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参考教案：酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（ —D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非还原性双糖（蔗糖）的1，2-糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
由于果糖甜度高 ,约为蔗糖1.36～1.60倍 ,在工业上具有较高的经济价值。
可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。
在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。
两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。
尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。
每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量来测定。
一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。
比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。
（本实验以酵母为原料）一、教学目的通过酵母菌扩大培养及蔗糖酶的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子（酶）制备方案设计和开展实践研究的方法，体验从复杂细胞混合物体系中提取纯化酶的基本原理、过程和方法。
本实验为学生提供一个较全面的科学研究实践机会，整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的设计空间和动手机会，有利于培养学生的学习兴趣和从事科学研究的能力。
一、实验目的通过本实验，了解蔗糖酶的活力及其影响因素，探究温度、pH值、抑制剂和激活剂对蔗糖酶活力的影响，为后续研究蔗糖酶的应用提供基础。
二、实验原理蔗糖酶（Invertase）是一种水解酶，能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
本实验采用比色法测定蔗糖酶活力，通过测定在一定条件下，酶催化蔗糖水解生成还原糖的速率，从而反映酶的活力。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蔗糖酶：市售或实验室自备（2）蔗糖：分析纯（3）葡萄糖标准溶液：0.1 mol/L（4）3,5-二硝基水杨酸（DNS）：分析纯（5）盐酸、氢氧化钠：分析纯2. 实验仪器：（1）电子天平（2）恒温水浴锅（3）紫外可见分光光度计（4）移液器（5）试管四、实验方法1. 葡萄糖标准曲线绘制：（1）配制不同浓度的葡萄糖标准溶液（2）将各浓度葡萄糖溶液分别加入试管中，加入适量DNS试剂，沸水浴5分钟（3）冷却后，在540 nm波长下测定吸光度（4）以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线2. 蔗糖酶活力测定：（1）配制酶反应体系：取一定量的蔗糖溶液，加入适量蔗糖酶，置于恒温水浴锅中（2）每隔一定时间取样，加入DNS试剂，沸水浴5分钟（3）冷却后，在540 nm波长下测定吸光度（4）根据标准曲线计算还原糖浓度（5）根据酶反应体系中蔗糖浓度和反应时间，计算酶活力3. 影响蔗糖酶活力的因素：（1）温度对蔗糖酶活力的影响：在不同温度下测定酶活力（2）pH值对蔗糖酶活力的影响：在不同pH值下测定酶活力（3）抑制剂对蔗糖酶活力的影响：加入一定浓度的抑制剂，测定酶活力（4）激活剂对蔗糖酶活力的影响：加入一定浓度的激活剂，测定酶活力五、实验结果与分析1. 葡萄糖标准曲线绘制根据实验结果，绘制葡萄糖标准曲线，相关系数R²为0.998，表明曲线拟合度良好。
2. 蔗糖酶活力测定在不同反应时间下，酶活力随时间延长而增加，说明蔗糖酶具有催化活性。
3. 影响蔗糖酶活力的因素（1）温度对蔗糖酶活力的影响：在40℃时，酶活力最高，随着温度升高或降低，酶活力逐渐下降。
第1篇一、实验目的1. 理解蔗糖酶的催化原理和特性。
2. 掌握蔗糖酶的提取、纯化方法。
3. 学习通过不同方法测定蔗糖酶的活力。
4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。
二、实验原理蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
本实验旨在通过提取、纯化蔗糖酶，并测定其活力，了解蔗糖酶的特性。
