多重荧光免疫组化染色试剂盒

多色免疫荧光染色试剂盒使用说明多色免疫荧光染色试剂盒使用说明酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶(HRP)对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术同样采纳HRP标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤(HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。

之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-hrp二抗来其次轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

TSA具体原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与四周的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增加。

简洁来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP(而不是直接偶联荧光素)，来催化后续添加入体系的非活性荧光素。

荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟接近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。

然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。

再换个一抗来其次轮孵育，周而复始。

等到全部抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最终去检测结果。

由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担忧抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大削减了试验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。

也就是说，假如用TSA技术，同一张片子上全部的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。

搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行试验，而且信号放大的倍数大大增加。

茹创生物开发的试剂盒详细酪胺荧光染料为以下其中一种或者多种：TYR-480，TYR-520，TYR-570，TYR-620，TYR-690，TYR-780。

免疫组化ABC试剂盒(VECTOR)操作流程一、工作液准备1、封闭血清（黄色小瓶子）：3滴原液+10mL的缓冲液混合，装入黄色的大瓶子；2、生物素二抗（蓝色小瓶子）：1滴原液+10mL的缓冲液混合，装入蓝色的大瓶子；3、ABC复合物：2滴A液加入10mL的缓冲液混合后，加入2滴B液混匀后装入标有ABC 的大瓶子。

此处反应需要30min。

1滴大概50uL4、试剂（自备）二甲苯、PBS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、一抗稀释液：3%BSA in TBS，pH7.4DAB工作液：1ml PBS加入50ul DAB stock solution 、50ul Hydrogen Peroxide solution充分混匀二、步骤1.脱蜡和水化脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。

1）组织切片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；2）无水乙醇中浸泡5min；3）95%乙醇中浸泡5min；4）70%乙醇中浸泡5min；2.PBS洗两次各5min。

3.抗原修复，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片。

煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织切片加热10~15min，必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。

4.PBS洗5min。

5.用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10min，PBS洗3次，每次2min。

6.滴加封闭血清工作液，室温封闭20min，以减少非特异背景，无需冲洗只需吸去多余血清。

7.滴加一抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。

8.PBS洗3次每次2min。

9.滴加生物素二抗工作液，室温度孵育30min。

10.PBS洗3次每次2min。

11.滴加ABC复合物（提前30min，A液与B液等量混合），室温孵育30min。

12.PBS洗3次每次2min。

13.DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。

常用免疫组化试剂介绍概述免疫组化（IHC）是一门通过检测特定抗原在组织切片中的表达程度来揭示组织形态和细胞化学等方面信息的技术。

由于IHC是一种定性分析技术，所以该方法需要与定量技术（如分子生物学）结合使用，从而得到更准确的数据。

IHC涉及到多种试剂，其标记原理和表现形式各异，能够检测的抗原种类也不同。

本文将对常用的IHC试剂进行介绍，以此为指导，让大家更好地了解和应用IHC技术。

常用的免疫组化试剂抗原修复试剂抗原修复试剂（Antigen Retrieval）用于在组织样本中使细胞内蛋白与抗体亲和性和特异性增加。

这种试剂可通过热处理（如高压）或化学处理（如酶样蛋白和酸性处理）来复原被检测抗原的结构和功能。

常用的抗原修复试剂包括：EDTA、Tris、Citrate等。

原位杂交试剂原位杂交试剂（In Situ Hybridization）可检查DNA或RNA分子的特异性结合情况。

这种试剂可将RNA等分子与特定热稳定的蛋白质结合，用于检测基因突变等。

常用的原位杂交试剂包括：流式胶体金试剂、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、双链RNA原位杂交等。

