冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理32页PPT

冷冻切片常见问题分析与预防骆新兰收稿日期:1998 03 30作者单位:广东省人民医院病理科,广州 510080作者简介:骆新兰,男,30岁,技师冷冻切片是借助低温使组织冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法。

它是术中诊断的一种重要方法。

但由于各种原因,影响冷冻切片的质量,拖延病理报告发出的时间,直接影响着病理诊断的及时性、准确性,间接影响着病人的预后。

归结起来有以下几方面。

1 切片不全或不能切片切片不全是指切出的切片组织切面不完整、有缺损现象;不能切片是指组织块的温度过高或过低不能制作一张完整的切片。

切片不全直接影响着冷冻报告切片的准确性。

导致切片不全或不能切片的常见的原因有几下几方面。

1 1 组织内含过多的脂肪或坏死组织 脂肪或坏死组织较一般的组织冷冻的温度要低些,当活组织达到所需的温度时,其还比较软,从而影响切片的完整性和拖延冷冻报告发出的时间。

1 2 组织块过冷 组织冷冻过度易致切片破碎或呈粉沫状,不能制作一张完整的切片。

1 3 组织块冷冻不均匀 在配合使用液氮时,组织块放入液氮时不能保持水平状态且液氮量不足的情况下,可产生此现象。

1 4 冻头的温度不足 冷冻切片时要求冻头的温度保持在-25 ~-30 左右,冻头的温度达不到要求时,组织很快回软,也不能保证切片的完整。

1 5 组织块过大 预防与处理: 注意组织的性质。

冷冻切片的组织除了要保持新鲜外,还应注意避免组织内含过多的脂肪(脂肪组织除外)及坏死组织。

!组织大小要适中。

冷冻切片机内切片刀移动的范围有一定的限制,超出其范围时,易致切片不全。

一般情况下,冷冻切片的组织块大小1cm ∀1cm ∀0 3cm,但卵巢肿瘤及脂肪组织可稍为大些。

另外,包埋时,应将组织平放在冻头的中央。

#掌握好冷冻时间。

根据组织块的大小、性质,确定冷冻时间,一般13~17s(使用液氮者),若组织较大或脂肪组织时间可适当长些,而甲状腺、脑组织和淋巴结等冷冻的时间相对要短些。

冰冻切片制片实验步骤及注意事项冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。

因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。

冰冻切片制片实验步骤1、组织固定：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。

将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。

2、脱水：将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底。

3、OCT包埋：将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，OCT变白变硬后即可进行切片。

4、切片：将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚°8-10μm。

将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。

-20°保存备用。

注意事项1、组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：① CO2气（-78℃）② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（-80℃）③ 液氮（-190℃）④ 液氮冷却的丙烷（-19℃）。

液氮适用于组织化学，较安全。

缺点：组织块易发生龟裂。

2、为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。

但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。

故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。

3、电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4%缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7.）84ml；蔗糖8g）固定较好。

这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。

冰冻切片免疫组化染色步骤引言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于研究细胞和组织的分子表达。

它结合了冷冻样本的切片技术和免疫组织化学染色的原理，能够可视化特定分子在组织中的位置，从而帮助我们理解生物过程和疾病机制。

本文将介绍冰冻切片免疫组化染色的步骤和注意事项。

步骤一：样本制备1.收集组织样本，根据需要进行切割和处理。

2.快速冷冻组织样本，可用液氮或乙醚等方法冷冻，并保存在低温环境中。

步骤二：切片制备1.取出冷冻样本，将其置于切片机或切片冷冻器中。

2.进行组织切片，通常厚度为5-10微米，利用切片刀或者切片冷冻器的微调装置。

3.将切片收集在清洁的载玻片上，可以使用专门的载玻片来增强切片与载玻片间的附着力。

步骤三：固定和脱水1.将载玻片上的切片放入4%的中性缓冲福尔马林缓冲液中固定细胞和蛋白质。

2.固定15-30分钟后，用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将福尔马林去除。

3.将切片脱水，使用逐渐浓度的乙醇和脱水溶液，如70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。

步骤四：抗原修复1.对于有些抗原，如细胞核抗原，需要进行抗原修复。

这可以通过热、酸或酶消化等方法进行。

2.一种常用的抗原修复方法是将切片置于高温或高压下进行热诱导抗原修复。

步骤五：阻断和孵育1.使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白、BSA等，在切片上进行孵育，以防止非特异性结合。

2.孵育时间通常为30分钟至1小时。

步骤六：一抗孵育1.加入一抗，即特异性抗体，与切片上的靶分子结合。

2.一抗浓度和孵育时间根据实验需要和抗体质量进行优化。

步骤七：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的一抗去除。

2.洗涤时间和次数根据实验要求和抗体特性进行优化。

步骤八：二抗孵育1.加入荧光标记的二抗，与一抗结合形成复合物。

2.二抗可以识别一抗的种类，常见的二抗有荧光标记的抗鼠IgG、抗兔IgG等。

步骤九：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的二抗去除。

冰冻切片的步骤及注意事项嘿，友友们！今天咱来唠唠这冰冻切片的那些事儿，可别小看它哟，这里头的步骤和注意事项那可不少呢！
先说这第一步，取材那可是相当关键呐！就好比你要做一道超级美味的菜，原料得新鲜吧！取材的时候就得眼疾手快，别磨蹭，不然那材料都不新鲜啦！而且取的位置也得准，不然切出来的片子可就不地道喽。

然后就是速冻啦，这就像是给材料来个急速冰镇。

嘿，可别慢悠悠的，得赶紧把它冻得邦邦硬，不然切片的时候可就不好玩啦。

想象一下你切个软不拉几的玩意儿，那能成啥样！
接着就是切片啦，这可是个技术活。

就跟咱削苹果似的，你得手法稳，不然切出来那一片片厚的厚，薄的薄，那可不行！我跟你说，这时候就得开启“大师模式”，每一刀都得恰到好处，别整那些歪七扭八的片子出来。

哎呀，这过程中可得注意好多事儿呢。

比如说温度得控制好，太高了不行，太低了也不行。

温度不对，那切出来的片子不是皱皱巴巴就是碎成渣，这可不是咱想要的结果嘛。

还有呢，切片机也得爱护好，就跟咱的宝贝似的，不然它捣乱起来，你可就有的愁喽。

有时候啊，这冰冻切片就跟一场战斗似的，你得和各种因素斗智斗勇。

一不小心哪里出点差错，那片子可不就给你颜色看啦！但咱也不能怕呀，就得勇敢面对，慢慢摸索，找到最佳的方法。

我还记得刚开始接触冰冻切片的时候，那真叫一个手忙脚乱啊。

不是这儿出问题就是那儿不行，简直让我哭笑不得。

不过呢，随着经验的积累，现在咱也能轻松应对啦。

总之呢，冰冻切片虽然有些麻烦，但只要咱掌握了步骤和注意事项，加上那么一点点的耐心和细心，就一定能把它搞定！友友们，加油干吧，让我们在冰冻切片的世界里闯出一片天！。