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几种菌种的保存及复苏方法(含扩增方法)定期移植法,亦称传代培养保藏法,包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中,最适条件下培养,待生长充分后,于4~6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下:1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿,如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等,经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水,按培养基配方称取各项材料,依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解,最后加足水量,搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温,根据要求加稀酸(0.1mol/L盐酸)或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌,防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂,如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中,加热并不断搅拌至融解,再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉,将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4~5mL),穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口,以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞,外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌,通常蒸汽灭菌为121℃,15~20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面,斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验,通常30℃培养1~3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌(如毛霉、根霉等)。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
适用于细菌和酵母菌等。
菌种安全保藏方法菌种安全保藏方法点击：23食用菌由于生产投入少，经济效益高，近年来在农村兴起了食用菌生产热潮。
生产中食用菌菌丝繁殖快，容易老化，菌种保藏更难。
下面介绍七种简单易行的菌种保藏方法供广大农户参考：蒸馏水法适用于平菇、金针菇、香菇的苗种。
1、保藏平菇、金针菇菌种先将八成熟待保藏试管菌种移入接种箱内灭菌后，用注射器从试管栓内注入蒸馏水，将培养基面全部淹没至管口2厘米为止。
管口用矿蜡封闭，常温下置于阴凉处立放可以保藏1～1.5年。
2、保藏香菇、木耳菌种，用150×15毫米的指型管将培养至7成熟的固体或半固体试管种在接种箱内无菌操作下，放人25×200毫米的大试管内，向大试管内注入蒸馏水至管口1厘米处，封口用橡皮栓包好，并用矿蜡加固密封，置于阴凉处。
木耳可保藏7～8个月，香菇可保藏9～12个月。
此法在自然温度下也可以保藏其他菌种。
尿素暂存法在避光、干燥通风良好的地方放置袋装尿素，将试管菌种主体埋在尿素颗粒中，试管口露在外面，可保藏菌种活力30天之多。
此法在恒定低温环境下即可进行。
液体石蜡保藏法选用化学液体石蜡，高压灭菌后放入40℃恒温箱中数小时或干燥器中数日，用无菌吸管或注射器吸取液体石蜡注入菌种试管。
注入量应高出斜面尖端1厘米左右，管口塞上棉塞并用石蜡封好。
直立保藏在清洁、干燥、凉爽的低温处可以保藏5年。
麸皮保藏法取一定麸皮加水或营养液后拌匀即可备用。
将水麸皮装入试管经高压灭菌后拌入菌种，放在适温下培养，待菌丝体发育好后将试管放入室温下进行干燥。
然后在20℃以下干燥处保藏，可保藏3～5年。
生理盐水保藏法将菌种接入马铃薯培养液中，每250毫升三角瓶装60毫升养液，振动培养液或每天摇动5～10次，培养5～7天，然后将形成的菌丝球吸入装有5毫升无菌生理盐水的试管中，每管约移入4～5个菌丝球，塞上棉塞，用蜡封好管口。
低温可保藏1年。
麦粒保藏法取优质小麦淘洗后浸入20℃水中泡5小时，稍晾干后装管。
微生物菌种保藏及复壮5.1. 微生物菌种保藏在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重要。
微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。
具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。
5.1.1. 蒸馏水悬浮法这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。
好气性细菌和酵母等可用此法保存。
5.1.2. 斜面传代保藏斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。
它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。
但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。
因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。
斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。
