丹参总酚酸纯化工艺研究摘要：目的：优化并确定丹参总酚酸大孔树脂纯化的最佳工艺。
方法：以丹参酚酸B含量为考察指标，对大孔树脂纯化工艺参数进行了考察。
结果：研究确定大孔吸附树脂最佳工艺条件为：选用AB-8树脂，以10倍药材量，30%乙醇作为洗脱溶媒，洗脱速度以1mL/min为宜，丹参样品上样浓度为0.5g生药/mL，吸附流速以1mL/min，最大上柱体积为60mL为宜。
结论：大孔树脂吸附法是丹参总酚酸纯化工艺的有效方法。
关键词：丹参；丹参总酚酸；大孔树脂引言丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge的干燥根茎，其有效成分包括水溶性成分和脂溶性成分[1]。
丹参是活血化瘀的常用中药，广泛应用于治疗心血管疾病的中药复方中。
水溶性丹参酚酸类是丹参的主要有效部位之一,具有抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化和改善记忆功能障碍等作用[2]，是治疗冠心病的主要有效成分[3-4]，其中丹酚酸B约70%。
丹参水溶性成分的提取方法多采用水提醇沉法, 此方法溶剂消耗大，有效成分有明显损失。
本研究采用分离效果较好的大孔树脂分离技术，对丹参总酚酸进行纯化研究。
1 材料与方法1.1材料与仪器对照品丹参酚酸B，中国药品生物制品检定所提供；丹参购于江西省樟树中药材市场；AB-8，D101， NKA-9型大孔吸附树脂；Agilent 1200型液相色谱仪，VWD检测器，含在线真空脱气机、四元梯度泵、柱温箱；色谱数据的采集与处理由Agilent 化学工作站完成；超声波清洗仪；电子天平（十万分之一）；甲醇为分析纯和色谱纯两种，乙醇；甲酸；水为重蒸馏水等。
1.2 色谱条件与系统适应性试验采用HPLC法测定样品中丹参酚酸B的含量。
取丹参酚酸B对照品适量，精密称定，加流动相制成1mL含丹参酚酸B149.76µg的对照品溶液，分别精密吸取2、4、6、8、12、16、20µL，注入色谱仪，按照以下方法测定：色谱柱：迪马DiamonsiLTM(钻石)C18（5 m，250×4.6mm）；流动相：甲醇－乙腈-0.4%甲酸（37∶7∶56）；检测波长：285nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min。
以对照品的浓度（µg/ml，X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。
得到丹参酚酸B线性方程为：y=1443.8x-4.3685(r=0.9997)，线性范围为0.3744～3.744μg。
该方法线性关系良好，回收率为99.89%。
2 纯化工艺研究2.1纯化方法的比较据文献[5]报道，醇沉法是中药水提取液常用的精制方法，但其对化学成分影响较大，近年来，随着大孔树脂吸附法的兴起，取代传统醇沉法的研究越来越多。
为了确定较好的精制方法，本研究对这两种方法进行了比较，结果见表1。
（1）醇沉法取丹参提取样品液（1g生药材·mL-1）800mL，均分为8份，每份100mL，每份相当于100g生药，加乙醇至含醇量分别为50%、60%、70%、80%，每一浓度平行各做2份。
冷藏过夜，抽滤，滤液定容到500mL，精密吸取5mL至100mL量瓶中，用水稀释至刻度，测定浸膏得率，并用HPLC法测定丹酚酸B的含量。
（2）大孔树脂吸附法取丹参提取样品液（1g生药材·mL-1）200mL，均分为2份，每份100mL，每份相当于100g生药，分别离心（4000r/min，15min），倒出上清液，加适量的水返溶沉淀部分，离心，合并两次离心液，上AB-8型大孔吸附树脂柱（生药量：树脂量=2：1）。