细胞计数试剂细胞计数试剂（Cell Counting）用于获得细胞数量或结构变化。

这种试剂通常用于确定某一类细胞的数量、细胞计数和分离、细胞生长和分裂的应用。

常用的细胞计数试剂包括：皮质醇、14C-labeled thymidine等。

细胞信号转导试剂细胞信号转导试剂（Cell Signaling）用于研究细胞分子级别的通讯系统，并采取措施以确定物质在细胞内的作用机理。

常用的细胞信号转导试剂包括：抗体、试剂原和阻断类似物等。

同型抑制剂同型抑制剂（Isotype Control）用于在IHC实验中作为实验设计的对照组，以检测所观察的抗原与探测剂结合的特异性表现。

常用的同型抑制剂包括：IgG1、IgG2a和IgG2b等。

情况控制试剂情况控制试剂（Condition Control）用于确定IHC试验的最佳条件，包括温度、缓冲液、酸碱程度等。

引言概述：细胞染色是生物学和医学领域中一项重要的实验技术，通过使用染色剂将细胞内特定的结构或分子染色，从而能够更清晰地观察和研究细胞的结构和功能。

本文将继续探讨细胞染色技术的快速、准确、高效的方法。

正文内容：1.快速染色方法：1.1原位染色技术：原位染色技术利用特定的染色剂直接将目标分子染色，如荧光原位杂交（FISH），可以在短时间内获得高分辨率的染色结果。

1.2快速染色试剂盒：市场上现有的快速染色试剂盒，如液基细胞学染色试剂盒，能够在几分钟内完成染色过程，并且结果准确可靠。

2.准确染色方法：2.1免疫组化染色技术：免疫组化染色技术通过利用特异性抗体和酶联反应，能够准确地染色目标蛋白质、细胞器或细胞表面分子，广泛应用于病理学和细胞生物学研究。

2.2激光共聚焦显微镜：激光共聚焦显微镜结合荧光标记技术，能够以亚细胞级别的分辨率观察和研究细胞结构，提供准确的染色结果。

3.高效染色方法：3.1多参数流式细胞仪：多参数流式细胞仪结合多重荧光染色技术，能够同时检测多个目标分子的表达和功能状态，提高染色效率和准确性。

3.2增强染色灵敏性的方法：如放大革片染色法、醛固定染色法等，通过改进染色条件和处理方法，增强染色反应的灵敏性，提高染色效率。

4.详细阐述小点：4.1影响细胞染色效果的因素：样本处理、染色剂的选择和浓度、染色时间和温度等因素对细胞染色效果有重要影响。

4.2不同细胞类型的染色方法差异：由于细胞类型的差异，不同染色方法对不同细胞类型的适应性也有所不同，需要根据具体情况选择合适的染色方法。

4.3细胞硬化剂的应用：细胞硬化剂能够改变细胞的形态和结构，有助于染色剂的渗透和固定，提高染色效果。

4.4图像处理和分析软件的应用：图像处理和分析软件能够对染色结果进行定量分析和三维重构，提高研究的准确性和效率。

4.5细胞染色的应用领域：细胞染色技术广泛应用于病理学、生物医学研究、药物筛选、遗传学等领域，对疾病的诊断和治疗提供重要依据。

多重荧光免疫组化技术的主要流程一、样品处理在进行多重荧光免疫组化实验前，首先需要处理样品。

对于细胞样品，可以通过离心、洗涤等步骤准备细胞悬液。

对于组织样品，需要进行固定、脱水、包埋等处理，以保持组织结构的完整性。

二、抗原解表抗原解表是多重荧光免疫组化实验的关键步骤之一。

通过将样品暴露在适当的条件下，如高温、酶解等，可以使细胞或组织中的抗原裸露出来，为后续的抗体结合提供条件。

三、抗体染色在多重荧光免疫组化实验中，需要使用多个抗体来检测不同的分子。

这些抗体通常是与特定荧光染料偶联的，以便在显微镜下观察到荧光信号。

在进行抗体染色前，需要对抗体进行充分的验证和优化，以确保其特异性和敏感性。

四、荧光显微镜观察在完成抗体染色后，需要使用荧光显微镜观察样品。

荧光显微镜可以通过激发荧光染料发出的荧光信号来获得高分辨率的图像。

通过调整显微镜的参数，如放大倍数、曝光时间等，可以获得清晰的荧光图像。

五、图像处理与分析在获得荧光图像后，需要进行图像处理和分析。

常见的图像处理软件可以用于调整图像的亮度、对比度、色彩平衡等，以提高图像的质量。

同时，可以使用图像分析软件对荧光信号进行定量分析，如计算荧光强度、定位分子的相对位置等。

六、结果解读根据实验结果进行结果解读。

多重荧光免疫组化技术可以同时检测多个分子的表达和定位情况，因此可以提供更全面的信息。

通过对荧光信号的定量分析和图像的解读，可以得出对样品中不同分子的表达和相互作用的结论。

在进行多重荧光免疫组化实验时，还需要注意以下几点：1.选择适当的抗体和荧光染料，确保其特异性和互补性；2.控制实验条件的一致性，如温度、时间等，以保证实验的可重复性；3.合理设计实验对照组，如阳性对照、阴性对照等，以验证实验结果的准确性；4.注意光线的干扰，避免荧光信号的混杂和干扰；5.合理选择荧光显微镜参数，以获取清晰的图像。

