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PCR—SSCP分析技术及其应用
张学;孙开来
【期刊名称】《国外医学：遗传学分册》
【年(卷),期】1992(015)005
【摘要】PCR-SSCP(聚合酶链反应—单链构象多态)分析是一种 DNA 单链凝胶电泳技术。
它根据形成不同构象的等长 DNA 单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。
该项技术具有简便、快速、敏感和适于大样本筛查等优点,可用于检测单碱基置换、数碱基插入或缺失等基因变异。
在以 PCR 为基础的各项基因变异检测技术中,PCR-SSCP 分析倍受青睐,现已被广泛用于癌基因和抗癌基因突变的鉴定、遗传病的致病基因分析和基因诊断、基因制图等领域。
【总页数】7页(P225-231)
【作者】张学;孙开来
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R446.9
【相关文献】
1.PCR-SSCP技术在基因多态分析中的应用 [J], 汤贤春;路健;李学英
2.PCR-SSCP技术分析线粒体DNA多态性及其法医学应用 [J], 张明阳;单海燕;徐冬冬;丁梅;王保捷;庞灏;周勤虎;冯春梅
3.应用PCR-RFLP及PCR-SSCP技术研究我国水稻条纹病毒RNA4基因间隔区的变异 [J], 魏太云;林含新;吴祖建;林奇英;谢联辉
4.应用PCR—SSCPs,PCR—RFLPs技术检测猪氟烷基因 [J], 方美英;姜志华
5.PCR-RFLP和PCR-SSCP技术在肠杆菌科食源性感染致病菌鉴定中的应用 [J], 胡玉山;王鸣;杜琳;莫自耀;洪帮兴;江丽芳
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PCR-SSCP原理及应用随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是PCR技术问世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展.如不对称PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length PolymorPhism，RFLP)等等已成为基因分析的有力工具.但这些方法操作比较繁琐，局限性较大，或要求实验条件高，不适合一般临床实验室使用.1989年问世的PCR-SSCP(下文称SSCP)作为检测基因突变的方法，经不断地改进和完善，更为简便、快速、灵敏，不但用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入，而且还被用于DNA定量分析，监测PCR诊断实验中的交*污染情况，以及传染源的调查等.由于SSCP的突出的优点，近几年被大量地应用.一、SSCP的原理及特点日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性(Single-Strand Conformation PolymorPhism，SSCP)分析.在随后的研究中，作者又将SSCP 用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性.其基本过程是:①PCR扩增靶DNA;②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变.该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要.但它也有不足之处.例如，只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检.尽管如此该方法和其他方法相比仍有较高的检测率.首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变.Takao，经实验证明小于300bP的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来.另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯.用这种方法可以最终从DNA 序列水平上鉴别突变DNA片段.二、SSCP的不断改进SSCP技术自创立以来，经历了自身发展和完善的过程，刚建立时是将同位素掺入PCR 扩增物中，通过放射自显影来显示结果.这给该技术的推广造成一定的困难，随着DNA 银染方法与PCR-SSCP结合，尤其是直接溴乙锭染色方法的应用，使得该方法大大简化. 最近，SSCP值得注意的改进是将DNA-SSCP分析，改为RNA-SSCP分析，其基本原理是: RNA有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高了检出率，其突变检出率可达90%以上.另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色.但该方法增加了一个反转录过程;还需要一个较长的引物，内含有启动RNA聚合酶的启动序列，从而相对地增加了该方法的难度.为了进一步提高SSCP的检出率，可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合.其中与杂交双链分析(HeterocluPlex analysis，Het)法结合可以大大提高检出率.Het法是用探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开.对同一靶序列分别进行SSCP和Het 分析可以使点突变的检出率接近100%，而且实验简便.三、PCR-SSCP的实验操作在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:DNA片段长度(核苷酸数) (%)1Kb～700b 3.5700b～500b 5500b～200b 8200b 12在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入1×TbE封闭，备用.2)电泳取10μlPCR产物，加入10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后将水相全部上样，10-15℃下电泳.