三、实验材料与试剂1. 材料：- 酵母细胞- 淀粉- 蔗糖- 还原糖试剂（如班氏试剂）2. 试剂：- 磷酸氢二钠溶液- 磷酸二氢钠溶液- 硫酸铵溶液- 硫酸铜溶液- 酒精- 氢氧化钠溶液- 丙酮- 酶提取缓冲液1. 蔗糖酶的提取：- 将酵母细胞用磷酸缓冲液洗涤，并悬浮于磷酸缓冲液中。
- 使用匀浆机破碎细胞，收集匀浆液。
- 将匀浆液离心，收集上清液即为蔗糖酶粗提液。
2. 蔗糖酶的纯化：- 将蔗糖酶粗提液用硫酸铵溶液进行盐析，收集沉淀。
- 将沉淀用磷酸缓冲液溶解，并使用凝胶过滤柱进行纯化。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 将纯化后的蔗糖酶与蔗糖溶液混合，在适宜的温度下反应。
- 加入还原糖试剂，观察颜色变化，根据颜色变化判断蔗糖酶的活力。
五、实验结果与分析1. 蔗糖酶的提取：- 通过匀浆和离心，成功提取出酵母细胞中的蔗糖酶。
2. 蔗糖酶的纯化：- 通过盐析和凝胶过滤柱，成功纯化出蔗糖酶。
3. 蔗糖酶活力的测定：- 在适宜的温度下，蔗糖酶能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
- 加入还原糖试剂后，溶液颜色发生变化，表明蔗糖酶具有活力。
4. 影响蔗糖酶活性的因素：- 温度：在一定范围内，温度升高，蔗糖酶的活力增加。
- pH值：在一定范围内，pH值升高，蔗糖酶的活力增加。
- 抑制剂：某些物质（如重金属离子）可以抑制蔗糖酶的活力。
1. 本实验成功提取和纯化了蔗糖酶，并测定了其活力。
2. 实验结果表明，温度和pH值是影响蔗糖酶活性的重要因素。
3. 在实际应用中，需要根据具体情况进行酶活性的调控，以获得最佳催化效果。
七、实验结论1. 蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。
一、实验目的1. 了解蔗糖酶的特性和功能；2. 掌握蔗糖酶提取和纯化的方法；3. 学习测定蔗糖酶活力和专一性的实验技术；4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。
二、实验原理蔗糖酶是一种水解酶，可以将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。
本实验通过提取和纯化蔗糖酶，测定其活力和专一性，并分析影响其活性的因素。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：酵母菌、蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素、麦芽糖等；2. 实验试剂：氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸铜、硫酸锌、碘液、斐林试剂等；3. 实验仪器：旋光仪、离心机、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计、移液器、容量瓶、烧杯、试管等。
四、实验步骤1. 蔗糖酶提取（1）将酵母菌接种于含有葡萄糖的培养基中，37℃培养24小时；（2）收集培养液，离心分离菌体；（3）将菌体悬浮于磷酸缓冲溶液中，加入一定量的氯化钠和磷酸氢二钠，超声波破碎菌体；（4）离心分离酶液，得到粗提蔗糖酶。
2. 蔗糖酶纯化（1）将粗提蔗糖酶溶液通过硫酸铵分级沉淀法进行纯化；（2）收集沉淀，用磷酸缓冲溶液溶解，透析去除小分子物质；（3）通过凝胶过滤色谱法进一步纯化蔗糖酶。
3. 蔗糖酶活力测定（1）采用硫酸铜法测定蔗糖酶活力，以葡萄糖生成量为指标；（2）设置不同浓度的蔗糖溶液，在特定条件下测定酶活力；（3）绘制酶活力曲线，确定最适酶浓度和反应时间。
4. 蔗糖酶专一性实验（1）将蔗糖酶分别作用于蔗糖、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素、麦芽糖等底物；（2）通过比色法测定反应产物的生成量；（3）分析酶对不同底物的催化效率，确定蔗糖酶的专一性。
5. 影响蔗糖酶活性的因素实验（1）考察pH、温度、离子强度等因素对蔗糖酶活性的影响；（2）设置不同pH、温度、离子强度等条件，测定酶活力；（3）分析影响蔗糖酶活性的因素。
五、实验结果与分析1. 蔗糖酶提取和纯化通过超声波破碎菌体和离心分离，成功提取出粗提蔗糖酶。
经过硫酸铵分级沉淀、透析和凝胶过滤色谱法，纯化得到较高纯度的蔗糖酶。
![蔗糖合成酶的测定方法[方案]](https://img.taocdn.com/s1/m/a87931ec6529647d272852dc.png)
