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血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定一、实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5、了解柱层析技术二、实验原理：蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。
对于不同的蛋白质，其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。
利用不同蛋白质在这些性质上的差别，利用相应的物理方法可分离纯化不同蛋白质。
A.盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。
同时，加盐后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，从而破坏了蛋白质的胶体性质，导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间易于聚集沉淀，进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。
B.凝胶层析：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。
当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒网孔，而分子量小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔中，因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。
C.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。
D.纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。
它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。
由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。
因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
三、材料与方法A材料样品：人混合血清试剂：葡聚糖凝胶（G-25)层析柱、DEAE纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥缓2冲溶液、电泳仪、电泳槽B实验步骤盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）具体操作流程示意：（一）盐析+凝胶柱层析除盐：（二）离子交换层析（纯化）：（三）醋酸纤维素薄膜电泳：1、点样（如下图）：-点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多2、电泳：①薄膜粗面向下②点样端置阴极端③两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平电压：110V时间：50min3、染色和漂洗：电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。
生物化学实验报告班级：学号：姓名：实验室：评分━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━日期：实验一：血清γ-球蛋白分离、纯度鉴定与浓度检测实验目的：1、熟悉盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法脱盐分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法进行纯度鉴定的原理和基本方法4、掌握分光光度计检测蛋白质含量的原理和基本方法实验原理：1.盐析法:盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。
蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。
此外，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
2.凝胶层析法脱盐：在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱;反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。