此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。
如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。
5.1.3. 矿物油中浸没保藏此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。
特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。
是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。
几种菌种的保存及复苏方法几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
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菌种保藏方法及复壮技术菌种保藏的原理是通过干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等方法，使菌种的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存。
需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、典型的形态特征、优良生产性能。
目前常用的菌种保藏方法有以下几种。
1菌种保藏方法1.1斜面低温保藏法将需要保藏的菌种，接种在适宜的斜面培养基上，菌丝长满斜面时，用硫酸纸包扎棉塞，旋转在4℃的冰箱保藏。
由于微生物的新陈代谢活动未停止，试管内培养基易失水变干，因此，保藏时间较短，转管次数多，不适于长期保藏。
每隔六个月转管一次。
草菇菌种不耐低温，需保藏在10~12℃，或在草菇菌落上灌注3~4毫升的防冻剂（10%的甘油）。
如菌丝长满斜面后，在无菌条件下，用无菌橡皮塞代替棉塞，并用石蜡密封，即可在室温或冰箱中保藏。
这种方法可防止杂菌污染，隔绝氧气，避免培养基干燥，使用方便。
1.2液体石蜡保藏法石蜡防止培养基水分蒸发，隔绝斜面菌丝与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，因此能延长微生物的生命，保持菌种优良的种性。
一般可保藏3~5年，是一种中长期的菌种保藏方法。
液体石蜡选用化学纯的，在121℃下高温灭菌30分钟，再将液体石蜡在160℃烘箱中保温1~2小时，蒸发掉液体石蜡中的水，或将高压灭菌后的液体石蜡放置在40~60℃温箱中，使灭菌后的液体石蜡层由乳白色变成无色透明。
在无菌条件下，将灭菌除水的液体石蜡用无菌吸管罐到长满菌丝的斜面试管中，液体石蜡要高出斜面尖端1厘米左右，然后用无毒泡沫试管塞塞好，直立地放在试管架上或罐头瓶中，置于冰箱或室温中保藏。
液体石蜡灌注过多，移种时不方便；过少，时间长容易干涸。
如将棉塞齐试管中剪平，用石蜡溶封，或用无菌橡皮塞代替棉塞，可延长保藏时间。
菌种保藏方法
菌种保藏方法，如下：
1、传代保藏，传代保藏菌种是微生物保存中最常用的方法之一。
很多微生物在低温或者干燥处理时，会很快死亡，为了保存菌种的活性，就要定期不断的进行菌种转接、培养后再保存。
2、斜面低温保藏，将待保藏的菌种接种在合适的斜面培养基上，在相应的条件下培养至得到充足的菌体或者孢子，随后密封试管置于4℃左右保存，具体保存温度按照保存菌种设定。
保藏时间依微生物的种类从1个月到4个月不等。
3、冷冻干燥保藏，冷冻干燥保藏法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，这种方法适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年。
我国大多数生物制品菌种都是采用该法保藏。
4、半固体穿刺保藏，配制半固体培养基，高压湿热灭菌后倒于无菌试管中至约1/3，待培养基凝固，用接种环从平面培养基上挑取单菌落，穿入培养基若干次。
在合适的条件下进行培养至菌体旺盛生长，之后密封试管，根据菌种特点在4 ℃左右或者凉爽干燥处保存。
保存时间至少可以达到
1 年，对于有些菌种甚至能达到20 年之久。
5、液氮超低温保藏，液氮超低温保藏法是菌种长期保藏的最有效最可靠的方法。
液超低温保藏法是把菌种装在含有冷冻保护剂的安瓶瓶内，将该安瓶瓶放人液氮（-196℃）中保藏。
菌种保藏和复苏-精简版菌种的保藏与复苏一、菌种保藏（一）菌种保藏的定义菌种保藏（culture preservation）是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。
菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。
（二）菌种保藏的原理微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但大都是根据这三个因素而设计的。
其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。
在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。
在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。
如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。
与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理而设计的。
（三）菌种保藏的方法本实验室常用菌种保藏方法主要有：1.低温保藏法将菌种接种在适宜的固体或液体培养基上，待菌生长充分以后，转移至4°C冰箱中保存。
平板在4°C存放时，最好用封口膜封口，不能长时间存放，一般7-10天，最多不应超过2个星期（特殊菌株可能时间更短，如铜绿假单胞菌只能存放3天）。
此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，应经灭活处理后销毁。
