434.2999.681.034342.9199.790.8751.650.9398.701.54Q u e25.626.02101.620.963231.9699.871.8338.437.9399.771.61如表4所示,T P P-D O X和Q u e的加样回收率在98.7%~101.6%之间,R S D值均小于2%,方法回收率较好,符合规定要求㊂2.9载药量和包封率测定用移液管精密量取S P-T D-Q u e㊁C P-T D-Q u e纳米胶束溶液置于10m L容量瓶内,用色谱甲醇定容至刻度,将容量瓶于超声中冰浴处理20m i n,经0.45μm滤膜过滤后,取续滤液20μL,在2.2条件下注入H P L C,记录峰面积,所得峰面积代入2.4项下所得的回归方程,计算各个胶束溶液的浓度,再利用下述公式计算胶束中T P P-D O X和Q u e的载药量(L C%)和包封率(E E%)㊂测得胶束中T P P-D O X和Q u e载药量与包封率见表5㊂L C(%)=载药胶束中药物的质量载药胶束的质量X100%E E(%)=载药胶束中药物的质量初始投药量X100%表5两种混合纳米胶束中T P P-D O X和Q u e载药量和包封率测定结果(n=3)胶束载药量/%T P P-D O X包封率/%T P P-D O X Q u e S P-T D-Q u e1.30ʃ0.442.31ʃ1.3236.1ʃ1.1233.76ʃ3.34C P-T D-Q u e1.34ʃ0.213.43ʃ2.3435.97ʃ2.743.07ʃ3.15由表5可知,S P-T D-Q u e和C P-T D-Q u e纳米胶束中T P P-D O X和Q u e的包封率均在30%以上,载药量均在1.00%以上㊂3讨论D O X在临床上具有疗效好㊁抗瘤谱较广等优点,但是其毒副作用较强,易引起M D R㊂而Q u e不仅能抑制促炎因子的分泌,减少炎症反应的发生,提高机体的免疫力;还能抑制肿瘤细胞增殖,逆转M D R活性㊂但是Q u e s t i o n水溶性差,与D O X联用还存在体内药物动力学不同步等问题[15]㊂本课题组制备的M D S P-T D-Q u e和M D C P-T D-Q u e混合纳米胶束,通过联合载药,即提高Q u e的生物利用度,充分发挥其抗耐药作用,而且能抑制细胞药物的外排,促使更多的T P P-D O X聚集在线粒体内㊂目前D O X和Q u e的含量测定方法很多,有高效液相色谱法㊁荧光光谱法㊁薄层荧光扫描法㊁紫外分光光度法㊁放射免疫法㊁高效毛细管电泳法㊁气相色谱法等[14-17]㊂其中,最为广泛和普遍的方法就是高效液相色谱法(H P L C)㊂在高效液相色谱法检测过程中,影响方法灵敏性和精确性的关键是流动相和检测波长的选择㊂本文中选择的流动相为甲醇-磷酸水溶液,其中加入磷酸溶液是为了避免色谱峰拖尾㊂在流动相中加入冰醋酸也可以有效防止D O X解离,避免色谱峰拖尾,但是冰醋酸不能加入过多,否则会使阿霉素峰形变宽[16]㊂陈浩等[14]在测定定复方脂质体中阿霉素与槲皮素的含量时采用㊃001㊃J o u r n a l o fH e n a nU n i v e r s i t y M e d i c a l S c i e n c e2023422Copyright©博看网. All Rights Reserved.的流动相是甲醇-乙腈-p H3.8磷酸缓冲盐(19ʒ29ʒ52)等度洗脱,检测波长为254n m㊂本文中选择的检测波长是双波长,即D O X的检测波长为480n m,而Q u e的检测波长为373n m㊂本文检测波长的确定是通过紫外扫描,发现T P P-D O X在480 n m处有最大吸收峰,Q u e的最大吸收峰在373n m㊂刘慧娜利用紫外分光光度计在200~800n m范围内对T P P-D O X进行波长扫描,也发现T P P-D O X在480n m 处有最大吸收[2]㊂这与本文通过紫外波长扫描所确定的T P P-D O X的检测波长一致,均为480n m㊂张志坤等利用紫外分光光度计在200~600n m范围内对Q u e 进行波长扫描,发现Q u e在374n m处有最大吸收[17]㊂这与本文通过紫外波长扫描所确定的Q u e的检测波长极为接近,为373n m㊂本文首先利用紫外分光光度计对载体材料M D S P和M D C P和药物T P P-D O X和Q u e进行全波长扫描,确定了T P P-D O X和Q u e的最佳吸收波长在480n m和373n m,其材料无干扰㊂然后,采用H P L C法建立了同时测定混合纳米胶束中T P P-D O X和Q u e的含量测定方法㊂通过对色谱条件进行优化,最终确定流动相使用甲醇(A)-0.3%磷酸水溶液(p