分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。
3.醋酸纤维素薄膜电泳：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。
它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。
由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。
因此可以将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
4.分光光度计是应用分光光度法（即比色法）测定物质含量的装置。
通常需要加入某种显色剂，以产生有色化合物，其颜色深浅与待测化学成分的含量成正比，据此对待测物浓度进行测定。
分光光度计的工作原理及分光光度法的计算根据Lambert-Beer定律导衍而得Abs（吸光度）=KCL K:摩尔吸收系数 C:吸光物质浓度 L-溶液厚度实验操作：1.硫酸铵分段盐析:血清2.0 ml,加入PBS2.0ml,一边摇一边缓慢加入饱和硫酸铵2.0 ml,混匀后室温下静置10分钟，3000rpm离心10分钟。
11.6⽣化实验报告⾎清γ-球蛋⽩的分离纯化与鉴定及电泳分析⾎清γ-球蛋⽩的分离纯化与鉴定及电泳分析【实验⽬的】1、了解蛋⽩质分离提纯的总体思路。
2、掌握盐析法、凝胶层析法和离⼦交换层析的实验原理及操作技术3、掌握电泳法分离纯化蛋⽩质的⽅法。
【实验原理】1、蛋⽩质的粗提——盐析法胶体的盐析是加盐，盐中的带电粒⼦使蛋⽩质周围的⽔化膜减弱，胶粒溶解度降低，形成沉淀析出的过程，是胶体的聚沉现象的⼀种。
向蛋⽩质溶液中加⼊某些浓的⽆机盐[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋⽩质凝聚⽽从溶液中析出，这种作⽤就叫做盐析。
盐析不能使蛋⽩质变性，可以复原。
利⽤这个性质，可以采⽤多次盐析的⽅法来分离、提纯蛋⽩质。
蛋⽩质在⽔溶液中的溶解度取决于蛋⽩质分⼦表⾯离⼦周围的⽔分⼦数⽬，亦即主要是由蛋⽩质分⼦外周亲⽔基团与⽔形成⽔化膜的程度以及蛋⽩质分⼦带有电荷的情况决定的。
蛋⽩质溶液中加⼊中性盐后，由于中性盐与⽔分⼦的亲和⼒⼤于蛋⽩质，致使蛋⽩质分⼦周围的⽔化层减弱乃⾄消失。
同时，离⼦强度发⽣改变，蛋⽩质表⾯的电荷⼤量被中和，蛋⽩质溶解度更加降低，之蛋⽩质分⼦之间聚集⽽沉淀。
由于各种蛋⽩质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋⽩质不同，从⽽使之从其他蛋⽩中分离出来。
简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加⼊蛋⽩质溶液，使蛋⽩质表⾯电荷被中和以及⽔化膜被破坏，导致蛋⽩质在⽔溶液中的稳定性因素去除⽽沉淀。
由于清蛋⽩的亲⽔性⽐球蛋⽩⼤，且清蛋⽩的分⼦⽐球蛋⽩⼩，所以清蛋⽩需要⾼浓度的盐溶液才能够发⽣盐析，低浓度的时候球蛋⽩发⽣盐析。
盐析法分离蛋⽩质：各种蛋⽩质的颗粒⼤⼩、亲⽔程度、pI不同，盐析所需的盐浓度也不⼀样。
调节盐浓度可使不同的蛋⽩质沉淀，从⽽达到分离的⽬的。
常⽤中性盐：硫酸铵、硫酸钠等。
硫酸铵：温度系数⼩，溶解度⼤，蛋⽩谱⼴，盐析效果好，不易引起变性。
可⽤硫酸/氨⽔按需要调节pH值。
本实验中清蛋⽩分⼦⼩，亲⽔性强，在饱和硫酸铵溶液中可沉淀析出，⽽球蛋⽩分⼦⼤，亲⽔性弱，在半饱和硫酸铵溶液中即可沉淀析出。
血清清蛋白与血浆γ-球蛋白的分离定量纯化和鉴定实验设计班级：11级口腔本科2班姓名：段康博学号：201150166陈晓红201150167章瑞雪201150163郭昌再201150145高原201150143【实验目的】1.了解并基本掌握蛋白质分离提纯的过程2.从血清中分离并纯化血清清蛋白和γ-球蛋白。
3.进行血清清蛋白和γ-球蛋白的定量和鉴定4. 4.掌握电泳的原理方法及应用【实验原理】血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分，血浆蛋白质种类繁多，功能各异。
用不同的分离方法可将血浆蛋白质分为不同的种类。
在生物化学研究中，由于它们所带电荷不同、相对分子质量不同，在高浓度盐溶液中的溶解度不同，因此可利用它们在中性盐溶液中溶解度的差异而进行沉淀分离，用盐析法将血浆蛋白分为白蛋白（即清蛋白）、球蛋白与纤维蛋白原三大类。
用盐析法分离而得的蛋白质含有大量的硫酸铵，会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此必须去除，常用的有透析法、凝胶过滤法等。
本实验采用凝胶过滤法。
脱盐后的蛋白质溶液再经DEAE纤维素层析柱进一步纯化。