2.甘油冷冻管保藏法菌种长时间冻存应放于液氮或者-80 °C冰箱，利用10-15%的甘油进行冻存。
甘油的作用：甘油能够提高水体的粘稠度，使其冰点提高，防止细胞内部产生冰晶造成细胞的损害，一般使用甘油的终浓度在10%-20%，该范围外的浓度会对细胞产生毒性，如果是保存带有质粒的菌种建议甘油终浓度为8-10%，甘油浓度太高会导致质粒的不稳定。
冷冻干燥菌种的恢复培养录入时间:2011-7-14 9:39:40 来源：青岛海博建议用下列方法恢复培养CGMCC冷冻干燥的菌种。
－、安瓶管开封1．用浸过70％酒精的脱脂棉擦净安瓿管。
2．用火焰将安瓿管顶端加热。
3．滴无菌水至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂。
4．用挫刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。
二、菌株恢复培养1．用无菌吸管，吸取0.3～0.5ml适宜的液体培养基，滴人安瓿管内，轻轻振荡，使冻于菌体溶解呈悬浮状。
2．取0.1～0.2ml菌体悬浮液，移植于适宜的琼脂斜面／平板培养基上，剩余的菌液，注入适宜的液体培养基内，然后在建议的温度下培养。
3．若未能活化，或活化后有疑问时，请于收到菌种1个月内，通知保藏中心，经查证无误后，即免费补寄。
将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。
操作步骤如下：好氧菌冷冻干燥管的制备1 安瓿管准备安瓿管材料以中性玻璃为宜。
清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。
2 保护剂的选择和准备保护剂种类要根据微生物类别选择。
配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。
如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。
3 冻干样品的准备在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行）），与保护剂混合均匀，分装。
微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支）。
采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。
定期移植法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。
1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。
1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。
加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。
1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。
将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。
1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。
斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。
分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。
1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。
1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。
1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。
1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。
无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。
2接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。
适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。
2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。
适用于细菌和酵母菌等。
2.1.3 稀波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划“之”字形线。
菌种保存方法和菌种的衰退复壮菌种保存方法微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
保藏方法大致可分为以下几种：1．传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。
2．液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
3．载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
4．寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。
病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
6．冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
三、器材细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2c m），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