开始在300V电压下电泳5min，然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含0.5ug/ml溴化锭的1×TbE缓冲液中染色30--45min，在紫外灯下观察，或进行银染.3)银染法将PAG板用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次，然后浸入 1.5%NaOH和0.4%甲醛溶液中显色7min.最后，用0.75%NaCO3终止显色.四、SSCP的应用自从Orita等用SSCP进行人类DNA多态性分析以来，该方法大量地用于检测和肿瘤发生有关的基因突变，例如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的P53基因的突变、肺癌的ras基因突变等.最近Sugano等用银染色SSCP法，成功地检测了c-Ki-ras2基因第12位的突变，电泳和银染色过程在 2.5小时内完成.SSCP还用于检测引起人类遗传性疾病的研究上，如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤1型基因、家族性结肠息肉基因的研究中.最近，Sharkar等用RNA-SSCP法检测了28名b 型血友病患者的凝血因子IX的基因序列，并与DNA-SSCP和直接基因测序法进行了比较，发现在全长2.6kbP的凝血因子IX基因组中，有20处碱基点突变，RNA-SSCP可检测出其中的70%，而DNA-SSCP只能检测出35%，显示了RNA-SSCP比DNA-SSCP有更高的灵敏性.#P#分页标题#e#SSCP法除大量地用于基因突变的检测外，还用于病毒的分型、监测PCR 实验中的污染情况、以及病原体传播途径的研究中.YaP用巢式PCR对来自不同国家和地区的HbV标品进行了检测，并对扩增产物进行了SSCP分析，发现每个标本的SSCP图谱完全不同，不仅证明了HbVDNA具有地区性变异，而且排除了交*性污染的可能性，为保证PCR诊断结果的可靠性找到了好方法.另外，YaP等还将SSCP用于DNA定量分析上，他们将SSCP 与竞争性PCR法相结合进行乳腺癌细胞突变P53基因的定量分析，并取得了初步成功. 该方法的优点在于，内标和待测DNA只有一个碱基不同，这样使内标和待测DNA有相同的扩增条件，从而更准确地测出DNA的量.从以上可以看出，SSCP正在分子生物学领域发挥着巨大的作用.五、SSCP注意的事项SSCP是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法，为了使SSCP 达到最佳效果，应注意下列事项.①重复性.影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变，SSCP图谱可保持良好的重复性.一般SSCP图谱是二条单链DNA带，但有时有的DNA片段可能只呈现一条SSDNA带，或者三条以上，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的立体构象.有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果.②靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链的高，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bP以下)情况下，DNA的长度不会影响SSCP 的效果.他们仔细选择了实验条件，发现354bP的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以上.③电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象，SSCP应在较低温度下进行(一般4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时，开始的5min应用较高的电压(250V)，以后用100V 左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.④DNA片段中点突变的位置对SSCP的影响点突变在DNA和RNA中的位置对SSCP检测率的影响，取决于该位置对维持立体构象作用的大小，而不是仅仅取决于点突变在DNA链上的位置(有人认为点突变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来).White曾设计了一组样品DNA 片段，并将其中的点突变设在DNA链的中部，而且该点又正处在发夹结构顶端的环上，结果发现SSCP只能检测出9个样品中的2个(检出率为22%)，说明DNA链中任何部位的突变，只要对其单链立体构象没有影响，都有可能被漏检.⑤SSCP的结果断定:由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这种分离不能反映出分子量的大小.有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难看出两者之间的差别.因此一般要求电泳长度在16--18cm以上，以检测限为指标来判定结果.检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值.大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化.例如，一般检测限定为3mm，那么当两带间距离在3mm以上，则说明两链之间有改变.另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性结果.另外，SSCP 分析中其它条件，如PCR产物的上样量，PAG的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具体实验进行选择确定.总之，SSCP分析法是一种快速、简便、灵敏的突变检测方法，适合临床实验室的要求.它可以检测各种点突变，短核苷酸序列的缺失或插入.随着SSCP分析不断完善，它将成为基因诊断研究的一个有力工具PCR-SSCP技术－哈尔滨医科大学实验原理聚合酶链式反应-单链构象多态（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）技术是在PCR技术基础上发展起来的，它是一种简单、快速、经济的用来显示在PCR反应产物中单碱基突变（点突变）的手段。
