禽流感病毒的分离与鉴定研究

禽流感病毒的分离与鉴定技术孙建宏,刘景利,张从禄①（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150001）①摘要：禽流感病毒的诊断一般是通过鸡胚分离病毒，检测其血凝活性，并应用琼脂扩散试验或其他试验确定其是否为禽流感病毒，再进一步进行亚型鉴定、致病力测定。

如果是H5或H7亚型，还应采用PCR等方法对血凝素裂解位点的氨基酸序列进行测定。

①关键词:流感病毒;分离;鉴定①禽流感（Avianinfluenza，AI）由正黏病毒科A型流感病毒属的流感病毒引起。

该病毒的血清型分为15个HA亚型和9个NA亚型。

禽流感病毒可感染各种家禽和野禽，但多数呈亚临床感染。

一些H5和H7亚型可引起高致病性禽流感，可使鸡群100%死亡。

高致病性禽流感因其传播快、危害大，有的血清型可感染人，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物疾病，我国将其列为一类动物疫病。

①禽流感病毒的诊断可以根据临床症状、剖检变化做出初步诊断，进一步确诊需进行实验室检测。

目前一般是通过病毒分离和血清学试验检测病毒或是检测感染鸡的抗体进行鉴定。

近年来，随着分子生物学技术的发展，RT-PCR方法日臻成熟，也逐渐成为一种常用的诊断技术。

文章对这些禽流感的诊断技术分别做一些介绍。

①1禽流感病毒的分离①样本可采集死禽样本或活禽样本。

死禽样本一般采集肠内容物或泄殖腔拭子、鼻拭子、咽喉拭子以及内脏组织（气管、肺、气囊、肠、脾脏、肾、脑、肝脏和心脏等）；活禽样本可采集气管拭子、泄殖腔拭子。

由于采集棉拭子时幼禽容易受伤，所以还可取粪便。

①采集的拭子放入1.0mLPBS（pH7.0～7.4，含抗生素）的离心管中，静止作用30min。

对于泄殖腔拭子和粪便，用过滤器过滤除菌，上清液作为样本。

内脏样本应无菌取样，放于灭菌的玻璃研磨器，用PBS配成100g/L的悬液，加入1/10体积的抗生素，将处理过的样本移至离心管内，3000r/min离心10min，取上清液接种。

①采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；如果需长期保存，需放置-70℃条件，但应避免反复冻融（最多冻融3次）。

一、目的流感病毒的MDCK细胞分离方法是流感实验的关键技术，用于流感病毒的分离、培养。

本SOP是为确保MDCK细胞分离流感病毒的操作准确、规范和可靠而制定。

（二）材料1、75％～90％成片的MDCK细胞，选用合适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做病毒分离2、胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型）3、HEPES缓冲液，1M母液4、D-MEM培养基，Hank's液5、青、链霉素母液（10000U/mL 青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液7、临床样品0.5mL8、1mL无菌移液管9、10mL无菌移液管10、15mL无菌离心管（三）实验步骤1、准备病毒生长液（1）细胞维持液准备500mL D-MEM液中加入①青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）②牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）③HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）（2）病毒生长液每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶的终浓度为2µg/mL。

2．流感病毒MDCK细胞分离步骤：（1）75％～90％成片细胞的准备，以选取T25细胞瓶为例。

①用40×物镜观察细胞生长状态。

②轻轻倒出细胞生长液，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。

（2）细胞培养瓶的接种①用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶中移出。

②用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中，温和摇动数次。

③然后放于37℃，5%CO2培养箱中吸附1～2h。

④吸出接种物，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞2遍。

然后加入6mL 病毒生长液于细胞培养瓶中。

⑤放置于33～35℃培养箱培养。

⑥每日观察细胞病变情况。

（细胞病变的特征是细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落）。