DEAE纤维素为阴离子交换剂，在pH 6.5的条件下带有正电荷，能吸附带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白（pl分别为4.9、5.06和5.12），而γ-球蛋白（pl7.3）在此条件下带正电荷，不被吸附故直接从层析柱流出，此时收集的流出液即为纯化的γ-球蛋白。
提高醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L，DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。
将醋酸铵溶液的浓度提高至0.3mol/L，则清蛋白被洗脱下来，此时收集的流出液即为较纯的清蛋白。
经DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的清蛋白、γ－球蛋白液往往体积较大，样品质量分数较低。
为便于鉴定，常需浓缩。
浓缩的方法很多，本实验选用聚乙二醇透析浓缩的方法。
血清清蛋白、γ-球蛋白分离纯化后，选用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。
然后，用醋酸纤维素薄膜电泳可分为五个区带，γ-球蛋白的等电点为7.3，在pH8.6的巴比妥缓冲液中，带的负电荷最少，因此在电场中比其它蛋白质移动速度慢。
11.6⽣化实验报告⾎清γ-球蛋⽩的分离纯化与鉴定及电泳分析⾎清γ-球蛋⽩的分离纯化与鉴定及电泳分析【实验⽬的】1、了解蛋⽩质分离提纯的总体思路。
2、掌握盐析法、凝胶层析法和离⼦交换层析的实验原理及操作技术3、掌握电泳法分离纯化蛋⽩质的⽅法。
【实验原理】1、蛋⽩质的粗提——盐析法胶体的盐析是加盐，盐中的带电粒⼦使蛋⽩质周围的⽔化膜减弱，胶粒溶解度降低，形成沉淀析出的过程，是胶体的聚沉现象的⼀种。
向蛋⽩质溶液中加⼊某些浓的⽆机盐[如(NH4)2SO4或Na2SO4]溶液后，可以使蛋⽩质凝聚⽽从溶液中析出，这种作⽤就叫做盐析。
盐析不能使蛋⽩质变性，可以复原。
利⽤这个性质，可以采⽤多次盐析的⽅法来分离、提纯蛋⽩质。
蛋⽩质在⽔溶液中的溶解度取决于蛋⽩质分⼦表⾯离⼦周围的⽔分⼦数⽬，亦即主要是由蛋⽩质分⼦外周亲⽔基团与⽔形成⽔化膜的程度以及蛋⽩质分⼦带有电荷的情况决定的。
蛋⽩质溶液中加⼊中性盐后，由于中性盐与⽔分⼦的亲和⼒⼤于蛋⽩质，致使蛋⽩质分⼦周围的⽔化层减弱乃⾄消失。
同时，离⼦强度发⽣改变，蛋⽩质表⾯的电荷⼤量被中和，蛋⽩质溶解度更加降低，之蛋⽩质分⼦之间聚集⽽沉淀。
由于各种蛋⽩质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋⽩质不同，从⽽使之从其他蛋⽩中分离出来。
简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加⼊蛋⽩质溶液，使蛋⽩质表⾯电荷被中和以及⽔化膜被破坏，导致蛋⽩质在⽔溶液中的稳定性因素去除⽽沉淀。
由于清蛋⽩的亲⽔性⽐球蛋⽩⼤，且清蛋⽩的分⼦⽐球蛋⽩⼩，所以清蛋⽩需要⾼浓度的盐溶液才能够发⽣盐析，低浓度的时候球蛋⽩发⽣盐析。
盐析法分离蛋⽩质：各种蛋⽩质的颗粒⼤⼩、亲⽔程度、pI不同，盐析所需的盐浓度也不⼀样。
调节盐浓度可使不同的蛋⽩质沉淀，从⽽达到分离的⽬的。
常⽤中性盐：硫酸铵、硫酸钠等。
硫酸铵：温度系数⼩，溶解度⼤，蛋⽩谱⼴，盐析效果好，不易引起变性。
可⽤硫酸/氨⽔按需要调节pH值。
本实验中清蛋⽩分⼦⼩，亲⽔性强，在饱和硫酸铵溶液中可沉淀析出，⽽球蛋⽩分⼦⼤，亲⽔性弱，在半饱和硫酸铵溶液中即可沉淀析出。
血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定综合性实验的创新与实践摘要】为改革生物化学实验，提高实验教学水平，对“血清γ-球蛋白的分离与提纯”实验进行改进和重新整合，建立了综合性实验“血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定”，实现实验内容和生化技术的综合与创新。
经过4年的医学本科生教学实践，实验方法稳定，结果重复可靠，适合实验教学，有利于提高大学生的综合实验技能。
【关键词】γ-球蛋白综合性实验创新血清γ-球蛋白又称免疫球蛋白（Ig），具有重要的医药应用价值。
许多医学院校把提取血清γ-球蛋白作为生化实验教学内容。
本室于2007年初，对原有生化实验“血清γ-球蛋白的分离与提纯”进行了改进和大胆的创新，选用猪血清，保留原有的硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶除盐的操作步骤，增加了分光光度法测定蛋白含量、醋酸纤维素膜及SDS-PAGE法鉴定提取的血清γ-球蛋白纯度，建立并开设了16学时的综合性实验“血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定”。
通过血清γ-球蛋白的分离、纯化、鉴定、蛋白测定及进一步鉴定的五个子实验，涵盖了生化的离心、层析、分光光度和电泳法四大传统技术。