探讨结核分枝杆菌耐药检测及其临床意义作者：徐涛来源：《健康必读（上旬刊）》2019年第09期【摘; 要】结核病是我国乃至全球都十分严重的疾病类型，据WTO2016年统计数据显示，全球共有1040万结核病患者，当年死亡人数130万。
在新增的结核病患者中，耐多药性结核病患者数量居多。
因此，对耐药结核病耐药性检测、诊断和治疗成为当前结核病防控的重点。
本文对分枝杆菌耐药机制概述，讨论药物敏感性检测方法，并分析分枝杆菌药敏检测结果的临床价值，希望对相关研究提供支持。
【关键词】结核分枝杆菌;耐药检测;临床意义【中图分类号】R446.5;;;;; 【文献标识码】A;;;;; 【文章编号】1672-3783（2019）09-0090-01耐药结核病（TB）在世界范围内都是临床医学长期以来难以攻坚的难题，其中耐多药结核病和广泛耐药结核病对TB防控起到重要的影响。
结核分枝杆菌（Mtb）主要的耐药机制是药物代谢酶编码基因变异或者药物作用靶标导致的。
常见的临床Mtb药物敏感性检测主要是分子药敏方法和表型药敏方法，以下就相关内容做出综述。
1 分枝杆菌耐药机制对于Mtb耐药机制来说，目前依然没有取得整体上的研究进展，不过依然在一些方面取得了研究成果，见表一：2 药物敏感性检测方法在当今的临床检测方法中，只利用一种药物敏感性檢测不具有检测意义，往往会利用多达数十种的药物敏感检测方法结合药物耐药基因型的分子药敏方法，通过该检测方法可以实现优势互补，耐药TB检测效果显著提升。
表型检测这种方法需要一定的观察时间去培养，观察Mtb的生长情况可以分析起耐药性，这种检测方法也是对药物耐药性检测的基本准则，虽然部分药物的检测时间较长，但是可以对多种药物的耐药情况分析。
具体说来：2.1 传统的药敏试验方法建立在含抗结核药物的固态培养基的基础上，可以对Mtb的生长情况检测，同时也可以判断药物的敏感性，主要方法为绝对浓度法以及比例法，WHO倡导我国使用比例法为DST的标准，结果显示耐药菌比率超过1%就说明具有耐药性，目前已经有相关药物在临床使用。
耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用(一)【摘要】目的探讨耐多药结核病（MDR-TB）临床分离株rPOB、KatG 和rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值。
方法采用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术分析了54株同时耐异烟肼（INH）、利福平（RFP）、链霉素（SM）的多耐药临床分离株和45株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变。
结果以结核分支杆菌H37RV为对照，45株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常，其特异性为100%；KatG基因有2株图谱异常，特异性为95.6%。
89株结核分支杆菌临床分离株均未发现rPOB、KatG、rpsL基因缺失，其PCR扩增产物SSCP分析结果表明：54株多耐药临床分离株中，49株rPOB基因图谱异常；32株KatG基因图谱异常；40株rpsL基因图谱异常。
其敏感性分别为rPOB(90.7%)、KatG(59.3%)，rpsL(74.1%)。
结论结核分支杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致。
PCR-SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的方法之一。
【关键词】结核分支杆菌；rPOB基因；KatG基因；rpsL基因；SSCP；药物耐受性Studies of Mycobacterium tuberculosis multi-drug resistant gene【Abstract】 Objective To eva luat the importance of rPOB、KatG and rpsL gene mutation detection in multi-drug resistant clinicalisolates of Mycobacterium tuberculosis. Methods rPOB、KatG and rpsL gene mutation of 54multi-drug resistant clinical isolates，which is INH RFP and Sm resistance and 54 drug susceptible strains were analyzed using polymerase chain reaction-single strand conformation (PCR-SSCP).Results SSCP pattern of H37RV strain as control，SSCP pattern of rPOB，rpsL PCR amplification from drug susceptible strains were all the same as control. The specificity was 100%. However，the different SSCP pattern of KatG gene were found in 2 susceptible strains. The specificity was 96.3%. Gene deletion of rPOB、KatG and rpsL were not found in all clinical isolates tested. SSCP patterns of rPOB gene were different from control in 49 drug resistant clinical isolates. SSCP patterns of KatG gene were different from control in 32drug resistant clinical isolates，SSCP pattern of rpsL gene were different from control in 40 drug resistant clinical isolates. The sensitivity were 90.1% (rPOB)，59.3% (KatG) and rpsl (74.1%)，respectively. Conclusion The major mechanism of RFP，INH，SMresistant drug was rPOB、KatG and rpsL gene mutation，respectively PCR-SSCP may be one of the way which applied to drug resistant detection of Mycobacterium tuberculosis.【Key words】 Mycobacterium tuberculosis；rPOB gene；KatG gene；rpsL gene；SSCP；drug tolerance我国是结核病疫情最严重的国家之一，其主要原因是耐药（DR-TB）和耐多药（MDR-TB）结核病的广泛分布和迅速传播。