H3.0,B)梯度洗脱(0~9m i n,60%A,检测波长λ=373n m;9~10m i n,60%Aң80%A;10~ 15m i n,80%A,检测波长λ=480n m)时,可以较好改善拖尾现象㊂在线性范围内建立了T P P-D O X和Q u e的标准曲线,有较好的线性关系,对其方法的专属性㊁精密度㊁回收率进行考察,结果表明,在设定的浓度范围内建立的含量测定方法较简便㊁专属性较好㊁准确度较高,可以用作纳米胶束M D S P-T D-Q u e和M D-C P-T D-Q u e2中T P P-D O X和Q u e的含量测定㊂参考文献1崔晗宦梦蕾宋彦峰等线粒体靶向T P P-D O X连接物的制备及其逆转肿瘤耐药活性研究J现代生物医学进展201515091619-16222杨建苗王田田韩旻等线粒体靶向药物联合氯喹克服肿瘤多药耐药研究J中国现代应用药学2021151793-17973裴知音基于线粒体作为药物载体用于结直肠癌的治疗效应的研究D武汉华中科技大学20194L U Z B U C HU W e ta l P r e p a r a t i o na n di nv i t r o a n d i nv i v o e v a l u a t i o n o f q u e r c e t i n-l o a d e dm i x e dm i c e l l e s f o r o r a l d e l i v e r y J B i o s c iB i o t e c h n o lB i o c h e m 2018 8261-95C H E N GSC WU Y H HU A N G W C e t a l A n t i-i n-f l a mm a t o r yp r o p e r t y o f q u e r c e t i nt h r o u g hd o w n r e g u l a-t i o n o f I C AM-1a n dMM P-9i nT N F-a l p h a-a c t i v a t e d r e t i-n a l p i g m e n te p i t h e l i a lc e l l s J C y t o k i n e2019116 48-606M E N GL Q Y A N GFY WA N G M S e t a l Q u e r c e-t i n p r o t e c t s a g a i n s t c h r o n i c p r o s t a t i t i si n r a t m o d e l t h r o u g h N F-κB a n d MA P K s i g n a l i n g p a t h w a y s J P r o s t a t e20187811790-8007魏志豪羟基喜树碱与槲皮素联合用药纳米混悬剂的体内外抗肿瘤活性研究D开封河南大学20178H Y U N H B MO O NJY C HO S K Q u e r c e t i ns u p-p r e s s e sC Y R61-m e d i a t e dm u l t i d r u g r e s i s t a n c e i nh u m a n g a s t r i c a d e n o c a r c i n o m aA G S c e l l s J M o l e c u l e s2018 2322099党树伟李国东刘明槲皮素逆转肿瘤多药耐药机制的研究进展J中国肿瘤20172610802-807 10Z I E L E N I E C K I J L N A G A R A J A NY WA T E R SS e ta l C e l l-f r e es y n t h e s i s o faf u n c t i o n a l m e m b r a n e t r a n s p o r t e r i n t o a t e t h e r e db i l a y e r l i p i d m e m b r a n e J L a n g m u i r201632102445-244911HA S S A N S P E L U S OJ C HA L HO U BS e ta l Q u e r c e t i n p o t e n t i a l i z e s t h e r e s p e c t i v e c y t o t o x i ca c t i v i t y o f g e m c i t a b i n e o r d o x o r u b i c i no n3Dc