免疫组化特殊染色试剂

医院病理科免疫组化及特殊染色工作制度
免疫组化和特殊染色已经成为现代病理学中不可或缺的重要工具，准确的免疫组化和特殊染色可极大地帮助病理诊断，或提供准确的分子治疗靶标；而不准确的免疫组化和特殊染色反而产生误导，造成误诊。

因此必须对影响免疫组化和特殊染色的各个环节进行严格的质控，对技术人员和病理医师进行培训，保证准确的染色结果和正确的结果判读。

1、免疫组和特殊化染色是特殊的技术，相关操作人员必须经过专门的培训。

2、每一批次的免疫组化和特殊染色必须设阳性和阴性对照，可利用组织中的内对照。

3、必须建立本实验室每种免疫组化和特殊染色的操作规程，并根据染色效果及时更新。

4、更换抗体或试剂后，需要用阳性和阴性组织对新试剂进行有效性验证，并有相应的文字记录和染色切片档案，相关档案保留2年。

5、免疫组化和特殊染色过程中产生的有毒液体应专门回收，严禁随处倾倒。

6、病理医师必须熟悉各种抗体染色结果和特殊染色结果，阳性信号表达部位、其诊断应用范围，以期做到正确的结果判读。

7、免疫组化和特殊染色结果不能作为最终诊断，必须由病理医师结合形态学综合判断，并将染色结果写到病理报告中。

按免疫组化和特殊染色工作单要求，及时制片，一般要在1～2个工作日出结果。

常用免疫组化试剂介绍概述免疫组化（IHC）是一门通过检测特定抗原在组织切片中的表达程度来揭示组织形态和细胞化学等方面信息的技术。

由于IHC是一种定性分析技术，所以该方法需要与定量技术（如分子生物学）结合使用，从而得到更准确的数据。

IHC涉及到多种试剂，其标记原理和表现形式各异，能够检测的抗原种类也不同。

本文将对常用的IHC试剂进行介绍，以此为指导，让大家更好地了解和应用IHC技术。

常用的免疫组化试剂抗原修复试剂抗原修复试剂（Antigen Retrieval）用于在组织样本中使细胞内蛋白与抗体亲和性和特异性增加。

这种试剂可通过热处理（如高压）或化学处理（如酶样蛋白和酸性处理）来复原被检测抗原的结构和功能。

常用的抗原修复试剂包括：EDTA、Tris、Citrate等。

原位杂交试剂原位杂交试剂（In Situ Hybridization）可检查DNA或RNA分子的特异性结合情况。

这种试剂可将RNA等分子与特定热稳定的蛋白质结合，用于检测基因突变等。

常用的原位杂交试剂包括：流式胶体金试剂、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、双链RNA原位杂交等。

细胞计数试剂细胞计数试剂（Cell Counting）用于获得细胞数量或结构变化。

这种试剂通常用于确定某一类细胞的数量、细胞计数和分离、细胞生长和分裂的应用。

常用的细胞计数试剂包括：皮质醇、14C-labeled thymidine等。

细胞信号转导试剂细胞信号转导试剂（Cell Signaling）用于研究细胞分子级别的通讯系统，并采取措施以确定物质在细胞内的作用机理。

常用的细胞信号转导试剂包括：抗体、试剂原和阻断类似物等。

同型抑制剂同型抑制剂（Isotype Control）用于在IHC实验中作为实验设计的对照组，以检测所观察的抗原与探测剂结合的特异性表现。

常用的同型抑制剂包括：IgG1、IgG2a和IgG2b等。

情况控制试剂情况控制试剂（Condition Control）用于确定IHC试验的最佳条件，包括温度、缓冲液、酸碱程度等。

[分享] 免疫组织化学染色技术法医学院官大威第一节常规组织学染色技术概述宏观微观超微结构基因水平组织形态学研究技术的种类：一、病理大体组织标本的染色方法在标本制作中，为了某种特殊目的，突出显示标本的重要部分，借助组织切片的特殊染色方法对标本进行染色，将病变器官及不同组织成分用染料染成不同的颜色，以便于区分大体标本的不同成分和病变特点，如：目的：主要用于心、肝、肾脂肪变性，动脉粥样硬化大体标本的染色试剂：苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ结果：病变处脂肪组织呈橙黄色目的：显示早期心肌梗死的区域试剂：0.1% NBT(硝基四唑蓝) / 0.2 mol / L PBS(pH 7.6)方法：将2-3 mm 厚新鲜心肌大片放入试剂中，37 °C 孵育20 min。