PCR-SSCP技术在植物病理学上的应用随着分子生物学技术的发展，检测鉴定基因变异的方法不断涌现。
尤其是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)技术问世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因变异研究。
限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)以及随机扩增片段长度多态性(ran-domam plified polymorphic DNA, RAPD)等方法已成为基因变异分析的有力工具。
但这些方法或实验条件要求较高，操作比较繁琐，局限性较大。
1989年Orita提出的单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism, SSCP)作为一种检测基因突变的方法, 经不断改进和完善, 更为简便、快速、灵敏, 可用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入。
1 SSCP技术的基本原理在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中，单链DNA的迁移率除与DNA长度有关外，更主要决定于DNA单链所形成的空间构象，相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同，PCR产物经变性后进行DNA凝胶电泳时，每条单链处于一定的位置，靶DNA中若发生碱基缺失、插入或置换时，就会出现泳动变位，从而提示该片段的基因变异存在。
该法自1989年首次报告以来，已广泛用于人类癌基因、抑癌基因和遗传病相关突变的快速检测。
Amplified mutant and wild-type alleles of exon 8from the p53 gene. Separation by SSCP run at aconstant 30 W for 3.5 hours at 8 °C in 1x TBE on an8% acrylamide/bis gel (37.5:1) with 3.5% glycerol.Lane 1, undenatured mutant allele; lane 2, mutantallele; lane 3, wild-type allele; lane 4, undenaturedwild-type allele.2 PCR-SSCP技术的优点原理和操作简单，不需要特殊仪器，技术容易掌握；实验步骤少，周期短；成本低，所用试剂均价格低廉；可用非同位素法检测；适用于大样品筛选。
PCR –SSCP技术综述摘要：聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)是基于PCR 的单链构象多态性分子标记技术。
PCR-SSCP作为检测基因突变的方法，自创立以来，经历了自身发展和完善的过程。
刚建立时是将同位素掺入PCR扩增物中，通过放射自显影来显示结果，这给该技术的推广造成一定的困难。
随着DNA银染方法与PCR-SSCP结合，尤其是直接溴乙锭染色方法的应用，使得该方法大大简化，操作更为简单，局限性较小，实验条件要求不高，适合一般临床实验室使用，具有简便、快速、灵敏的特点。
不但被用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入，而且还可用于动物育种，微生物，寄生虫研究的多个领域。
由于SSCP的突出的优点，近几年被大量地应用。
文章介绍PCR-SSCP的原理和方法，优点与缺点，技术的优化和应用级展望。
关键词：PCR-SSCP；原理；方法；优缺点；展望Abstract：Polymerase chain reaction - single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) is a PCR-based single-strand conformation polymorphism molecular markers. PCR-SSCP as a method to detect gene mutations, since its inception, has experienced its own development and improvement process. When is the isotope incorporation newly created objects in the PCR amplification, by autoradiography to show results, which may cause some difficulty to the promotion of the technology. Silver staining DNA with PCR-SSCP method binding, especially as a direct method of staining with ethidium bromide so that the simplified method, the operation is simpler, less limitations, the experimental conditions do not ask for general clinical