灵芝菌种的保藏与复壮灵芝菌种的保藏与复壮发布日期：2010-07-12灵芝菌种的保藏与复壮一、茵种保藏要保持灵芝菌种的新鲜、优质，必须妥善保藏菌种，使灵芝菌株新陈代谢速率减缓，避免菌种衰老死亡，可置菌种在清洁干燥、冷冻、低温、缺氧的环境中保存。
现具体介绍以下几种方法：(一)试管斜面低温(冰箱)保藏法在母种试管外面包一层塑料薄膜或牛皮纸，以防水分蒸发，而后置于冰箱内4℃条件下保存，菌丝在此温度下几乎停止生长而处于"休眠"状态，代谢作用缓慢从而延长保存时间。
保存过程中要注意几点：1．温度不能太低，否则斜面培养基易脱水结白而冻死菌种。
2．低温保存的菌种，每隔三四个月须转管一次。
3．保存期间要经常检查棉塞是否受潮，否则要及时更换棉塞(无菌棉塞)，以免感染杂菌。
4．对于低温保存较长的菌种，使用前必须先把菌种放在适宜温度下让其"苏醒"，恢复菌丝的生命活力。
该方法简单易行，设备仪器简便，应用范围广，无论科研单位还是栽培生产单位，都可采取低温保存菌种，但由于经常要转接试管，代数过多会退化菌种，且费工费时。
(二)石蜡保藏法将要保存的灵芝菌种移接到cpda培养基斜面上，在25度左右的恒温中培养7天左右，然后用液体石蜡封藏保存。
石蜡要选化学性纯的，首先在121度下高压灭菌30-60分钟，连续灭菌2次，再用无菌吸管灌注到斜面上，液体石蜡以高出斜面尖端1厘米为宜，然后置于室内干燥处或冰箱中保存，用石蜡封闭，隔绝了菌丝与空气接触，防止水分蒸发，菌株新陈代谢减缓，菌种保存时间延长，一般可保存5年以上，但以l.2年移植一次为好。
需用菌种时，从试管中抽取菌丝移植到pda培养基斜面上进行活化培养，即可作菌种用。
保存过程中要注意几点：1．为防止封闭石蜡后灵芝菌丝再生长，应适当延长菌丝的培养时间。
2．倒入的石蜡不能低于斜面尖端，否则液体石蜡挥发快，斜面培养基易干涸。
3．石蜡灭菌要彻底，否则菌种易感染杂菌。
菌种的保藏与复苏一、菌种保藏（一）菌种保藏的定义菌种保藏（culture preservation）是指将微生物菌种用各种适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。
菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。
（二）菌种保藏的原理微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但大都是根据这三个因素而设计的。
其中低温是保藏菌种的重要因素，也是常用的一种简单易行的方法。
在作低温保藏时，注意尽量不损伤细胞。
在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。
如快速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死亡，影响也较小。
与低温相关的保藏方法，如冷冻干燥法、超低温保藏法等，都是利用低温条件下细胞与环境的特殊平衡原理而设计的。
（三）菌种保藏的方法本实验室常用菌种保藏方法主要有：1.低温保藏法将菌种接种在适宜的固体或液体培养基上，待菌生长充分以后，转移至4°C冰箱中保存。
平板在4°C存放时，最好用封口膜封口，不能长时间存放，一般7-10天，最多不应超过2个星期（特殊菌株可能时间更短，如铜绿假单胞菌只能存放3天）。
此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，应经灭活处理后销毁。
2.甘油冷冻管保藏法菌种长时间冻存应放于液氮或者-80 °C冰箱，利用10-15%的甘油进行冻存。
甘油的作用：甘油能够提高水体的粘稠度，使其冰点提高，防止细胞内部产生冰晶造成细胞的损害，一般使用甘油的终浓度在10%-20%，该范围外的浓度会对细胞产生毒性，如果是保存带有质粒的菌种建议甘油终浓度为8-10%，甘油浓度太高会导致质粒的不稳定。
野生菌甘油浓度最高可以提高到20-30%。
用培养基（培养基应选择需保存菌株生长用的培养基）配制50%（v/v）的甘油，高压蒸汽灭菌后，按200 μl/管分装到EP管中，另少数分装于螺口管。
甘油一次不应分装太多。
重要菌种应该用2 ml的螺口管保存。
因为螺口管密封更严，而且不会在冷冻时崩开。
保菌前，把甘油管做好标记。
标记内容应包括菌名、保存日期、保存人和有效期。
每个样品应至少保存2管。
保菌时，用无菌枪头吸取600 μl（该体积可根据最终甘油浓度而变）的新鲜菌液（应采用性状稳定，生长至对数中期的菌液进行保菌），加入甘油后，缓缓吹打混合均匀。
立刻放入-20°C冰箱中冷冻，开大冰箱时，放入-80°C冰箱保藏。
该方法保藏菌种的有效期规定为6个月。
超过6个月应及时进行复苏传代，此种方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏（如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌）。
在构建载体的重要时刻都应该进行菌种保存，还应该保存质粒（TE buffer，-20 °C）质粒导入E.coli DH5α、BL21(DE3)后都应该进行保菌。
建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。
（四）菌种保藏的注意事项1、严格的无菌操作；2、用于保存的微生物在生长前必须处于生长良好的状态；3、保藏过程中要防止退化的发生。
二、菌种的复苏与传代（一）菌种的代菌种的代是指将其接种至新鲜固体培养基上或液体培养基内，每萌发一次即称为一代，——USP。
（二）菌种的衰退原理在生物进化的历史长河中，遗传性的变异是绝对的，而它的稳定性反而是相对的；退化性的变异是大量的，而进化性的变异却是个别的。
在自然情况下，个别的适应性变异通过自然选择就可保存和发展，最后成为进化的方向；在人为条件下，人们也可以通过人工选择法去有意识地筛选出个别的正变体用于生产实践中。
相反，如不自觉、认真地去进行人工选择，大量的自发突变菌株就会趁机泛滥，最后导致菌种的衰退（degeneration）。
如果对菌种工作长期放任自流，不纯化、复壮（rejuve-nation）和育种，则菌种就会对你进行“惩罚”，就会出现持续的低产、不稳产。
菌种的生产性状也是不进则退的。
