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人封闭抗体（BA）试剂盒使用方法检测范围：96T4ng/L - 120ng/L使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中封闭抗体（BA）)含量。
实验原理本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中封闭抗体（BA）水平。
用纯化的人封闭抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被单抗的微孔中依次加入封闭抗体（BA），再与HRP标记的人封闭抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的封闭抗体（BA）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人封闭抗体（BA）浓度。
试剂盒组成1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
封闭抗体阴性淋巴细胞提取流程1.在实验室的无菌条件下，取出外周血样本。
In a sterile laboratory environment, take a peripheral blood sample.2.将外周血样本放入离心管中，轻轻旋转离心管混合均匀。
Place the peripheral blood sample in a centrifuge tube and gently mix by rotating the tube.3.将混合后的外周血样本放入离心机中，以3000 rpm离心10分钟。
Centrifuge the mixed peripheral blood sample at 3000 rpm for 10 minutes.4.取出上清液，放入新的离心管中。
Remove the supernatant and place it in a new centrifuge tube.5.向上清液中滴加等体积的PBS缓冲液，轻轻旋转混合。
Add an equal volume of PBS buffer to the supernatant and gently mix by rotating.6.将混合后的上清液＋PBS溶液放入离心机中，以3000 rpm离心10分钟。
Centrifuge the mixed supernatant + PBS solution at 3000 rpm for 10 minutes.7.取出上清液，弃渣，得到淋巴细胞。
Remove the supernatant, discard the sediment, and obtain lymphocytes.8.将淋巴细胞放入新的离心管中，加入PBS缓冲液洗涤。
Place the lymphocytes in a new centrifuge tube, and wash with PBS buffer.9.重复以上洗涤步骤2-3次，以去除残留的血液成分。
封闭抗体样本制备方法
1.取两支试管，为对照管和测定管；
2.对照管：加入患者配偶（男性）混匀抗凝全血50μl +丈夫血清50μl+CD3/CD 4/CD 8/CD45 单克隆抗体20μl，室温避光孵育20min；
3.测定管：丈夫抗凝全血100μ+患者血清50μl+CD3/CD 4/CD 8/CD45 单克隆抗体20μl，室温避光孵育20min；
4. 每管加入红细胞溶解液0.5ml，充分混匀，室温避光孵育10min；
5.流式分析对照管和测定管CD +3/CD +4 /CD +8 细胞比例；
6.计算公式
封闭效率（%）= 对照管- 测定管CD比例
7.结果判断
①三项中只要有一项出现负值，提示封闭抗体缺乏。
②封闭抗体阳性：三项全部正值，提示正常。
淋巴细胞亚群样本制备方法
1.取两支试管，分别标记为A管和B管；
2.A管加入BD Multitest CD3/CD 4/CD 8/CD45 单克隆抗体20μl到试
管底部；
3.B管加入BD Multitest CD3/CD16+CD56/CD45/CD19 单克隆抗体20
μl到试管底部；
4.分别加入50μl混匀抗凝全血到A、B两管底部，避免让血液污染
管壁；
5.轻轻混匀，室温避光孵育15min；
6.分别加入450μl的1×BD Multitest溶血素，充分混匀，室温避光
孵育15min；
7.涡旋混匀器充分混匀，上机分析。
人外周血淋巴细胞分离操作规程原理：采用密度梯度离心法提取人外周血淋巴细胞用于培养或治疗材料：淋巴细胞分离液、RPMI1640（无血清）/PBS/Hank’s液、RPMI1640完全培养液、刻度离心管、吸管、血球计数板、水平转头离心机等。
步骤：1.将采到的肝素抗凝血取样计数白细胞总数。
2.使用Hank’s液/PBS液/无血清RPMI1640将血样1：1稀释，混匀时要沿管壁吹出，避免产生气泡。
吹匀后于37℃水浴中平衡。
3.从冰箱中取出4℃避光保存的淋巴细胞分离液。
摇匀后在无菌状态下加入刻度离心管中。
操作中尽量避免吸管碰触管壁。
原则上分离液的高度不超过管高的1/4。
4.将盛有分离液的离心管放入37℃水浴中平衡。
5.用吸管将稀释的血液沿离心管壁徐徐加到分离液面上，用力要轻，避免血液冲入分离液中，使得稀释血重叠在分离液面以上，拧紧管盖。
稀释血与分离液的高度比在1：2-2：1之间。
原则上两者的总高度不超过离心管的2/3。
6.将离心管放置于水平离心机中，室温下 2000rpm离心20min。
离心过程中要观察离心速度是否正确，且在停止时选择“no break”，避免因为急剧减速将已经分离的单个核细胞层重新弄混。
注意离心结束时的减速过程，不要太快。
7.离心结束后可见管内分为四层，从上至下分别为：血浆层（含部分血小板）、白膜层（含单个核细胞及少量血小板）、分离液层、粒细胞及红细胞层。
将吸管轻轻穿过血浆层至白膜层，沿离心管周缘吸出血浆层与分离液层界面间的白膜层细胞，置于新离心管中。
尽量少吸取分离液。
8.加吸出体积5倍以上的Hank’s/PBS/无血清RPMI1640液体，用吸管吹打均匀，避免产生气泡，液拄高度不要超过离心管的2/3。
室温1500rpm离心10min，快速倾倒出上清液。
9.用Hank’s/PBS/无血清RPMI1640重悬细胞，注意吹打均匀，不要有细胞团块。
室温下1500rpm离心5min，洗涤两次。
最后一次洗涤时定量加入RPMI1640，吹打均匀后取样计数细胞。