结果：正常心肌呈蓝色，早期心肌梗死区、纤维结缔组织、瘢痕组织呈浅蓝色或不显色。

注意：新鲜标本，尸检心肌不超过6小时。

二、光学显微镜下的组织学染色方法.常规HE染色（hematoxylin and eosin staining）.组织学特殊染色1. Mallory 三染色、Masson三染色2. 神经纤维的镀银染色3. 其他的特殊染色，包括钙、铁、铅、铜、黑色素和脂褐素、细胞DNA和RNA的染色等上述的各种染色方法只能在细胞水平上显示组织结构的形态改变。

三、超微结构的观察.光线波长的限制，光学显微镜的分辨率极限为0.2μm有效放大倍数最高不超过2000倍。

电镜的分辨率最佳可达0.14nm，放大倍率最高可达100万倍。

第二节免疫组织化学染色技术Immunohistochemical technique由于该技术主要是用于研究和观察细胞中的某些结构或分子物质和组织细胞间的成分，因此现又称为免疫细胞化学技术。

根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为：1. 免疫荧光细胞化学技术2. 免疫酶细胞化学技术3. 免疫铁蛋白技术4. 免疫金-银细胞化学技术5. 免疫电子显微镜技术一、免疫组织化学染色方法的原理.抗原（antigen）1. 定义：是一类在适合条件下能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结合反应的物质。

免疫显色试剂说明书【产品名称】免疫显色试剂【包装规格】【预期用途】在免疫组化反应或原位杂交反应中与首要抗原抗体结合，通过染色，将靶点进行标记。

【检测原理】免疫显色试剂是二步法免疫组化试剂盒，适合与兔或鼠源一抗配用。

其主要过程为，一抗与切片中的靶抗原形成抗原抗体复合物，酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物与抗原抗体复合物中的一抗结合，再利用辣根过氧化物酶催化二氨基联苯胺（DAB）在抗原部位形成棕色显色。

由于该系统不含生物素和链亲和素，所以不受内源性生物素干扰，染色背景非常清晰。

【主要组成成分】其他需要但未提供的材料：PBST缓冲液（pH7.2-7.4）、纯化水、酒精、脱蜡液、苏木素染色液、中性树胶、塑料湿盒、染色缸、染色架等。

【储存条件及有效期】储存条件：2-8℃，有效期18个月。

请在开瓶3个月内使用。

生产日期、有效期至：见标签。

【样本要求】常规经福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片。

【检测方法】常规脱蜡水化：石蜡切片经常规脱蜡和水化。

抗原热修复：参照一抗说明书进行抗原修复。

DAB工作液的配制：按每毫升DAB缓冲液（试剂D）中加入50μL DAB色原（试剂C）（约1滴）的比例配制DAB工作液，DAB工作液应现配现用。

配制好的DAB 工作液需在2小时内使用，如出现沉淀，使用前先混匀。

操作步骤：1）抗原修复完毕后自然冷却的切片，用自来水清洗。

2）除去切片上组织周围的液体，用免疫组化笔圈定玻片上的待测组织区域并放入PBST缓冲液中。

3）取出切片，除去PBST缓冲液，滴加内源性过氧化物酶阻断剂（试剂A）（视切片大小以完全覆盖切片组织为宜），于组织上孵育10分钟，用PBST清洗切片。

4）除去PBST缓冲液，滴加100μL左右一抗工作液（视切片大小以完全覆盖切片组织为宜），于组织上进行孵育（按照各自一抗说明书操作）。

一抗孵育完毕，用PBST清洗切片。

5）除去PBST缓冲液，每张切片加酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物（试剂B）100μL左右（视切片大小以完全覆盖切片组织为宜），室温下孵育30分钟。