laboratory use, with simple, rapid, sensitive features. Not only is used for detection of gene deletions and point mutations and insertion of short sequences, but also for animal breeding, microbes, parasites research in many fields. As the outstanding advantages of SSCP, are extensively used in recent years. This paper introduces the principles and methods of PCR-SSCP, advantages and disadvantages, optimization, and application-level prospect technology.Key word：PCR-SSCP;Principles; method; advantages and disadvantages; outlook基因单核苷酸多态性(SNP)是指基因组中单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。
PCR-SSCP原理及应用随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是PCR技术问世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展.如不对称PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length PolymorPhism，RFLP)等等已成为基因分析的有力工具.但这些方法操作比较繁琐，局限性较大，或要求实验条件高，不适合一般临床实验室使用.1989年问世的PCR-SSCP(下文称SSCP)作为检测基因突变的方法，经不断地改进和完善，更为简便、快速、灵敏，不但用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入，而且还被用于DNA定量分析，监测PCR诊断实验中的交*污染情况，以及传染源的调查等.由于SSCP的突出的优点，近几年被大量地应用.一、SSCP的原理及特点日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性(Single-Strand Conformation PolymorPhism，SSCP)分析.在随后的研究中，作者又将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性.其基本过程是:①PCR扩增靶DNA;②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变.该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要.但它也有不足之处.例如，只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检.尽管如此该方法和其他方法相比仍有较高的检测率.首先，它可以发现靶DNA 片段中未知位置的碱基突变.Takao，经实验证明小于300bP的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来.另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯.用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段.二、SSCP的不断改进SSCP技术自创立以来，经历了自身发展和完善的过程，刚建立时是将同位素掺入PCR 扩增物中，通过放射自显影来显示结果.这给该技术的推广造成一定的困难，随着DNA 银染方法与PCR-SSCP结合，尤其是直接溴乙锭染色方法的应用，使得该方法大大简化. 最近，SSCP值得注意的改进是将DNA-SSCP分析，改为RNA-SSCP分析，其基本原理是: RNA 有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高了检出率，其突变检出率可达90%以上.另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色.但该方法增加了一个反转录过程;还需要一个较长的引物，内含有启动RNA聚合酶的启动序列，从而相对地增加了该方法的难度.为了进一步提高SSCP的检出率，可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合.其中与杂交双链分析(HeterocluPlex analysis，Het)法结合可以大大提高检出率.Het法是用探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开.对同一靶序列分别进行SSCP和Het 分析可以使点突变的检出率接近100%，而且实验简便.三、PCR-SSCP的实验操作在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:DNA片段长度(核苷酸数) (%)1Kb～700b 3.5700b～500b 5500b～200b 8200b 12在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入1×TbE封闭，备用.2)电泳取10μlPCR产物，加入10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后将水相全部上样，10-15℃下电泳.开始在300V电压下电泳5min，然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含0.5ug/ml 溴化锭的1×TbE缓冲液中染色30--45min，在紫外灯下观察，或进行银染.3)银染法将PAG板用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次，然后浸入1.5%NaOH 和0.4%甲醛溶液中显色7min.