突破了旧的单纯验证理论或简单孤立的学习一种实验方法或一个知识点的教学模式，使学生受到一次综合性生化技能训练，提高了实验教学效率和效果。
1 材料与方法1.1 仪器材料1.1.1 仪器 KDC-40低速离心机、1.5cm×20cm玻璃层析柱、722-可见分光光度计、DYY-2C电泳仪及DYCZ-24D型垂直板电泳槽。
1.1.2 试剂材料新鲜猪血清、pH7.0饱和硫酸铵溶液、0.01mol/L pH7.0 PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）、葡聚糖凝胶G—25（SephadexG-25）、奈氏（Nessler）试剂、20%（W/V）磺基水杨酸溶液、pH8.6离子强度0.06巴比妥缓冲液、氨基黑10B、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、BSA（牛血清白蛋白）等，除SephadexG-25外均为国产。
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定一、实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法5、了解柱层析技术二、实验原理：蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。
对于不同的蛋白质，其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。
利用不同蛋白质在这些性质上的差别，利用相应的物理方法可分离纯化不同蛋白质。
A.盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。
同时，加盐后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，从而破坏了蛋白质的胶体性质，导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间易于聚集沉淀，进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。
B.凝胶层析：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。
当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒网孔，而分子量小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔中，因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。
C.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。
D.纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。
它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。
由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。
因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
三、材料与方法A材料样品：人混合血清试剂：葡聚糖凝胶（G-25)层析柱、DEAE纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥缓2冲溶液、电泳仪、电泳槽B实验步骤盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）具体操作流程示意：（一）盐析+凝胶柱层析除盐：（二）离子交换层析（纯化）：（三）醋酸纤维素薄膜电泳：1、点样（如下图）：-点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多2、电泳：①薄膜粗面向下②点样端置阴极端③两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平电压：110V时间：50min3、染色和漂洗：电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。
血清清蛋白及γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定目的要求1．1．熟悉蛋白质分离纯化的总体思路。
2．2．掌握盐析、离心、层析、浓缩、电泳等技术在蛋白质分离纯化中的综合作用。
3．3．学会设计和制定分离纯化蛋白质的方法。
实验原理血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16％，100ml血清中约含1.2g左右。
