筛选目的基因的方法(一)

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高考生物三轮复习回归教材 ：选择性必修3之基因工程

基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。

第1节 重组DNA技术的基本工具

一、有关核酸的方向性问题

①核苷酸：1’碳连碱基；2’碳（脱氧核糖连无氧；核糖有氧）；3’碳连羟基（-OH）；5’碳连磷酸

②一条脱氧核苷酸链（DNA单链）: 一端的3’碳上有游离的羟基（-OH），叫3’端；另一端的5’碳上有游离的磷酸基团，叫5’端。一条核糖核苷酸链（RNA链）也是如此。

③ DNA是由两条脱氧核苷酸链，按反向平行的方式构成

④ DNA聚合酶：总是从引物的3’端连接脱氧核苷酸（沿着模板链的5’-3’方向合成子链）

⑤ RNA聚合酶：总是从引物的3’端连接核糖核苷酸（沿着模板链的5’-3’方向合成子链）

⑥ tRNA的3’端结合氨基酸

⑦ 翻译时核糖体的移动方向：沿着mRNA的5’-3’方向移动

⑧ 限制性内切核酸酶识别的序列：沿5’-3’方向读取

二、重组DNA技术的基本工具

（一）限制性内切核酸酶——“分子手术刀”

1、来源：主要是原核生物

2、对原核生物的作用：防止外来病原物的侵害,将外源DNA切割保证自身安全

3、作用：识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。

结果：切割DNA成为两个DNA片段

识别的序列：①沿5’-3’方向读取；②大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数4个、8个。；③多数为回文序列（因此，切割形成的黏性末端碱基序列：既相同，又互补）

黏性末端：当限制酶在它识别序列的中心轴线(图中虚线）两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端；

平末端：当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。

（二）DNA连接酶——“分子缝合针”

第2节 基因工程的基本操作程序

一、目的基因的筛选与获取

1．培育转基因抗虫棉的四个步骤

(1)目的基因的筛选与获取。

(2)基因表达载体的构建。

(3)将目的基因导入受体细胞。

(4)目的基因的检测与鉴定。

2．目的基因的筛选与获取

目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。主要指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。

(1)筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。

(2)利用PCR获取和扩增目的基因

①PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在生物体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。

②目的：快速扩增目的基因。

③原理：DNA半保留复制。

④基本条件：DNA模板、4种脱氧核苷酸、2种引物、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液。

⑤过程

a．变性：当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链。

b．复性：温度下降至50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。

c．延伸：温度升至72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

⑥结果：每一次循环后，目的基因的量可以增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n，n为扩增循环的次数)。

⑦鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

⑧仪器：PCR扩增仪。

(3)在获得转基因产品的过程中，还可以通过构建基因文库来获取目的基因。

【强化记忆】

图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答：

(1)图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？

提示 第3轮。

(2)图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。

遵ＩＳＳ付ＮＨＥＲＥＤＩＴＡｓ（Ｂｅｉｊｉｎｇ．）２００８年－．１２０２５３－９７７２ＷＷＷｃｈｉｎａｇｅｎｅｃｎ月，３。‘１２）：１６４。一１６４６技术与方法及小习万灞

ＤＯＩ：ｌＯ．３７２４，ＳＰ．Ｊ．１００５．２００８．０１６４０

基因芯片筛选差异表达基因方法比较

单文娟，童春发，施季森

南京林业大学国家林业局、江苏省林木遗传和基因工程重点实验室，南京２１００３７

摘要：使用计算机模拟数据和真实的芯片数据，对８种筛选差异表达基因的方法进行了比较分析，旨在比较不同方法对基因芯片数据的筛选效果．模拟数据分析表明，所使用的８种方法对均匀分布的差异表达基因有很好的识别、检出作用。算法方面，ＳＡＭ和Ｗｉｌｃｏｘｏｎ秩和检验方法较好；数据分布方面，正态分布的识别效果较好，卡方分布和指数分布的识别效果较差。杨树ｃＤＮＡ芯片分析表明，ＳＡＭ、Ｓａｍｒｏｃ和回归模型方法相近，而Ｗｉｌｃｏｘｏｎ秩和检验方法与它们有较大差异．

关键词：基因芯片；杨树；差异表达

Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓ－ｓｉｏｎｉｎｍｉｃｒｏａｒｒａｙｄａｔａ

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目的基因的亚克隆（subcloning）-1

所谓亚克隆就是对已经获得的目的片段进行重新，其目的在于对目的进行进一步分析，或者进行重组改造等。亚的基本过程包括：(1)目的片段和载体的制备； (2)目的片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。

一、试剂准备

1．LB液体培养基：胰化蛋白胨（细菌培养用）10g，酵母提取物（细菌培养用） 5g，NaCl 10g，加ddH2O 至1000ml，完全溶解，分装小瓶，15lbf/in2高压灭菌20min。

2．1.5%琼脂LB固体培养基: 称取1.5g琼脂粉放入300ml锥形瓶,加100ml LB，15 lbf/in2 高压灭菌20min，稍冷却，制备平皿。

3．IPTG、X-Gal

4．0.1M MgCl2 ：15 lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。

5．0.1M CaCl2（以20%甘油水溶液配制）：15 lbf/in2高压灭菌20min，0℃冰浴备用。

6．限制性核酸内切酶、T4 连接酶。

二、目的片段和载体的制备

选择适宜的限制性核酸内切酶，消化已知目的和载体，获得线性，用于重组。根据目的和载体的具体情况，选择一种或者两种适当的限制酶切割，分别产生对称性粘性末端（用一种限制性内切酶进行消化而产生带有互补突出端）、不对称粘性末端（用两种不同的限制性内切酶进行消化而产生带有非互补突出端）、平端。在亚时，首选不对称相容末端连接，次选对称性粘性相容性末端连接，由于平末端连接效率较低，通常很少采用。但有时目的片段的末端与载体不匹配 ，一般先将不匹配末端补平，然后再以平末端连接。（实验操作同前述）

三、利用T4 连接酶 进行目的片段和载体的体外连接

外源片段末端性质 连接要求 连接结果

不对称粘性末端 两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率 载体与外源连接处的限制酶切位点常可保留；非重组的背景较低；外源可以定向插入到载体中。