菌种的衰退的表现有：对产量性状来说，菌种的负变就是衰退；其他原有的典型性状变得不典型时，也是衰退；最易觉察到的是菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少也是衰退的表现；代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降也是衰退；衰退还表现在抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱等。
菌种的衰退是发生在细胞群体中的一个由量变到质变的逐步演变过程。
开始时，在一个大群体中仅个别细胞发生负变，这时如不及时发现并采取有效措施，而一味移种传代，则群体中这种负变个体的比例逐步增大，最后让它们占了优势，从而使整个群体表现出严重的衰退。
所以，在开始时所谓“纯”的菌株，实际上其中已包含着一定程度的不纯因素；同样，到了后来，整个菌种虽已“衰退”了，但也是不纯的，即其中还有少数尚未衰退的个体存在着。
衰退的特点是大量群体中的自发突变。
经过长期保藏和传代的菌种，由于种种原因易发生衰退、变异或死亡，因此各类菌种在保藏期间必须定期检查，发现变异或衰退，应及时给予恢复。
防止菌落的衰退的方法1.定期检查保藏的菌种应定期检查，一般每年检查1—2次，在有效期内做好鉴定、复苏、传代的工作。
发现染菌变异等现象时，报告老师及时研究处理。
检查项目：菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形态、生化特性等。
2.控制传代次数，超过5代后，需用最初保藏的菌种重新传代。
3.创造适宜的培养条件，在实践中，有人发现如创造一个适合原种的生长条件，就可在一定程度上防止菌种衰退。
如改变培养基成分、改变培养温度等；4减少冻融次数，工作菌种使用时做好记录，使用4-5次需更换一管。
（三）菌种的提纯从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，经过扩大培养，就可恢复原菌株的典型性状，继续供科研及生产使用。
一种是只要求达到菌落纯化的水平，即进行复苏活化处理，就是平板划线后，挑取单克隆，培养后，观察性状如何，选取性状稳定的菌，在对数期中期进行保藏。
该方法较为粗放，适用于菌退化不太严重的情况；另一类方法，可达到“细胞纯”的水平，采用单胞分离法，也可以二者结合，先用前一种方法获得较纯的菌种后再采用单胞分离法进一步纯化。
如果是重组菌退化了的话，还可以重新利用质粒进行转化。
（四）菌种的复苏：狭义的复苏仅是一种消极的措施，它指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的一种措施；从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。
广义的复苏则应是一项积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提高。
所以，这实际上是一种利用自发突变（正变）不断从生产中进行选种的工作。
即有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。
操作过程：将保藏的菌种从冰箱中拿出，用灭菌的接种环挑取适量菌种，划线于固体培养基，在适宜的温度培养适宜的时间，提取单克隆，并进行菌种确认，确认后重新保菌。
注意事项：将保存的菌种从-80 °C拿出来后，速度要尽量的快，不要反复冻融，因为会导致菌种退化。
所以，不用等到菌种融化再吸取，可以直接刮两下冰即可。
菌种在打开前应仔细核对标签上菌名、菌号。
并注意一株菌种使用一套打开用具，严防交叉污染。
菌种复苏应在超净工作台内操作。
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、生孢梭菌和白色念珠菌可同时接种液体培养基和琼脂培养基斜面，枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、藤黄微球菌和黑曲霉可接种琼脂培养基斜面。
取琼脂培养基斜面上的菌苔按要求对菌种的纯度进行鉴定。
（五）菌种确认：微生物传代中的菌种确认是必须的。
对菌种进行纯培养，根据菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形态、生化特性等结果进行菌种确认。
用无菌接种环取上述培养物接种到宜于该菌生长的鉴别培养基平板上，然后在30～37℃下培养适宜的时间。
培养后，首先观察其是否具有典型的菌落形态，然后挑取生长旺盛的单一的纯菌落，划线于平皿培养基，每种菌划4个平皿，以便收集较多的生长旺盛的典型单菌落，进行保存和鉴定。
鉴定时作革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及形态特征。
必要时再做生化实验以进一步鉴定该菌种。
若在该平板上发现有其它菌落生长，则说明操作有污染或菌种不纯，应将此被污染了的培养物灭活处理，并寻找原因。
应根据其原因采取措施重新分离挑选纯菌落。
（六）菌种的管理1. 定期检查，保藏的菌种应定期检查，一般每年检查1—2次，所有菌种的保藏都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。
在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。
对微生物生产菌种来说，保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。
2.在有效期内做好复苏活化、分离、纯化、鉴定再保藏的工作。
发现染菌变异等现象时，报告老师及时研究处理。
3.菌种的来源、复苏、使用和鉴定等均应做好详细记录。
管理记录中还应包括（但不限于）以下内容：从原始菌种传代到工作用菌种的代数；菌种生长的培养基及孵育条件；菌种生存条件。
4.减少冻融次数，要记录菌株使用次数，用上4-5次时应更换一管。
5试验菌种不得任意带出菌种保存实验室。
外单位索取菌种时，应包装严密，妥善保存。
6过期菌种应`及时销毁，销毁时应经121°C，20分钟的生物灭活处理。