常用免疫组化试剂介绍一、用于鉴别诊断(一)上皮源性:1、细胞角蛋白/cytokeratin、CK:目前,商品化得细胞角蛋白有20多种,不同得分子量代表不同类型得上皮标志。

通常将CK分为两大类型:Ⅰ型(低分子量);Ⅱ型(高分子量)。

理论上讲,大多数单层上皮表达低分子量得C K;复层上皮多表达高分子量得CK;移形上皮(膀胱)与假复层上皮(呼吸道得被覆上皮)既表达低分子量得CK,也表达高分子量得CK。

在癌组织中,低分子量得CK多在腺癌中表达,高分子量得CK多在鳞癌中表达。

目前为止,未发现任何一种上皮只含有一种CK,某些上皮可含210种不同分子量得CK。

因此,目前试图应用单一得CK免疫表型来确定某种特定得上皮性肿瘤就是不可能得。

同样,应用CK来区别腺癌、类癌与间皮瘤也就是困难得。

因此,CK得免疫组化结果判断就是一个较为复杂得问题,在应用这类标记物作为腺癌与鳞癌得鉴别应特别注意。

有必要时,应联合用多种CK加以综合判断。

CK得阳性表达还包括有间变癌、双向分化得滑膜肉瘤、脊索瘤、胚胎癌、间皮瘤、上皮样肉瘤、胸腺瘤等。

CK得阴性表达有:副节瘤单向分化得滑膜肉瘤、软骨(肉)瘤、精原细胞瘤、淋巴瘤、脑膜瘤、恶黑、恶纤组、软组织肉瘤(除特殊类型外)。

在判断CK免疫组化结果时应注意几点:(1) CK得单克隆抗体优于多克隆抗体;(2) CK常出现斑点状得假阳性反应,应注意识别;(3) 虽然大多数CK多在胞浆表达,但CK17多在胞核表达;(4) 绝大多数CK抗体需用胰酶消化,可增加阳性表达率与染色强度;(5) 部分非上皮性肿瘤(平滑肌肉瘤)可见有CK表达,在诊断时应注意;(6) 淋巴结、扁桃体与脾组织中得滤泡外得网织细胞含有CK8与18以及desmin,在判断淋巴结转移癌与肌源性肉瘤转移时应根据组织学综合判断。

2、上皮膜抗原(epithelial membrane antigen/EMA):EMA就是上皮细胞分泌得一种乳脂小球膜糖蛋白,广泛存在于人体各种上皮细胞中(也存在于间皮细胞、浆细胞、组织细胞与T细胞淋巴瘤中),其分布与角蛋白相似,但对内脏腺上皮优于细胞角蛋白,尤其就是分化差得癌EMA有时可呈强阳性表达。