首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度硫酸铵溶液溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。
半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。
用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。
常用的方法有透析法、凝胶层析法等。
本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。
当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。
脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。
清蛋白、α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI为7.2左右。
因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。
经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的α－球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的γ－球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。
因此随洗脱液流出的只有γ－球蛋白，从而使γ－球蛋白粗制品被纯化。
其反应式如下：用上述方法分离得到γ－球蛋白是否纯净，单一。
可将纯化前后的γ－球蛋白进行电泳比较而鉴定之。
提高醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L，DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。
血清γ- 球蛋白的分离、纯化与鉴定【目的】1 ．掌握盐析 - 层析法提纯血清γ- 球蛋白的原理和技术。
2 ．熟悉电泳比较法定性γ- 球蛋白的方法。
3 ．了解扫描定量γ- 球蛋白的方法。
【原理】蛋白质的分离、纯化是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段。
根据不同蛋白质的分子量、溶解度以及在一定条件下带电荷性状的差异来分离、纯化各种蛋白质。
1 ．γ- 球蛋白的分离、纯化（ 1 ）盐析：清蛋白与球蛋白的稳定性不同，故可用盐析法对血清蛋白质初步分离。
在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心所得的沉淀即是球蛋白混合物。
（ 2 ）脱盐：球蛋白混合物中的硫酸铵会妨碍进一步分离纯化，应除去。
脱盐的方法有多种，本试验采用凝胶过滤。
在凝胶过滤中，柱中的填充料是高度水化的惰性多聚物，最常用的有葡聚糖凝胶（ Sephadex Gel ）和琼脂糖凝胶 (Agarose Gel) 等颗粒。
葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，它的“ 网眼” 大小可以通过交联剂与葡聚糖的配比来达到。
不同型号的葡聚糖凝胶可用来分离和纯化不同分子大小的物质。
把葡聚糖凝胶装在层析柱中，不同分子大小的蛋白质混合液借助重力通过层析柱时，比“ 网眼” 大的蛋白质分子不能进入网格中，而被排阻在凝胶颗粒之外，随着洗脱剂在凝胶颗粒的外围而流出。
比‘ 网眼 ' 小的分子则进入凝胶颗粒内部。
这样，由于不同大小的分子所经路程距离不同而得到分离。
大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。
所以含硫酸铵的蛋白值溶液通过层析柱时，先被洗脱出层析柱的是球蛋白，小分子硫酸铵由此法分离除去（参见第 2 篇第 2 章图 2-3 ）。
（ 3 ）纯化：γ- 球蛋白与α 、β- 球蛋白（以及微量的清蛋白），等电点不同，所以采用离子交换层析，从球蛋白混合物中分离、提纯出γ- 球蛋白。
用于蛋白质分离的层析材料多是离子交换纤维素，它们的优点是对蛋白质的交换容量较一般的离子交换树脂大，而且品种较多，可以适用于各种分离目的。
血清清蛋白与血浆γ-球蛋白的分离定量纯化和鉴定
实验设计
班级：11级口腔本科2班
姓名：段康博学号：201150166
陈晓红201150167
章瑞雪201150163
郭昌再201150145
高原201150143
【实验目的】
1.了解并基本掌握蛋白质分离提纯的过程
2.从血清中分离并纯化血清清蛋白和γ-球蛋白。
3.进行血清清蛋白和γ-球蛋白的定量和鉴定
4. 4.掌握电泳的原理方法及应用
【实验原理】