u l t u r e o fA s P C-1 o rH e p G2c e l l s t h r o u g ht h e i n h i b i t i o no fH I F-1αa n d M D R1J P L o SO N E20201510024067612X U W X I ES C H E N X e t a l E f f e c t s o f q u e r c e t i n o nt h ee f f i c a c y o fv a r i o u sc h e m o t h e r a p e u t i cd r u g si n c e r v i c a l c a n c e rc e l l s J D r u g D e s i g n D e v e l o p m e n t a n dT h e r a p y202115577-58813G O D U G U K E L-F A R A H J A O U N ISA e t a l N a n o f o r m u l a t e dA j w a P h o e n i xD a c t y l i f e r a b i o a c t i v e c o m p o u n d s i m p r o v et h es a f e t y o fd o x o r u b i c i n w i t h o u t c o m p r o m i s i n g i t sa n t i c a n c e re f f i c a c y i n b r e a s tc a n c e rJ M o l e c u l e s20202511259714陈浩王玉蓉周曼等R P H P L C法同时测定复方脂质体中阿霉素与槲皮素的含量J中医药学报201240512-1515吕凤娇吴洪许小平荧光色谱测定纳米粒体系中阿霉素含量J宜春学院学报2013359121-124 16罗月王松杰赵秀峰等B o x-B e h n k e n效应面法优化主动靶向复方阿霉素槲皮素脂质体J沈阳药科大学学报20163310759-76717张志坤蒲晓辉袁琦纳米混悬剂中羟基喜树碱和槲皮素的含量测定及方法学考察J河南大学学报医学版2020395311-17责任编辑:段金卯㊃101㊃河南大学学报(医学版),2023,42(2)Copyright©博看网. 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〔Ｊ〕 中国实用医药，２０１１，６（２９）：１７０ １７１〔６〕尚博扬，石思佳，翟宇，等 近红外光谱法对阿苯达唑片进行一致性评价的研究〔Ｊ〕 宁夏医学杂志，２０１９，４１（８）：７３０ ７３２ 〔７〕孙夏荣，王建花，曹玉 近红外光谱法建立当归配方颗粒一致性模型〔Ｊ〕 中国医院用药评价与分析，２０１９，１９（９）：１０８３ １０８４ 〔８〕黄宗雯，余俊，项中华 近红外光谱一致性检验方法快速鉴别江中健胃消食片的真伪〔Ｊ〕 中国药事，２０１２，２６（３）：２７９ ２８１〔９〕史大军，潘龙珍 肺力咳胶囊一致性近红外检验模型的建立与应用〔Ｊ〕 中国药业，２０１４，２３（５）：３１ ３２〔１０〕雷晓晴，李耿，王秀丽，等 基于近红外光谱法快速测定丹参中５中成分模型的建立〔Ｊ〕 中药材，２０１８，４９（１１）：２６５３ ２６６１ 〔１１〕陶明，周艳梅，李勇，等 司他夫定胶囊近红外一致性检验模型建立及验证〔Ｊ〕 中国药品标准，２０１８，１９（５）：３７６ ３８１ ＨＰＬＣ法测定法罗培南钠的差向异构体及相关杂质曲喜龙，王夕婷，于海军，李铁健，张贵民 （鲁南制药集团股份有限公司，国家手性制药工程技术研究中心，山东临沂２７６００６；山东新时代药业有限公司，山东临沂２７３４００）摘要：目的 建立ＲＰ ＨＰＬＣ法测定法罗培南钠中的差向异构体及其它杂质。
方法 采用ＹＭＣＴｒｉａｒｔＣ１８（２５０ｍｍ×４ ６ｍｍ，３μｍ）色谱柱，流动相采用乙腈 ０ ０１ｍｏｌ·Ｌ－１甲酸铵溶液（甲酸调ｐＨ为３ ５），梯度洗脱，流速１ ０ｍＬ·ｍｉｎ－１，检测波长２４０ｎｍ。
结果 在选定的色谱条件下，主峰与差向异构体及其它各杂质峰均能良好分离，差向异构体、杂质Ａ、杂质Ｂ、杂质Ｃ和法罗培南分别在０ ４４～５ ４６μｇ·ｍＬ－１（ｒ＝０ ９９９６）、０ ３９～４ ８５μｇ·ｍＬ－１（ｒ＝０ ９９９８）、０ ４２～５ ２６μｇ·ｍＬ－１（ｒ＝１ ００００）、０ ３９～４ ８２μｇ·ｍＬ－１（ｒ＝０ ９９９９）、０ ３８～４ ７０μｇ·ｍＬ－１（ｒ＝０ ９９９９）浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。