常用免疫组化试剂介绍完整版免疫组化试剂是一类用于检测细胞和组织中特定分子的试剂。

它们能够与目标分子发生特异性的结合反应，通过显色、荧光等方式实现目标分子的定位和检测。

常用的免疫组化试剂有抗体、底物、荧光染料等。

下面将详细介绍常用的免疫组化试剂。

一、抗体单克隆抗体：单克隆抗体是由单个克隆的B细胞分泌的抗体组成。

它们具有更高的特异性和一致性，适用于特定的免疫组化实验。

单克隆抗体一般通过酶联免疫吸附试验或杂交瘤技术获得。

二、底物底物是一种被特定酶催化后能够产生染色或荧光信号的化学物质。

在免疫组化实验中，常用的底物有DAB、VIP、AP、HRP等。

DAB：DAB（3,3'-二氨基联吡啶）是一种常用的免疫组化染色底物。

当DAB与过氧化物酶结合后，在特定条件下会产生棕色沉淀物，用于检测目标分子的位置。

VIP：VIP（维珍纳胶体阳离子）是一种特殊的底物，其在经过过氧化物酶催化后，形成带有阳离子电荷的胶体颗粒。

VIP用于染色后，可以形成黑色沉淀物。

AP：AP（碱性磷酸酶）是一种常用的底物，可以和特定基质反应生成可见或荧光信号。

AP基质有两种常用的类型，一种是快速红色溶液（Fast Red），另一种是紫色溶液。

HRP：HRP（过氧化物酶）是一种广泛使用的底物，在过氧化物酶的作用下可以产生明亮的荧光或染色信号。

HRP染色通常呈现为褐色或黑色。

三、荧光染料荧光染料是一种通过吸收特定波长的光线并在另一个波长下发射荧光的化合物。

免疫组化实验中常用的荧光染料有FITC、TRITC、Cy3、Cy5等。

FITC：FITC（荧光异硫氰酸酯或荧光同硫氰酸酯）是一种常用的绿色荧光染料，其在激发波长为488nm的波长下产生绿色荧光。

TRITC：TRITC（荧光异硫氰酸酯）是一种常用的红色荧光染料，其在激发波长为568nm的波长下产生红色荧光。

Cy3：Cy3是一种荧光发色团，其在激发波长为550nm的波长下产生黄绿色荧光。

Cy5：Cy5是一种荧光发色团，其在激发波长为650nm的波长下产生红色荧光。

免疫组织化学染色试剂免疫组织化学染色试剂是一种用于免疫组织化学染色的特殊试剂，通过与目标分子发生特异性反应，可使其在组织切片上呈现出明显的颜色反应，从而实现对目标分子的定位和定量分析。

免疫组织化学染色试剂主要包括抗体、底物和显色剂三个主要组成部分。

抗体是免疫组织化学染色的核心，其具有高度的特异性，能够与目标分子发生特异性结合。

根据所需检测的目标分子不同，可选择相应的一抗或二抗进行染色。

底物是抗体与目标分子结合后的标记物，一般通过与抗体结合的酶或荧光染料作为标记物，使其在组织切片上呈现出明显的染色信号。

显色剂是底物与标记物反应后形成的可见颜色产物，通过显色剂的作用，可以直观地观察和分析目标分子的分布和表达水平。

在免疫组织化学染色中，常用的试剂有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等酶标记试剂，以及荧光素酶、碱性磷酸酶和荧光染料等荧光标记试剂。

HRP和AP是常用的酶标记试剂，其优点是灵敏度高、信号稳定，适用于常规显微镜观察。

荧光标记试剂具有高度的灵敏度和多色选择性，适用于荧光显微镜观察。

免疫组织化学染色试剂的选择要根据实验需求和目标分子的特性来确定。

首先要选择合适的抗体，确保其与目标分子具有高度的特异性和亲和力。

其次，根据实验的目的和所需的信号强度，选择合适的标记物和显色剂。

最后，根据实验的具体要求和条件，选择适当的染色方法和试剂浓度，以确保最佳的染色效果。

免疫组织化学染色试剂在生命科学研究中起着重要的作用。

通过对组织切片的染色，可以实现对目标分子的定位和定量分析，从而揭示其在组织中的表达和分布特点。

免疫组织化学染色技术广泛应用于免疫学、细胞生物学、肿瘤学、神经科学等领域的研究中，为疾病的发生机制和治疗提供了重要的实验依据。

免疫组织化学染色试剂是一种重要的实验工具，能够实现对目标分子在组织切片中的定位和定量分析。

通过选择合适的抗体和标记物，以及优化试剂浓度和染色方法，可以获得清晰、准确的染色结果。

经常使用免疫组化试剂介绍宇文皓月一、用于鉴别诊断(一)上皮源性：1. 细胞角蛋白/cytokeratin.CK：目前，商品化的细胞角蛋白有20多种，分歧的分子量代表分歧类型的上皮标记。

通常将CK 分为两大类型：Ⅰ型（低分子量）；Ⅱ型（高分子量）。

理论上讲，大多数单层上皮表达低分子量的CK；复层上皮多表达高分子量的CK；移形上皮（膀胱）和假复层上皮（呼吸道的被覆上皮）既表达低分子量的CK，也表达高分子量的CK。