最后，用0.75%NaCO3终止显色.四、SSCP的应用自从Orita等用SSCP进行人类DNA多态性分析以来，该方法大量地用于检测和肿瘤发生有关的基因突变，例如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的P53基因的突变、肺癌的ras基因突变等.最近Sugano等用银染色SSCP法，成功地检测了c-Ki-ras2基因第12位的突变，电泳和银染色过程在2.5小时内完成.SSCP还用于检测引起人类遗传性疾病的研究上，如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤1型基因、家族性结肠息肉基因的研究中.最近，Sharkar等用RNA-SSCP法检测了28名b 型血友病患者的凝血因子IX的基因序列，并与DNA-SSCP和直接基因测序法进行了比较，发现在全长2.6kbP的凝血因子IX基因组中，有20处碱基点突变，RNA-SSCP可检测出其中的70%，而DNA-SSCP只能检测出35%，显示了RNA-SSCP比DNA-SSCP有更高的灵敏性.#P#分页标题#e#SSCP法除大量地用于基因突变的检测外，还用于病毒的分型、监测PCR实验中的污染情况、以及病原体传播途径的研究中.YaP用巢式PCR对来自不同国家和地区的HbV标品进行了检测，并对扩增产物进行了SSCP分析，发现每个标本的SSCP图谱完全不同，不仅证明了HbVDNA具有地区性变异，而且排除了交*性污染的可能性，为保证PCR诊断结果的可靠性找到了好方法.另外，YaP等还将SSCP用于DNA定量分析上，他们将SSCP 与竞争性PCR法相结合进行乳腺癌细胞突变P53基因的定量分析，并取得了初步成功. 该方法的优点在于，内标和待测DNA只有一个碱基不同，这样使内标和待测DNA有相同的扩增条件，从而更准确地测出DNA的量.从以上可以看出，SSCP正在分子生物学领域发挥着巨大的作用.五、SSCP注意的事项SSCP是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法，为了使SSCP达到最佳效果，应注意下列事项.①重复性.影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变，SSCP 图谱可保持良好的重复性.一般SSCP图谱是二条单链DNA带，但有时有的DNA片段可能只呈现一条SSDNA带，或者三条以上，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的立体构象.有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果.②靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链的高，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bP以下)情况下，DNA的长度不会影响SSCP 的效果.他们仔细选择了实验条件，发现354bP的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以上.③电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象，SSCP应在较低温度下进行(一般4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时，开始的5min应用较高的电压(250V)，以后用100V左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.④DNA片段中点突变的位置对SSCP的影响点突变在DNA和RNA中的位置对SSCP检测率的影响，取决于该位置对维持立体构象作用的大小，而不是仅仅取决于点突变在DNA 链上的位置(有人认为点突变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来).White 曾设计了一组样品DNA片段，并将其中的点突变设在DNA链的中部，而且该点又正处在发夹结构顶端的环上，结果发现SSCP只能检测出9个样品中的2个(检出率为22%)，说明DNA链中任何部位的突变，只要对其单链立体构象没有影响，都有可能被漏检.⑤SSCP的结果断定:由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这种分离不能反映出分子量的大小.有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难看出两者之间的差别.因此一般要求电泳长度在16--18cm以上，以检测限为指标来判定结果.检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值.大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化.例如，一般检测限定为3mm，那么当两带间距离在3mm以上，则说明两链之间有改变.另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性结果.另外，SSCP 分析中其它条件，如PCR产物的上样量，PAG的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具体实验进行选择确定.总之，SSCP分析法是一种快速、简便、灵敏的突变检测方法，适合临床实验室的要求.它可以检测各种点突变，短核苷酸序列的缺失或插入.随着SSCP分析不断完善，它将成为基因诊断研究的一个有力工具.。