多重荧光免疫组化技术是一种强大的工具，可以同时检测多个分子的表达和定位情况。

常规的多重标记免疫组化，其原理、荧光素配伍及流程优化如下：
基本原理：
多重标记是利用免疫学和细胞化学原理，在同一张切片上同时采用或先后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物，或采用不同直径大小颗粒胶体金来原位示踪组织或细胞内不同抗原大分子物质的一项标记染色技术。

采用呈现不同颜色的荧光色素配伍，分别标记不同的抗体，再通过各自与同一切片上的相应抗原特异性结合而加以区别显示所建立起来的双重免疫组化染色技术。

荧光素配伍：
FITC（异硫氰酸荧光素）——翠绿色，常与呈红色的罗丹明或TRITC（异硫氰酸四甲基罗丹明）配伍。

流程优化：
•抗体稀释，染色前先摸索单通道下每个单抗的量佳浓度范围。

•抗体与荧光素匹配，平衡待检样品中靶点峰度和各通道信号强度。

•染色顺序优化，保证多次加热切片不会影响后面靶点表位的完整性。

•构建光谱库
爱必信多重荧光免疫组化染色试剂盒，采用TSA技术，基于酪酰胺的信号放大技术能够检测用传统方法无法检出的低丰度靶标，且无需担心抗体交叉反应，以及一抗。

免疫组化经验总结第⼀部分步骤及常见问题免疫组化技术流程及常见问题解析（修改版）说明：加粗的字体部分是我认为要注意的地⽅和提出的问题，⽽红⾊字体部分表⽰还不太确定的第⼀部分载玻⽚与盖玻⽚的处理：载玻⽚与盖玻⽚重铬酸钾浸泡1-2天，⽔清洗直到没有颜⾊为⽌，放⼊⽆⽔⼄醇中，⽤纱布擦⼲（如需开展原位杂交，还需将玻⽚240℃烤2h），载玻⽚涂上多聚赖氨酸，37度烘⼲，备⽤第⼆部分冰冻切⽚前期处理1冰冻切⽚组织处理。

肿瘤组织从体内取出后，迅速放于液氮中冰冻，然后放于－８０度保存，切⽚时先⽤OCT 固定（尽量减少⽓泡⽣成），-20度20-30分钟固定好后即可切⽚（最好时间长⼀点，时间太短容易使切⽚卷起，也使切⽚不均匀）。

2切⽚，切⽚时要慢，稳⼀点，切好后⽤涂有多聚赖氨酸的载玻⽚粘取切下的组织⽚，粘的时候有⼀个向内拉伸的动作，这样可以使组织⽚充分展开。

⽚⼦的厚度⼀般为10um,也有的要切30um（根据需求调整）。

切好的⽚⼦⽴即放⼊4﹪的新配的多聚甲醛中处理8-10分钟(或在丙酮中固定10S，具体⽤什么固定要看⼀抗的要求)3 PBS中洗⼀下（约2分钟）去掉残留的多聚甲醛。

（丙酮切⽚的话省去本步骤）（从冰箱中取出的⽚⼦最好在PBS中浸泡2分钟，再往下做。

如果打孔不充分，可以在PBS 中加⼊triton x-100洗三次。

再⽤PBS洗⼏次，除去triton x-100）4 ⽚⼦切好后可放于37度烘⼲，但是时间不要太长，2-3⼩时即可，或者室温风⼲，然后放于-20度或-80度冰箱可长期储存。

