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大肠菌群测试片检测操作流程1.样品的前处理:(建议使用蔬菜瓜果、河水及大肠菌群标准菌作为样品)（1）蔬菜瓜果：称取25g样品切成1cm左右的碎片，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min制成1:10的样品匀液。
（2）河水：以无菌吸管吸取25mL河水置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
（3）大肠杆菌标准菌：挑取平板上大肠杆菌标准菌的单菌落，于盛有5mL LB 液体培养基的试管中，37℃培养过夜，以此作为菌原液。
用1mL无菌吸管或微量移液器吸1mL菌原液于盛有9mL的稀释液的无菌试管中，制成1:10的样品匀液。
2.样本稀释倍数：用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL的稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸管尖端不要触及稀释液面），振荡试管或换用一只无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释液需用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCl）调节pH至7.0~7.2。
（1）蔬菜样品的稀释倍数：取100、10-1两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况而定)。
（2）河水样品的稀释倍数：取10-1、10-2两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况而定)。
（3）大肠菌群标准菌的稀释倍数：取10-7、10-8两个进行接种验证(可根据实际情况而定)。
（4）自来水的稀释倍数：直接取自来水接种进行验证。
3.接种一般食品选1～2个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如饮用纯水和矿泉水等）可直接吸取原液进行检测。
将大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL样品匀液垂直加入到测试片中央，用手轻轻将上层盖下，使检测样品液覆盖整个检测圈（应尽量避免产生气泡），静置1 min使培养基凝固，最后用手轻轻将上层盖下。
大肠菌群测试片操作流程1.样品的前处理(建议使用蔬菜瓜果、河水及大肠菌群标准菌作为样品)（1）蔬菜瓜果：称取25g样品切成1cm左右的碎片，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10000r/min均质1min~2min制成1:10的样品匀液。
（2）河水：以无菌吸管吸取25mL河水置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
（3）大肠菌群标准菌：挑取平板上大肠菌群标准菌的单菌落，于盛有5mL LB 液体培养基的试管中，37℃培养过夜，以此作为菌原液。
用1mL无菌吸管或微量移液器吸1mL菌原液于盛有9mL的稀释液的无菌试管中，制成1:10的样品匀液。
2.样本稀释倍数用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL的稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸管尖端不要触及稀释液面），振荡试管或换用一只无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释液必要时用1mol/L氢氧化钠（NaOH）或1mol/L盐酸（HCl）调节pH至7.0~7.2。
（1）蔬菜样品的稀释倍数：取100、10-1两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况记性调整)。
（2）河水样品的稀释倍数：取10-1、10-2两个稀释度进行接种验证(可根据实际情况记性调整)。
（3）大肠菌群标准菌原液的稀释倍数：取10-7、10-8两个进行接种验证(可根据实际情况记性调整)。
（4）自来水的稀释倍数：直接取自来水接种进行验证。
3.接种一般食品选1～2个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如饮用纯水和矿泉水等）可直接吸取原液进行检测。
将大肠菌群测试片置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL样品匀液垂直加入到测试片中央，用手轻轻将上层盖下，使检测样品液覆盖整个检测圈（应尽量避免产生气泡），静置1min使培养基凝固，最后用手轻轻将上层盖下。
大肠菌群的测定方法和步骤嘿，咱今儿就来聊聊大肠菌群的测定方法和步骤。
你说这大肠菌群啊，就像是一群调皮的小精灵，得把它们给找出来，弄清楚它们的情况呢！首先呢，得准备好各种各样的家伙什儿，就像战士上战场得拿好自己的武器一样。
什么培养皿啦、培养基啦，都得齐全咯。
然后呢，就是采样啦。
这可不能马虎，得从要检测的东西里面准确地取到样，就好像去果园里摘果子，得挑那些长得好的摘呀。
接下来就是培养啦。
把取来的样品放到合适的培养基里，给这些大肠菌群创造一个舒适的“家”，让它们能好好地生长。
这就好比给小树苗找了块肥沃的土地，让它们能茁壮成长。
培养的过程中可得细心照料着，温度啦、湿度啦都得控制好。
不然这些小精灵可不乐意好好表现呢。
过了一段时间后，就得去观察啦。
看看培养基上有没有出现那些特征性的菌落。
这就像是在一群孩子里面找那个最调皮的。
要是发现了可疑的菌落，还得进一步去验证呢。
就跟警察破案似的，得找到确凿的证据才能下定论。
最后确定了大肠菌群的情况，咱就能知道这个东西是不是干净卫生啦。
这可关系到大家的健康呢，可不是闹着玩的。
你想想啊，如果吃的东西或者用的东西里面大肠菌群超标了，那会咋样？那肯定会让人不舒服呀，说不定还会生病呢！所以说这个测定大肠菌群的事儿可重要了。
咱平时买东西的时候也得留个心眼，看看是不是经过严格检测的。
别稀里糊涂地就买了那些不靠谱的东西。