PCR-SSCP直接检测临床标本中的结核杆菌rpoB基因突变——附50例报告彭理年;肖瑜;董德琼;杨渝浩;徐荣鑫【期刊名称】《新医学》【年(卷),期】2001(32)6【摘要】目的:探讨聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)直接检测痰标本中的结核杆菌核糖核酸聚合酶亚单位基因(ropB基因,该基因突变便形成结核杆菌利福平耐药株)突变在评价结核杆菌对利福平的耐药性方面的应用价值.方法:以结核杆茵H37Rv株(标准菌株)为对照,应用PCR-SSCP技术直接检测50例痰标本中结核杆菌及培养分离的结核杆菌的rpoB基因突变,并将PCR-SSCP和细菌培养的结果进行比较分析.结果:以细菌培养作为参考方法,PCR-SSCP直接检测50例痰标本中的结核杆菌ropB基因突变的敏感性和特异性分别是92%(23/25)和100%(10/10).用于检测培养分离得到的35株结核杆菌,PCR-SSCP的敏感性和特异性分别为96%(24/25)和100%(10/10).结论:PCR-SSCP操作简单、快速、准确,可望用于直接检测临床标本中的结核杆菌ropB基因突变,以评价结核杆菌是否对利福平产生耐药性.【总页数】2页(P340-341)【作者】彭理年;肖瑜;董德琼;杨渝浩;徐荣鑫【作者单位】遵义医学院附属医院;遵义医学院附属医院;遵义医学院附属医院;遵义医学院附属医院;航天部3247医院【正文语种】中文【中图分类】R52【相关文献】1.应用PCR-SSCP技术检测痰中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变的研究 [J], 朱敏;李锋;盛国平;范玉美2.PCR-SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究 [J], 闫国蕊;刘国华;刘传玉3.用PCR-SSCP技术检测结核分支杆菌rpoB, KatG, rpsL基因突变 [J], 黄四邑;邱望龙;潘智灵4.痰以外的临床标本中应用结核杆菌直接检测法（MTD）检出结核杆菌：标本制备方… [J], 闫东杰5.PCR-SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分支杆菌rpoB,katG,ahpC基因突变的研究 [J], 董德琼;杨渝浩;彭理年;肖瑜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
PCR-SSCP原理及应用随着分子生物学技术的发展，检测基因结构和突变的方法不断涌现.尤其是PCR技术问世以后，各种与PCR相结合的基因检测技术进一步推动了基因研究的发展.如不对称PCR产物的直接测序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage，RNAase)、限制性片段长度多态性分析(Restriction Fragment Length PolymorPhism，RFLP)等等已成为基因分析的有力工具.但这些方法操作比较繁琐，局限性较大，或要求实验条件高，不适合一般临床实验室使用.1989年问世的PCR-SSCP(下文称SSCP)作为检测基因突变的方法，经不断地改进和完善，更为简便、快速、灵敏，不但用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入，而且还被用于DNA定量分析，监测PCR诊断实验中的交*污染情况，以及传染源的调查等.由于SSCP的突出的优点，近几年被大量地应用.一、SSCP的原理及特点日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性(Single-Strand Conformation PolymorPhism，SSCP)分析.在随后的研究中，作者又将SSCP 用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性.其基本过程是:①PCR扩增靶DNA;②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变.该方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要.但它也有不足之处.例如，只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检.尽管如此该方法和其他方法相比仍有较高的检测率.首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变.Takao，经实验证明小于300bP的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来.另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯.用这种方法可以最终从DNA 序列水平上鉴别突变DNA片段.二、SSCP的不断改进SSCP技术自创立以来，经历了自身发展和完善的过程，刚建立时是将同位素掺入PCR 扩增物中，通过放射自显影来显示结果.这给该技术的推广造成一定的困难，随着DNA 银染方法与PCR-SSCP结合，尤其是直接溴乙锭染色方法的应用，使得该方法大大简化. 最近，SSCP值得注意的改进是将DNA-SSCP分析，改为RNA-SSCP分析，其基本原理是: RNA有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高了检出率，其突变检出率可达90%以上.另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色.但该方法增加了一个反转录过程;还需要一个较长的引物，内含有启动RNA聚合酶的启动序列，从而相对地增加了该方法的难度.为了进一步提高SSCP的检出率，可将SSCP分析与其它突变检测方法相结合.其中与杂交双链分析(HeterocluPlex analysis，Het)法结合可以大大提高检出率.Het法是用探针与要检测的单链DNA或RNA进行杂交，含有一对碱基对错配的杂交链可以和完全互补的杂交链在非变性PAG凝胶上通过电泳被分离开.对同一靶序列分别进行SSCP和Het 分析可以使点突变的检出率接近100%，而且实验简便.三、PCR-SSCP的实验操作在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:DNA片段长度(核苷酸数) (%)1Kb～700b 3.5700b～500b 5500b～200b 8200b 12在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾).1)制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)按上表制所需的胶液，将梳子插入模子，从梳子一端加入胶，当胶液快到梳齿时，使模子向加胶端倾斜，继续慢慢加胶，边加边放端模子以防止气泡形成，室温放置1h使之凝固.