在癌组织中，低分子量的CK多在腺癌中表达，高分子量的CK多在鳞癌中表达。

目前为止，未发现任何一种上皮只含有一种CK，某些上皮可含2-10种分歧分子量的CK。

因此，目前试图应用单一的CK免疫表型来确定某种特定的上皮性肿瘤是不成能的。

同样，应用CK来区别腺癌、类癌和间皮瘤也是困难的。

因此，CK的免疫组化结果判断是一个较为复杂的问题，在应用这类标识表记标帜物作为腺癌和鳞癌的鉴别应特别注意。

有需要时，应联合用多种CK加以综合判断。

CK的阳性表达还包含有间变癌、双向分化的滑膜肉瘤、脊索瘤、胚胎癌、间皮瘤、上皮样肉瘤、胸腺瘤等。

CK的阴性表达有：副节瘤单向分化的滑膜肉瘤、软骨（肉）瘤、精原细胞瘤、淋巴瘤、脑膜瘤、恶黑、恶纤组、软组织肉瘤（除特殊类型外）。

在判断CK免疫组化结果时应注意几点：（1）CK的单克隆抗体优于多克隆抗体；（2）CK常出现黑点状的假阳性反应，应注意识别；（3）虽然大多数CK多在胞浆表达，但CK17多在胞核表达；（4）绝大多数CK抗体需用胰酶消化，可增加阳性表达率和染色强度；（5）部分非上皮性肿瘤（平滑肌肉瘤）可见有CK表达，在诊断时应注意；（6）淋凑趣、扁桃体和脾组织中的滤泡外的网织细胞含有CK8和18以及desmin,在判断淋凑趣转移癌和肌源性肉瘤转移时应根据组织学综合判断。

2.上皮膜抗原（epithelial membrane antigen/EMA）：EMA是上皮细胞分泌的一种乳脂小球膜糖蛋白，广泛存在于人体各种上皮细胞中（也存在于间皮细胞、浆细胞、组织细胞和T细胞淋巴瘤中），其分布与角蛋白相似，但对内脏腺上皮优于细胞角蛋白，尤其是分化差的癌EMA有时可呈强阳性表达。

免疫组化（Immunohistonchemistry)是应用免疫学基本原理—抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。

主要应用于以下方面：恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断；确定转移性恶性肿瘤的原发部位；对某类肿瘤进行进一步的病理分型；软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类,因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤的诊断是不可缺少的；发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定；为临床提供治疗方案的选择.
服务内容
（1）组织标本的固定和石蜡包埋
（2）石蜡标本或冰冻标本的切片
(3）常规或特殊病理切片染色
（4）组织/细胞标本的免疫组化检测
(5）图片拍照及图片分析、数据统计
客户提供
组织或石蜡组织切片；细胞爬片;一抗
我们提供
（1）免疫组化所需的试剂
（2)免疫组化结果（实物）
（3)实验结果图片
（4)完整的实验过程及实验报告
服务内容
(1）组织标本的固定和石蜡包埋
（2)石蜡标本或冰冻标本的切片
（3）常规或特殊病理切片染色
（4）组织/细胞标本的免疫组化检测
(5）图片拍照及图片分析、数据统计
客户提供
组织或石蜡组织切片；
细胞爬片；
一抗
我们提供
（1）免疫组化所需的试剂
（2)免疫组化结果（实物)
（3）实验结果图片
（4）完整的实验过程及实验报告。

常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。

常用试剂有：1、0.01M(pH7.4)的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS），稀释抗体和洗片子用；2、清洁液、纯水，洗玻片用3、多聚赖氨酸处理载玻片，防止脱片4、固定液：4%多聚甲醛；5、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋；6、抗原修复液：枸橼酸缓冲液（pH6.0）；7、H2O2，灭活内源性过氧化物酶8、血清清蛋白（BSA）封闭液；9、显色液：根据酶来选择，如果是HRP就用DAB，如果是AKP，就用NBT/BCIP，免疫荧光则不需要10、树胶封片液一般的sp法步骤啊,具体如下：1. 烤片，68℃，20分钟,2. 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min3.阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；4. 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。

5. 正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗.6. 滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;8. DAB/ H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。

1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。