样本前期处理及HE染色-赵恒

实验二石蜡切片的HE染色2014年2月8日【实验目的】掌握石蜡切片HE染色的基本技术。

【实验原理】HEfHematoxylin and Eosin］染色也称苏木精-伊红染色，是组织学技术的常规染色方法。

苏木精是一种天然香料，它本身并不能染色，在经氧化后变成苏木红才是真正的染料，苏木对细胞核的亲和力并不强，而在媒染剂的帮助下才能较好显示细胞核，此吋细胞核呈红色, 只有在碱性环境中，苏木才变成蓝色。

氧核糖核酸（DNA）两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电的苏木精碱性染料以离子键结合而被染色。

伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷的阳离子结合使胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明对比。

伊红的细胞浆的良好染料。

【预习要求】1.熟悉HE染色的基本过程和原理。

2.HE染色屮的注意事项和常见问题。

3.通过书籍和网络等解答思考题。

【器材与试剂】1.实验器材：银子、染色缸、盖玻片、显微镜、上次切好的睾丸切片。

2.实验试剂：各种浓度的酒精、二甲苯、苏木精染液、伊红溶液、1 %盐酸溶液、氨水、屮性树胶。

常用染液的配制：（1）.埃利希（EhrliCh）氏苏木素染液配制:苏木素2g,无水酒精100ml,甘油100ml, 冰醋酸10ml,钾明矶2〜3 g,蒸馆水100ml,任自然氧化成熟后使用。

（2）. 0.5%水溶性伊红染液的配制：水溶性伊红0. 5g,蒸徭水100mlo（3）. 1%盐酸分化剂配制：盐酸1ml,水99ml。

用于将苏木素过染的部分去掉，使核着色清晰。

（4）.弱碱性水溶液（促兰剂）配制：0.1〜0.25%的氨水或碳酸锂饱和溶液。

【实验步骤】H・E染色的步骤和方法1.染色步骤：（1）切片脱蜡：二甲苯去蜡5〜10分钟，石蜡切片在温箱中烤干即可进入二甲苯脱蜡,遇室温过低吋则应加温脱蜡，石蜡方能溶去，脱蜡不尽不能染色。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910471080.1(22)申请日 2019.05.31(71)申请人 中南大学地址 410083 湖南省长沙市麓山南路932号(72)发明人 王宽松　粟诗童　傅春燕　谢斌　周建华　周训检　禹灿平　马苛文　戚嘉琳　胡祯敏　(74)专利代理机构 长沙朕扬知识产权代理事务所(普通合伙) 43213代理人 钱朝辉(51)Int.Cl.G01N 1/30(2006.01)G01N 1/36(2006.01)(54)发明名称一种HE染色切片的制作方法(57)摘要本发明公开了一种HE染色切片的制作方法，包括以下步骤：将白片烤片、脱蜡、水化、HE染色和封片，所述水化与HE染色之间还包括以下步骤：将水化处理后的白片经过金属离子络合剂溶液处理。

本发明在制作HE染色切片时，水化与HE染色步骤之间增加金属离子络合剂溶液处理，金属离子络合剂能有效减少或消除组织裂缝，使其组织形态更加清晰，并可有效减少细胞固缩、重叠，大大增加了对组织、细胞判读的准确性、可靠性。

权利要求书1页 说明书5页 附图5页CN 110320084 A 2019.10.11C N 110320084A1.一种HE染色切片的制作方法，包括以下步骤：将白片烤片、脱蜡、水化、HE染色和封片，其特征在于，所述水化与HE染色之间还包括以下步骤：将水化处理后的白片经过金属离子络合剂溶液处理。

2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述金属离子络合剂溶液中金属离子络合剂包括EDTA、EDTA盐、柠檬酸或柠檬酸盐中的至少一种，所述金属离子络合剂的浓度为0.0001-0.1mol/L，所述金属离子络合剂溶液的pH值为8.0-9.0。