总之呢，大肠菌群的测定可不是个简单的事儿，但又特别重要。
咱得重视起来，把这些小精灵都给管得服服帖帖的，让大家都能吃得放心，用得安心，你说是不是？这可不是开玩笑的呀！。
实验8: 食品（饮用水）中大肠菌群的检测（滤膜法）及分离纯化（6学时）一、目的要求1.利用滤膜法测定食品中大肠菌群。
2.掌握分离微生物的基本操作。
二、基本原理1.滤膜法是采用过滤器过滤水样，使其中的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜放在适当的培养基上进行培养，大肠菌群可直接在膜上生长，从而可直接计数。
所用滤膜是一种多孔硝化纤维膜或乙酸纤维膜，用水系过滤膜即可，其孔径约0.45μm。
2.在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。
得到纯培养的过程称为分离纯化。
三、试验原料及器材实验原料：伊红美蓝琼脂平板或远藤氏琼脂平板，乳糖蛋，蛋白胨，灭菌水，饮用水等；器材：镊子；夹钳；烧杯；真空泵；滤膜；过滤器等。
四、操作步骤1.大肠菌群的检测（1）滤膜灭菌将滤膜放入装有蒸馏水的烧杯中，加热煮沸15分钟，共煮沸三次，前两次煮沸后换水洗涤2—3次再煮，以洗去滤膜上残留的溶剂。
（2）过滤器装置用无菌手续将已灭菌的过滤器基座、滤膜、漏斗和抽滤瓶安装好，其中滤膜用灭菌镊子(浸在95%酒精内，用时通过火焰灭菌)移至过滤器的基座上。
其他可直接用手或夹钳操作，但不要碰到伸入抽滤瓶的橡皮塞部分，以免染菌。
（3）将抽滤瓶接上真空泵。
（4）加水样过滤直径50mm的滤膜，所过滤的水量以培养后长出的菌落数一般需要较多过滤器装置，多于50个为适宜，所以采用多联过滤器最好，可以减少误差。
一般清洁的深井水或经处理过的河水与湖水等可取样 300—500 ml；对比较清洁的河水或湖水，可取样1-100ml；严重污染的水样可先进行稀释；未知的水样可做三个稀释度，选择菌落数合适的稀释度进行计算。
本次实验于过滤器漏斗内加入比较河水或湖水100ml，加盖。
（5）开动真空泵进行油滤。
（6）抽完后，加入等量的灭菌水继续抽滤，目的是冲洗漏斗壁。
（7）滤毕，关上真空泵，用灭菌镊子取滤膜边缘，将没有细菌的一面紧贴在伊红美蓝琼脂平板上。
滤膜与培养基之间不得有气泡。
实验六食品中大肠菌群的测定一、概述(一)大肠菌群的定义及范围根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。
表5-4 大肠菌群生化特性分类表注：+，表示阳性；—，表示阴性；+/-，表示多数阳性，少数阴性。
由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。
(二)大肠菌群的测定意义1、粪便污染的指标细菌早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。
一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。
据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。
若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。
根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。
所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。
当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。
2．粪便污染指标菌的选择作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确的指标作用。
①存在于肠道内持有的细菌，才能显示出指标的特异性。
食品大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测步骤一、培养基制备1、生理盐水氯化钠 8.5g蒸馏水 1000.0ml将氯化钠溶于蒸馏水中，搅拌均匀后用量筒量取225ml分装到各个广口瓶中，1210C高压灭菌15min，备用。
2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤称取37克放入烧杯，将各成分溶解于1000ml蒸馏水中，放电炉子上加热并搅拌均匀，分装于装有倒立发酵管的试管中，每管10ml，装完盖帽，1210C高压灭菌15min，双料培养基除蒸馏水不变外，其余成分加倍。
3、样品制备（在无菌室中进行）（1）固体或半固体样品无菌操作称取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分振摇、混匀，制成1：10的样品稀释液备用。
（2）液体样品以无菌吸管吸取样品25g置于装有225ml生理盐水的广口瓶中，充分混匀，制成1：10的样品稀释液备用。
4、样品稀释用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1ml,沿管壁缓慢注于盛有9ml 生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管混匀，制成1：100的样品匀液。
按照该操作程序，可制备1：1000，1：10000。
等10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释一次，换用1次1ml无菌吸管或吸头。
根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
同时分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
二、大肠菌群的测定（MPN法）1、选取适宜的三个连续稀释度的样品匀液，每个稀释度均接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml。
360C+10C培养24h-48h后，观察倒管内是否有气泡产生，并记录24h和48h内产气的LST肉汤管数。
对未产气的试管，可以轻敲试管壁的方式观察是否有较细小的气泡从管底逸出，如果所有LST肉汤管均未产气，可按。
报告结果；如果LST管有产气，则按下面步骤作证实试验。