血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分，血浆蛋白质种类繁多，功能各异。
用不同的分离方法可将血浆蛋白质分为不同的种类。
在生物化学研究中，由于它们所带电荷不同、相对分子质量不同，在高浓度盐溶液中的溶解度不同，因此可利用它们在中性盐溶液中溶解度的差异而进行沉淀分离，用盐析法将血浆蛋白分为白蛋白（即清蛋白）、球蛋白与纤维蛋白原三大类。
用盐析法分离而得的蛋白质含有大量的硫酸铵，会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此必须去除，常用的有透析法、凝胶过滤法等。
本实验采用凝胶过滤法。
脱盐后的蛋白质溶液再经DEAE纤维素层析柱进一步纯化。
DEAE纤维素为阴离子交换剂，在pH 6.5的条件下带有正电荷，能吸附带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白（pl分别为4.9、5.06和5.12），而γ-球蛋白（pl7.3）在此条件下带正电荷，不被吸附故直接从层析柱流出，此时收集的流出液即为纯化的γ-球蛋白。
提高醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L，DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。
将醋酸铵溶液的浓度提高至0.3mol/L，则清蛋白被洗脱下来，此时收集的流出液即为较纯的清蛋白。
经DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的清蛋白、γ－球蛋白液往往体积较大，样品质量分数较低。
为便于鉴定，常需浓缩。
浓缩的方法很多，本实验选用聚乙二醇透析浓缩的方法。
血清清蛋白、γ-球蛋白分离纯化后，选用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。
然后，用醋酸纤维素薄膜电泳可分为五个区带，γ-球蛋白的等电点为7.3，在pH8.6的巴比妥缓冲液中，带的负电荷最少，因此在电场中比其它蛋白质移动速度慢。
而清蛋白等其它蛋白质的等电点均小于7.3（pl分别为4.9、5.06和5.12），因此在电场中比γ-
球蛋白移动速度快。
（此处插图）饱和度的硫酸铵溶液沉淀的球状蛋白质。
血清白蛋白在血液中有重要生理功能，和维持血液正常渗透压有关，是血液总渗透压的主要调节物质。
血清白蛋白的另一作用是作为脂肪酸的载体参与运送脂肪酸。
γ-球蛋白又称免疫球蛋
白，在血清蛋白质中数量居第三，具有重要的一用价值。
【实验试剂与器材】
试剂：
（1）饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵850g加入1000mL蒸馏水中，在70~80℃下搅拌促熔，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵液。
（2）0.3mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液：称取醋酸铵23.12g,加蒸馏水800mL，用稀氨水或稀醋酸调pH至6.5，定容至1000mL。
(不得加热)
（3）0.06mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水稀释5倍。
（4）0.02mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液：取上液用蒸馏水稀释3倍。
（5）巴比妥缓冲液（pH8.6,离子强度0.06）：称取巴比妥纳12.76g，巴比妥1.66 g，蒸馏水溶解并定容至1000 mL。
（6）染色液：氨基黑10B 0.25g，用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解。
（7）漂洗液：甲醇或乙醇45mL，冰醋酸5mL，水50mL，混匀。
（8）DEAE纤维素（9）新鲜血清
（10）聚乙二醇（11）葡聚糖凝胶G-25
（12）300g/L三氯乙酸（13）纳氏试剂
器材：
离心机和刻度离心管电泳仪电泳槽醋酸纤维膜pH试纸抽滤瓶黑、白反应板透析袋铁架台滤纸点样器层析柱（1.5×20cm）吸量管镊子微量加样器布氏漏斗培养皿
【实验准备】
DEAE纤维素处理：量取DEAE-纤维素20mL，加0.5mol/L HCl 溶液50mL，搅拌后放置20min，用布氏漏斗抽干去除上清液，再用蒸馏水反复洗数次直至pH 4.0 为止。
加等体积0.5 mol/LNaOH 溶液，搅拌后放置20min，虹吸去除上清液，同上用蒸馏水反复洗至pH<7为止。
然后转移到烧杯内，加0.02mol/LpH 6.5醋酸铵缓冲液40mL放置30min。
待装柱。
【实验步骤】
分离和纯化
1.取刻度离心管1支，加入1.0mL新鲜血清，边摇边缓慢滴入饱和硫酸铵液1.0mL。