3.根据权利要求2所述的制作方法，其特征在于，所述金属离子络合剂溶液中金属离子络合剂包括EDTA或EDTA盐。

4.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述金属离子络合剂溶液为经过蒸馏水稀释的EDTA抗原修复液，所述金属离子络合剂溶液的pH值为8.0-9.0。

常规HE染色石蜡包埋的组织切片必须经过脱蜡水洗处理才能染色，让水溶性染料渗入组织中，含蜡的组织切片无法进行任何染色。

所以，在染色前必须用二甲苯或替换剂进行彻底脱蜡，经过乙醇洗后，再用水洗。

即石蜡组织切片→二甲苯→乙醇（无水乙醇，95%，80%）→水。

人们通常把这个过程叫做切片脱蜡至水。

脱蜡至水是染色前的必须完成的基本步骤。

一般脱蜡至水的时间和步骤如下：HE染色脱蜡至水步骤步骤顺序试剂时间1 二甲苯Ⅰ脱蜡 5 min2 二甲苯Ⅱ脱蜡 5 min3 二甲苯Ⅲ脱蜡 5 min4 无水乙醇浸洗 1 min5 95%乙醇Ⅰ浸洗 1 min6 95%乙醇Ⅱ浸洗 1 min7 80%乙醇浸洗 1 min8 自来水冲洗3-5 min冰冻切片和细胞涂片样品的染色不需要经过脱蜡至水步骤，水洗后直接用苏木精和伊红染色。

染色是利用染料的不同作用，使组织与染料以不同方式进行结合。

常规染色是苏木精和伊红染色（H.E）。

特殊染色（special stains）和组织化学（免役组织化学）染色是根据诊断的需要对组织中的某些成分进行非常规的染色。

HE染色用的苏木精是一种树木苏木的一种氧化产品，因为这种树非常罕见，多数氧化苏木精是合成品。

苏木精必须氧化成熟后才能使用。

苏木精染液需要预先配制，放置几个月自然氧化成熟。

或购买成熟过的商品苏木精，也可在苏木精液中加一些成熟剂。

苏木精本身对组织没有染色作用，需要“媒染剂”与组织连接，媒染剂是铁，铝，钨等由这类正离子金属提供。

矾也是苏木精常用的媒染剂，如Harris苏木精的配制以硫酸铝钾（钾明矾）或铵明矾作为媒染剂。

不同媒染剂配制的苏木精染色强度不同。

苏木精作为一种基础染料对细胞核的核酸具有一定的亲和力。

苏木精不是“退行性”就是“进行性”染色，退行性染色是把切片在染液内留一段时间，然后从染液里出来用盐酸乙醇分化，去除过染的一部分。

这种方法最适合大批量的染色。

进行性染色切片在染液中染到自己想要得染色强度。

He染色切片制作（各动物、全过程、操作要点、注意事项）石蜡切片制备基本步骤一、准备工作（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷2、将器皿在自来水下冲洗干净3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。

（二）配制：硫酸洗液的配制清洁液（洗液）的配制：成分强酸液次强酸液弱酸液浓硫酸（ml） 1000 200 100重铬酸钾（mg） 63 120 100蒸馏水（ml） 200 200 1000重铬酸钾1200g蒸馏水 2000ml将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌（三）载玻片与盖玻片的处理1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍3. 95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。

二、常用液体的配制（一）缓冲溶液：1．磷酸盐缓冲液A液：0.1mol/L磷酸二氢钠B液：0.1mol/L磷酸氢二钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）2．枸椽酸缓冲溶液A液：0.1mol/L枸椽酸B液：0.1mol/L枸椽酸钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）（二）固定剂：1．甲醛：10%甲醛福尔马林 100ml蒸馏水 900ml注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。

2．10％中性福尔马林钙固定液甲醛液 10ml蒸馏水 90ml加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。

3．4%多聚甲醛：8%多聚甲醛多聚甲醛8g蒸馏水 100ml加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 免疫组化HE染色FISH ISH现阶段开展的病理实验主要内容：免疫组化 HE染色几种特殊的染色原位杂交荧光原位杂交1/ 32免疫组化1、免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。