但是⽤丙酮或有机溶剂固定的⽚⼦上如果还有其他有机溶性的染料的话建议尽快做掉，因为有机溶剂在长期储存中（⼀个⽉）缓慢作⽤的话，也会使染料变得模糊。

第三部分加抗体5 10％正常⼭⽺⾎清（PBS稀释，可加少量的triton x-100打孔），封闭（依⼆抗的来源⽽定），室温孵育30分钟。

6倾去⾎清，擦⼲各组织之间的⽔滴，防⽌有⽔滴粘连。

滴加适当⽐例稀释的⼀抗1：100左右或⼀抗⼯作液，37℃孵育1~2⼩时或4℃过夜，4℃过夜后需在37℃或室温复温30分钟。

(HopeBiot) 镇江厚普生物科技有限公司Zhenjiang Hope Biotechnology Co.，Ltd订货电话：*************传 真：*************网 站：http:// E-mail ：*******************Histostain-Plus Kits免疫组化染色试剂盒货号：SP-9002简介: 本试剂盒为美国ZYMED 公司SP 系列试剂盒，全称为过氧化物酶标记的链霉卵白素（Streptavidin/Peroxidase ）染色试剂盒。

由美国ZYMED 公司于1986年首建。

由于链霉卵白素的分子量是60kDa ，有四个亚基和生物素结合，等电点为6.5，所以该方法具有灵敏度高、特异性强、背景清晰、成本低廉的优点，是理想的免疫组化染色方法。

包装：试剂（无色液体）： 3％ H 2O 2去离子水， 6ml ；试剂A （蓝色液体）：封闭用正常山羊血清工作液， 6ml ；试剂B （黄色液体）：生物素化山羊抗小鼠IgG 二抗工作液， 6ml ；试剂C （橙色液体）：辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP ），6ml 。

标本染色步骤：1， 石蜡切片，常规脱蜡至水。

2， 蒸馏水冲洗，PBS 浸泡5分。

（如需采用抗原修复，在此步骤后进行） 3， 3％ H 2O 2去离子水（无色液体）孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。

4， 滴加试剂A （蓝色液体）室温孵育10-15分钟，倾去，勿洗。

5， 滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2-3小时或4℃过夜。

6， PBS 冲洗，3分钟×3次。

7， 滴加试剂B （黄色液体），室温或37℃孵育10-15分钟。

8， PBS 冲洗，3分钟×3次。

9， 滴加试剂C （橙色液体），室温或37℃孵育10-15分钟。

10，PBS 冲洗，3分钟×3次。

11，显色剂显色DAB 。

12，自来水充分冲洗。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910806526.1(22)申请日 2019.08.28(71)申请人 深圳市森盈生物科技有限公司地址 518000 广东省深圳市南山区桃源街道龙珠三路南山睿园9栋4楼401(72)发明人 黄子权　(74)专利代理机构 广州德伟专利代理事务所(普通合伙) 44436代理人 黄浩威　何文颖(51)Int.Cl.G01N 33/543(2006.01)G01N 33/532(2006.01)G01N 1/30(2006.01)(54)发明名称一种p16免疫组化检测试剂盒(57)摘要本发明涉及生物科技技术领域，具体为一种p16免疫组化检测试剂盒，包括一抗：冻干粉p16抗体；无色试剂：内源性过氧化物酶阻断剂10－15ml；试剂A：免疫组化封闭液；试剂B：生物素标记二抗工作液；试剂C：辣根酶标记链酶卵白素工作液；棕色显色液D液1－2ml ；白色显色液E液20－25ml；0.1M PBS缓冲液；柠檬酸钠抗原修复液；二氨基联本胺DAB染色液。

本发明利用链霉亲和素－生物素信号放大技术生产的免疫组化检测试剂，具有高灵敏度，特异性强、定性定位准确、背景清晰、低倍景染色，直接滴加，操作方便，孵育时间短，适用于冷冻切片、石蜡切片及固定的细胞涂片；可用于检测细胞、组织内的特异性抗原。

权利要求书2页 说明书4页CN 110501498 A 2019.11.26C N 110501498A1.一种p16免疫组化检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中包括以下试剂：一抗：冻干粉p16抗体；无色试剂：内源性过氧化物酶阻断剂10－15ml；试剂A：免疫组化封闭液；试剂B：生物素标记二抗工作液；试剂C：辣根酶标记链酶卵白素工作液；棕色显色液D液1－2ml；白色显色液E液20－25ml；0.1MPBS缓冲液；柠檬酸钠抗原修复液；二氨基联本胺DAB染色液。