蔗糖合成酶的测定方法[方案]蔗糖合成酶的测定方法一、仪器设备冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计二、试剂HEPES-NaOH(50mmol/L，pH7.5)缓冲液，包括50mmol/L MgCI;2mmol/LEDTA;20.2%(W/V)BSA;2%PVP;0.1%间苯二酚:称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。
30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖三、操作方法1、粗酶液制备称取0.5g样品(植物叶片去掉主叶脉)，洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH缓冲液，冰浴研磨，10000×g离心10min。
2、酶活性测定依次加入50μL粗酶液，50μLHepes-NaOH缓冲液pH7.5，20μL 50 mmol/LMgCI， 220μL 100mmol/L UDPG，20μL 100mmol/L6-磷酸果糖(20μL 100mmol/L果糖)， 30?中反应30min后，加入200μL 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1% 间苯二酚，摇匀后置于80?水浴保温10min，冷却后置于480nm 处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。
同时取50μL粗酶液，加入200μL 2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。
3、蔗糖标线制作:取0、40、80、120、160、200μg/ml的蔗糖溶液50μL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。
4、计算,1,1样品中酶活性(μg?g?h)=式中 C—反应液催化产生的蔗糖总量(μg);V—提取酶液时加入的缓冲液体积(ml); 1V—酶反应时加入的粗酶液体积(ml) 2淀粉酶活性的测定1方法1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液:0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液:用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制;标准麦芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2mol?L-1 NaOH溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000 mL。
1. 掌握从酵母中提取蔗糖酶的基本方法。
2. 了解酶的提取、纯化及活力测定的原理和操作。
3. 掌握酶活性测定的方法。
二、实验原理蔗糖酶（Invertase）是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。
本实验采用酵母作为原料，通过破碎细胞、离心、沉淀、透析等步骤提取蔗糖酶，并对其进行活力测定。
三、实验材料与仪器材料：1. 酵母（安琪酵母粉）2. 蔗糖3. 葡萄糖4. 果糖5. 磷酸盐缓冲液（pH6.0）6. 3，5-二硝基水杨酸（DNS）仪器：1. 电子天平2. 离心机3. 恒温水浴锅4. 分光光度计5. 试管6. 烧杯7. 移液器1. 酵母细胞的制备：- 称取1g酵母粉，加入10ml磷酸盐缓冲液（pH 6.0），搅拌均匀，置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。
- 将保温后的酵母悬液以3000r/min离心10分钟，收集上清液。
2. 酶液的提取：- 向上清液中加入等体积的50%饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，置于4℃冰箱中过夜。
- 将沉淀物以3000r/min离心10分钟，收集上清液即为粗酶液。
3. 酶液的透析：- 将粗酶液置于透析袋中，置于磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中透析过夜，以去除硫酸铵等小分子杂质。
4. 酶液的活力测定：- 取1ml蔗糖溶液（2%蔗糖溶液），加入1ml透析后的酶液，置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。
- 取0.5ml反应液，加入2ml DNS试剂，沸水浴5分钟。
- 取出后，加入4ml蒸馏水，在540nm波长下测定吸光度。
五、实验结果与分析1. 酶液活力测定结果：- 通过DNS试剂显色，根据吸光度计算出酶的活力。
2. 结果分析：- 通过对比不同处理条件下的酶活力，分析提取、纯化过程中酶活力的影响因素。