待药液流尽后，加入蒸馏水洗到Molish反应为阴性，再用30%的乙醇洗脱有效成分。
将洗脱液浓缩，定容至500 mL，精密吸取5 mL至100mL量瓶中，用水稀释至刻度，测定浸膏得率，并用HPLC法测定丹酚酸B的含量。
表1 不同的精制方法的比较研究精制方法浸膏得率（%）转移率（%）纯度（%）平均（%）大孔树脂4.30 77.50 39.2239.40 4.36 79.42 39.5980%醇沉12.36 64.89 11.4211.2712.03 61.42 11.1170%醇沉22.88 61.89 5.895.91 22.93 62.50 5.9360%醇沉30.88 83.73 5.905.89 30.11 81.31 5.8850%醇沉38.95 89.92 5.025.01 38.45 88.36 5.00醇沉法浸膏得率明显高于大孔树脂吸附法，且提取物中丹酚酸B的含量较低，不符合除杂精制的要求。
大孔树脂吸附法对丹酚酸B保留率和醇沉法没有很大的差异，但提取物中丹酚酸B的含量将近40%，达到了实验精制的要求，故选用大孔树脂吸附法纯化精制丹参水溶性成分。
2.2大孔树脂纯化工艺参数考察与优化2.2.1大孔树脂的预处理与再生预处理：将大孔树脂用95%乙醇浸泡24小时，再用95%乙醇洗至与水(1：2)混合不产生浑浊，用水漂洗除去杂质并洗至无醇味，以水湿法装柱，用大量的蒸馏水冲洗后备用。
强化再生：使用过的树脂先用95%乙醇洗至流出液无色，用水洗至无醇味，再加入高于树脂层10CM的3%-5%盐酸溶液浸泡2-4小时，然后进行淋洗通柱继用3-4倍树脂体积同浓度的盐酸溶液通柱,然后用净水洗至接近中性；再用3%-5%的氢氧化钠溶液浸泡4小时。
最后淋洗通柱,用同浓度的3-4倍树脂体积的氢氧化钠溶液通柱，最后用净水清洗至pH值为中性,备用。
2.2.2 树脂筛选将0.5g生药/mL(丹酚酸B的浓度为10.88mg/mL)样品液分别通过3种不同型号的已预处理好的树脂柱，进行动态吸附。
用三氯化铁试剂检查流出液，待反应呈阳性时，停止上样，记录上柱量，计算总酚酸吸附量。
树脂柱用水洗脱至洗脱液近无色，再用95%乙醇洗脱至洗脱液无色，测定洗脱液中丹酚酸B含量，将乙醇洗脱液蒸干，称重，计算回收率。
结果见表2。
表2 树脂筛选结果树脂型号树脂用量（g）上样体积(mL)浸膏总量(mg)丹酚酸B含量(mg)吸附量酚酸B回收率(%)醇洗物酚酸B含量(%)药材计(g/g)指标成分计(mg/g)AB-8 14.9 27 639.75 264.17 0.91 19.72 89.93 41.29 D101 15.0 22 532.50 208.48 0.73 15.96 87.10 39.15 NKA-9 15.0 15 157.75 20.24 0.50 10.88 12.40 12.83 注：吸附量为单位干树脂吸附的总量，单位g/g或mg/g。
下同。
由表2可知，在筛选的3种不同极性的大孔树脂中，用弱极性的AB-8树脂分离纯化丹参酚酸B的效能明显优于其它2种树脂，故选用AB-8树脂纯化丹参水溶性成分丹参酚酸。
2.2.3 上样浓度的确定将不同浓度样品液分别通过AB-8树脂柱(20g干树脂)进行动态吸附。
用三氯化铁试剂检查流出液，待反应呈阳性时，停止上样，记录上柱量，计算总酚酸吸附量。
结果见表3。
从表3可知，上样浓度以0.5g生药/mL（丹酚酸B的浓度为10.88mg/mL）为宜。