2、我们现阶段主要要做的组织免疫组化有石蜡切片、冰冻切片免疫组化以及荧光免疫组化。

细胞免疫组化有细胞爬片、细胞印片和细胞涂片免疫组化和荧光免疫组化。

3、免疫组化过程中抗原修复有高压修复法、酶修复、微波修复，其中微波修复抗原对提高免疫组化阳性检出率非常有效。

4、高压修复和微波修复法中常用的缓冲液有0.01M柠檬酸缓冲液、1mM 的EDTA（pH8.0）。

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 6、酶标抗体系统中的酶与显色剂、复染液的合理选用：（1）辣根过氧化物酶系统（HRP）显色剂一般用DAB、AEC,DAB显色液一般染色部位为棕黄色，AEC显色液一般染色部位为红色；而HRP系统常用的复染液为苏木素，将细胞核染成蓝色。

（2）碱性磷酸酶系统（AP）显色剂一般用BCIP/NBT、固红、固蓝。

最常用的是BCIP/NBT显色液，染色部位为深蓝色或者蓝紫色；该系统常用的复染液为核固红，将细胞核染成红色。

3/ 32免疫组化切片组织前期处理1、组织块大小应限于2cm×1.5cm×0.2cm 。

he染色步骤 HE实验步骤动物病理切片小结[样本处理]动物麻醉后，开胸，暴露心脏，头皮针插入左心室尖，打开37?生理盐水输液装置，从右心耳下沿剪开右心房，灌洗至流出的生理盐水无血(20min)，换4%多聚甲醛固定液灌注(约5min)[固定]4%多聚甲醛固定。

[石蜡切片]取样从固定中取出待切组织，用手术刀切成2mm厚度的小样，装入脱水小盒中，铅笔标号纸条同放入小盒后流水洗30min，蒸馏水浸洗处理Mice:脱水50%乙醇 2-3h170%乙醇 1-2h80%乙醇 1h95%乙醇 2h(1h+1h)100%乙醇 2h(1h+1h)透明二甲苯 35min+35min浸蜡 1h+1h+1h (62?蜡)[HE染色]脱蜡二甲苯? 15min二甲苯? 15min二甲苯:无水乙醇(1:1) 2min无水乙醇? 2min无水乙醇? 2min95%乙醇 2min85%乙醇 2min70%乙醇 2min50%乙醇 2min蒸馏水 5min(如果是DAB染色要抗原修复)HE染色苏木素 6-8min (时间可以延长，现在10-30min)冲洗 1min(反向将载玻片反向冲洗，注意不要脱片)2含1%盐酸的乙醇进行分色(用75%乙醇配)2-3s动作要快氨水反蓝 >10min伊红 10s冲洗固定脱水95%乙醇 2min100%乙醇? 2min100%乙醇? 2min二甲苯? 2min二甲苯? 2min 树胶封片组织浸蜡-常规石蜡切片制作组织经过透明剂的完全透明后，被移放于65?左右熔化的石蜡中，于65?的电热恒温箱中浸渍的过程称为浸蜡。

组织在脱水时，组织中的脂类和类脂等物质在脱水剂的作用下被溶解掉，留下了许多腔隙，许多管腔组织和血管，也有许多腔隙，这些都严重地影响了切片。

组织浸蜡时，由于诱导剂(二甲苯)的作用，石蜡进入到组织的各个角落，并在各个角落中保存下来。

当石蜡包埋后冷却时，这浸入到里3面的石蜡便可起到支撑的作用，而且使组织不致于变形，塌陷等现象，使切片能完整的切出，便于镜下观察。

冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例)（1）冰冻切片室温晾干15分钟；（2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）；（4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5）PBS洗3次，每次10分钟；（6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma公司)，37℃孵育1小时；（7）PBS洗3次，每次15分钟；（8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照；（9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。

`注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥（2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。

附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）：（1）pH7.4 0.01MPBS：配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g0.1MPBS配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O5.9g+NaCl 17g定容至2000ml,高压，pH7.2-7.4（2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存（3）封闭液：10％NGS－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存（4）抗体稀释液：1％BSA－0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存一、操作方法及步骤：①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。

②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。