然后拔掉梳子，顶部加入1×TbE封闭，备用.2)电泳取10μlPCR产物，加入10μl变性剂(95%甲酰胺，10mmol/LEDTA0.02%溴酚蓝)、30μl 石蜡油，煮沸5min，取出立刻放入冰浴中2min以上，然后将水相全部上样，10-15℃下电泳.开始在300V电压下电泳5min，然后在120V电泳8h，取下凝胶，将其浸在含0.5ug/ml溴化锭的1×TbE缓冲液中染色30--45min，在紫外灯下观察，或进行银染.3)银染法将PAG板用去离子水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min.用去离子水洗二次，再浸入0.2%AgNO3溶液中10min.用去离子水洗3--5次，然后浸入 1.5%NaOH和0.4%甲醛溶液中显色7min.最后，用0.75%NaCO3终止显色.四、SSCP的应用自从Orita等用SSCP进行人类DNA多态性分析以来，该方法大量地用于检测和肿瘤发生有关的基因突变，例如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的P53基因的突变、肺癌的ras基因突变等.最近Sugano等用银染色SSCP法，成功地检测了c-Ki-ras2基因第12位的突变，电泳和银染色过程在2.5小时内完成.SSCP还用于检测引起人类遗传性疾病的研究上，如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤1型基因、家族性结肠息肉基因的研究中.最近，Sharkar等用RNA-SSCP法检测了28名b 型血友病患者的凝血因子IX的基因序列，并与DNA-SSCP和直接基因测序法进行了比较，发现在全长2.6kbP的凝血因子IX基因组中，有20处碱基点突变，RNA-SSCP可检测出其中的70%，而DNA-SSCP只能检测出35%，显示了RNA-SSCP比DNA-SSCP有更高的灵敏性.#P#分页标题#e#SSCP法除大量地用于基因突变的检测外，还用于病毒的分型、监测PCR 实验中的污染情况、以及病原体传播途径的研究中.YaP用巢式PCR对来自不同国家和地区的HbV标品进行了检测，并对扩增产物进行了SSCP分析，发现每个标本的SSCP图谱完全不同，不仅证明了HbVDNA具有地区性变异，而且排除了交*性污染的可能性，为保证PCR诊断结果的可靠性找到了好方法.另外，YaP等还将SSCP用于DNA定量分析上，他们将SSCP 与竞争性PCR法相结合进行乳腺癌细胞突变P53基因的定量分析，并取得了初步成功. 该方法的优点在于，内标和待测DNA只有一个碱基不同，这样使内标和待测DNA有相同的扩增条件，从而更准确地测出DNA的量.从以上可以看出，SSCP正在分子生物学领域发挥着巨大的作用.五、SSCP注意的事项SSCP是一种快速、简便、灵敏的检测基因突变的方法，为了使SSCP 达到最佳效果，应注意下列事项.①重复性.影响SSCP重复性的主要因素为电泳的电压和温度.这两个条件保持不变，SSCP图谱可保持良好的重复性.一般SSCP图谱是二条单链DNA带，但有时有的DNA片段可能只呈现一条SSDNA带，或者三条以上，这主要是由于两条单链DNA之间存在相似的立体构象.有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果.②靶DNA序列长度的影响在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链的高，这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故.而有人认为在DNA链较短的(400bP以下)情况下，DNA的长度不会影响SSCP 的效果.他们仔细选择了实验条件，发现354bP的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以上.③电泳电压和温度的影响:为了使单链DNA保持一定的稳定立体构象，SSCP应在较低温度下进行(一般4℃-15℃之间).在电泳过程中除环境温度外，电压过高也是引起温度升高的主要原因，因此，在没有冷却装置的电泳槽上进行SSCP时，开始的5min应用较高的电压(250V)，以后用100V 左右电压进行电泳.这主要是由于开始的高电压可以使不同立体构象的单链DNA初步分离，而凝胶的温度不会升高.随后的低电压电泳可以使之进一步分离.在实验中应根据具体实验条件确定电泳电压.④DNA片段中点突变的位置对SSCP的影响点突变在DNA和RNA中的位置对SSCP检测率的影响，取决于该位置对维持立体构象作用的大小，而不是仅仅取决于点突变在DNA链上的位置(有人认为点突变在DNA链中部要比在近端部容易被SSCP检测出来).White曾设计了一组样品DNA 片段，并将其中的点突变设在DNA链的中部，而且该点又正处在发夹结构顶端的环上，结果发现SSCP只能检测出9个样品中的2个(检出率为22%)，说明DNA链中任何部位的突变，只要对其单链立体构象没有影响，都有可能被漏检.⑤SSCP的结果断定:由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量的大小来分离的，而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的，因此，这种分离不能反映出分子量的大小.有时正常链与突变链的迁移率很接近，很难看出两者之间的差别.因此一般要求电泳长度在16--18cm以上，以检测限为指标来判定结果.检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值.大于检测限则判定链的迁移率有改变，说明该DNA序列有变化，小于检测限则说明链之间无变化.例如，一般检测限定为3mm，那么当两带间距离在3mm以上，则说明两链之间有改变.另外检测限不能定的太低，否则主观因素太大，易造成假阳性结果.另外，SSCP 分析中其它条件，如PCR产物的上样量，PAG的交联度、以及胶的浓度等，都应根据具体实验进行选择确定.总之，SSCP分析法是一种快速、简便、灵敏的突变检测方法，适合临床实验室的要求.它可以检测各种点突变，短核苷酸序列的缺失或插入.随着SSCP分析不断完善，它将成为基因诊断研究的一个有力工具PCR-SSCP技术－哈尔滨医科大学实验原理聚合酶链式反应-单链构象多态（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）技术是在PCR技术基础上发展起来的，它是一种简单、快速、经济的用来显示在PCR反应产物中单碱基突变（点突变）的手段。