表3 上样浓度确定上样浓度(g/mL) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0吸附量以药材计(g/g)0.83 0.84 0.86 0.92 0.95 0.87 0.77 0.76 0.72 0.652.2.4 吸附流速确定将浓度为0.5g生药/mL的样品液通过AB-8树脂柱(20g干树脂)，分别以1、2和3mL/min 的流速进行动态吸附。
用三氯化铁试剂检查流出液，待反应呈阳性时，停止上样，记录上柱量，计算总酚酸吸附量。
结果见表4。
从表4可知，吸附流速以1mL/min为宜。
表4 吸附流速确定吸附流速(mL/min) 1 2 3吸附量以药材计(g/g) 0.93 0.80 0.682.2.5 泄漏曲线考察按上述所确定的吸附条件，取样品液通过AB-8树脂柱（36g干树脂），进行动态吸附，弃去前10mL流出液后开始分段收集。
每10mL收集1份，共收集11份。
每份流出液精密吸取1mL，加蒸馏水稀释至50mL，测定丹酚酸B的含量。
结果见表5。
据此绘制泄漏曲线(图1)。
表5 泄漏曲线考察结果流份(序号) 体积(mL) 丹酚酸B的浓度(mg/mL)1 20 0.0392 30 0.0113 40 0.0164 50 0.0605 60 0.3236 70 1.6687 80 2.9718 90 4.0139 100 5.78010 110 7.07511 120 7.165图1 泄漏曲线从测定结果和泄漏曲线可知，第5份丹酚酸B浓度开始急剧增大，说明此时丹酚酸开始泄漏，故确定样品液最大上柱体积为60mL，计算丹酚酸B最大吸附量为18.65mg/g，相当于0.83g生药材/g干树脂。
2.2.6 洗脱溶媒的选择按上述所确定的吸附条件，取样品液(0.5g生药/mL)30mL上AB-8大孔树脂柱(30g干树脂)，依次用蒸馏水200mL，10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%乙醇各100 mL梯度洗脱，蒸馏水洗脱液收集50mL4份，10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇洗脱液分别收集50mL4份。
测定丹酚酸B含量，以瓶号和丹酚酸B含量为坐标绘制洗脱曲线，见图2。
1-4号水洗脱液5-8号10%乙醇洗脱液 9-12号20%乙醇洗脱液 13-16号30%乙醇洗脱液17-20号50%乙醇洗脱液 21-24号70%乙醇洗脱液 25-28号95%乙醇洗脱液图2 丹酚酸B大孔树脂吸附梯度洗脱曲线图梯度洗脱曲线显示：丹酚酸B主要集中在30%乙醇以前的洗脱液中，其中10%，20%和30%的洗脱液中丹酚酸B总量占全部醇洗脱的88.7%，而三者当中30%乙醇洗脱的解吸速度最快，故选用30%乙醇作为洗脱溶媒。
2.2.7 洗脱流速确定按上述所确定的吸附条件进行动态吸附后，AB-8大孔树脂柱(30g干树脂)先分别用水洗脱至洗脱液近无色，再以50%乙醇为洗脱剂，分别以1、2和3mg/mL的流速进行洗脱。
分别测定乙醇洗脱物中丹酚酸B含量。
结果见表6。
从表6可知，洗脱流速以1mL/min为宜。
表6 洗脱流速的比较洗脱流速（mL/min）洗脱剂用量(mL)浸膏得率(mg)丹酚酸B含量(mg)丹酚酸B含量(%)1 300 620 255.43 41.202 545 644 239.77 37.233 700 690 235.01 34.062.2.8 洗脱曲线考察按上述所确定的吸附和洗脱条件，取样品液50mL(0.5g生药/mL)进行上柱(30g干树脂)、吸附和洗脱，分段收集洗脱液。
收集水洗脱液2份，每份为125mL，30%乙醇洗脱液13份，每份25mL，共收集15份。