混匀后室温下放置10min，4000r/min离心10min。
用滴管小心吸出上清液置于试管中，即为粗清蛋白液。
2.离心管底部的沉淀加入0.8mL蒸馏水，振荡溶解，即为粗球蛋白液。
3．凝胶的处理：量取30 mL 葡聚糖凝胶G-25G，加入2倍量的0.02mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液，置于沸水浴中1h。
取出冷却，待凝胶下沉后，倾去含有细微悬浮物的上层液。
4. 装柱平衡：选用1.5×20cm层析柱，垂直夹于铁架台上。
向柱内加入少量0.02mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液，将上述处理过的凝胶粒悬液连续注入层析柱内，直至所需凝胶床高度距层析柱上口约3~4cm为止。
打开下口夹，调节柱下端螺旋夹流速2 mL/min，用缓冲液平衡（注意用2倍柱床体积的醋酸铵）。
关闭下口夹。
5. 上样与洗脱：打开下口夹，使床面上的缓冲液流出，待液面降到凝胶床表面时，关闭出水口。
用滴管吸取盐析所得清蛋白溶液，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品，切勿搅动床面。
然后打开下口夹，使样品进入床内，直到与床面平齐为止。
立即用1mL 0.02 mol/L pH
6.5醋酸铵缓冲液冲洗柱内壁，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。
如此重复2次，以洗净内壁上的样品溶液。
然后再加入适量缓冲液于凝胶床上，调流速10滴/min，开始洗脱。
用小试管收集流出的液体，每管收集20滴，收集10管后关闭出水口。
6．检测蛋白质：取黑白反应板各一块，按洗脱液的顺序每管取1滴，分别滴入反应板中，在黑色反应板中加300g/L三氯乙酸溶液2滴，出现白色混浊或沉淀即示有蛋白质析出，并记录各管白色混浊程度。
于白色反应板中加人奈氏试剂溶液l滴，观察NH4出现的情况。
合并含有蛋白质的各管，即为已脱盐的清蛋白溶液，γ-球蛋白的收集同清蛋白的操作。
7. 装柱与洗脱：取层析柱1.5×20cm 1支，按以上装柱方法将处理好的DEAE-纤维素装入柱中，然后用0.02 mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液平衡。
调流速20滴/min，将脱盐后的γ-球蛋白溶液上柱，方法与上述脱盐法相同。
同样用300g/L三氯乙酸溶液或双缩脲试剂检查有无蛋白质流出。
收集不被纤维素吸附的蛋白质即为纯化的γ-球蛋白溶液。
8. 清蛋白的纯化：将脱盐后的清蛋白溶液上柱后，用0.06mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液洗脱，流出约6mL后。
将柱上的缓冲液液面降至与纤维素床表面平齐。
再改用0.3mol/L pH6.5醋酸铵缓冲液洗脱，并用300g/L三氯乙酸溶液或双缩脲试剂检查流出液是否含有蛋白质。
流出液中有蛋白质时，立即收集，即为纯化的清蛋白液。
9.将待浓缩的蛋白质溶液放入较细的透析袋中，置入培养皿内。
透析袋周围撒上聚乙二醇。
经过一定时间后即可观察到明显的浓缩现象。
该浓缩样品留作纯度鉴定。
电泳
10. 取醋酸纤维薄膜3张，在薄膜的无光泽面的1.5cm处用铅笔轻轻划一条线。
11. 将薄膜浸入pH8.6的巴比妥-巴比妥钠缓冲液中，浸泡约30min
12. 将完全浸透的薄膜轻轻取出，平铺在滤纸上，用滤纸吸去多余的缓冲液。
分别用点样器蘸取正常血清、清蛋白和γ-球蛋白溶液点在点样线上
13. 薄膜的无光泽面向下，两端紧贴在电泳槽支架上的滤纸条上（点样端在阴极）。
薄膜应位正，平直无弯曲，加上槽盖平衡5分钟后通电电泳，调电流0.5mA/cm膜宽，通电时间约40~60min。
14. 电泳结束后，关闭电源，将薄膜浸于氨基黑10B染色液中染色5min，取出后用漂洗液漂洗4~5次，每次约5min，待背景无色为止。
鉴定
根据脱色后薄膜上出现的斑点，对清蛋白、γ-球蛋白与正常血清比较，分析样品的纯度。
【注意事项】
1.凝胶处理时废水浴过程中要经常摇动，使气泡溢出。
2.装柱时注意凝胶粒混合均匀，凝胶床内不得有界面和气体，凝胶床面平整。
3.若凝胶床内出现界面、气泡或流速明显减慢时，将胶粒倒出，重新装柱。
4.加样时，切莫将床面冲起，亦不要沿柱壁加入。
不能搅动床面，否则分离带不整齐。
5.流速不可太快，否则分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不
到分离目的。
6.久用后，如凝胶床表面有沉淀等杂质滞留，可将表面一层胶粒析出，再填补新的凝胶。
7.在整个洗脱过程中，始终应保持层析柱床面上有一段蒸馏水，不得使凝胶干结。
8.薄膜应浸泡到膜上没有白色斑痕，点样时点在醋酸纤维薄膜的粗糙面上
9.电泳时薄膜的无光泽面即粗糙面向下。