六、实验结论1. 通过本实验，成功从酵母中提取了蔗糖酶。
2. 酶的提取、纯化过程中，酶活力受到pH、温度、离子强度等因素的影响。
3. 透析法是一种有效的酶纯化方法，可以去除小分子杂质，提高酶的纯度。
酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究一、蔗糖酶的制备1、提取称取14.997g干酵母粉于250ml小烧杯中，少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。
成糊状后加入1.499g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀。
再于35℃恒温水浴中搅拌30min，然后补加30ml蒸馏水，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜。
之后，1000r/min离心10min，抽取酯层后再次离心，得到无细胞提取液。
用1M HCl将其PH调至5.0，即可得到级分Ⅰ。
（取出3ml于冰箱中保存）2、热处理（1）盛有粗级分Ⅰ的离心管放入50℃水浴中保温30min，在保温过程中不断轻摇离心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，1000r/min离心10min。
（3）上清液即为热级分Ⅱ。
（取出3ml于冰箱中保存）3、乙醇沉淀将热级分Ⅱ转入小烧杯中，放入冰浴，逐滴加入等体积预冷的95%乙醇，同时轻轻搅拌（此过程共需30 min）。
然后在冰浴中静置10 min，以沉淀完全。
然后4℃，1000r/min离心10min。
倾去上清，并滴干。
将沉淀保存于离心管中，冷冻保存，此即级分Ⅲ。
二、蔗糖酶的纯化将3ml级分Ⅲ加入洗脱柱中进行梯度洗脱。
及洗脱峰图如下：三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定（一）还原糖含量测定1、各级分稀释倍数的确定级分Ⅰ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）级分Ⅱ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）级分Ⅲ：取50μl稀释至15ml（300倍）取20μl稀释至2ml（100倍）释100倍。
在上述表格中，Glu含量是由标准曲线求得的，E'=Glu含量*稀释倍数/（10 min*0.6 ml）Units=0.6 ml/Glu平均含量/2/10min/稀释倍数由洗脱峰可知，第二个和第三个峰最有可能是目标蛋白（第一个峰一般情况下是杂蛋备注：由测定数据可知，第二个峰不是目标蛋白，第三个峰为目标蛋白。
（二）蛋白质含量测定1、各级分稀释倍数的确定由以上数据可知，级分Ⅰ和级分Ⅱ不需稀释，级分Ⅲ需稀释5倍。
一、目的了解植物组织中提取蔗糖酶的方法，掌握蔗糖酶活力测定的原理。
二、原理本实验以Nelson 方法测定酶活力，其原理是：蔗糖酶可将非还原性的蔗糖水解为葡萄糖和果糖，而葡萄糖作为还原糖含有的自由醛基，在碱性溶液中将Cu 2+ 还原，还原糖本身被氧化成羟酸；砷钼酸试剂与氧化亚铜生成蓝色复合物（砷钼蓝），在510nm 波长下有正比于还原糖浓度的光密度，从而确定蔗糖酶的活力，该法测定的范围为25~200μg。
三、主要仪器及试剂四、操作步骤1．标准曲线制作（1）取9 个具塞试管，按表1 加样：（2）向每管中加1mL Nelson 试剂，盖上塞子，置沸水浴中20 min。
冷至室温，向每管中加1 mL 砷钼酸试剂。
（3）5 min 后，向每管中加7mL 蒸馏水，混匀。
（4）在510 nm 下测定光密度，以还原糖葡萄糖为横坐标，以OD510nm 值为纵坐标，制作标准曲线。
2．酶活力测定取2g 小麦苗，加入2mL 乙酸缓冲液，在冰浴中用研钵研磨成糊状，12 000r/min 离心10min，留取上清液用于酶活测定。
取2 支具塞刻度试管，向每个试管中加入乙酸缓冲液0.8ml，0.5 mmol/L 蔗糖溶液0.2mL，适当稀释的酶液1mL，以同样处理但不加酶液者为空白对照，室温下放置10min。
然后向每管中加1mL Nelson 试剂，置沸水浴中20min。
冷却至室温，向每管中加1mL 砷钼酸试剂，5min 后，向每管中加7mL 蒸馏水，510 nm 下比色，测定光密度OD510nm。
五、实验结果活力计算：在室温、pH4.5 条件下，每分钟水解产生1μmol 葡萄糖所需的酶量，定义为酶的1 个活力单位（U）酶活力的影响教师：XXX实验类型：基础学时：10(参考)内容：一、实验目的初步掌握用正交表设计实验方案并用数理统计方法处理实验数据的步骤和注意事项。
二、实验原理酶的催化作用受多种因素的影响。
欲求某因素对酶活力的影响，通常是固定其它因素，测定该因素不同水平下的酶活力。
