蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验报告

一、实验目的1. 掌握蛋白质的鉴定方法。

2. 学会使用双缩脲试剂进行蛋白质鉴定实验。

3. 了解蛋白质鉴定实验的原理及注意事项。

二、实验原理蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物，具有复杂的结构和多种生物学功能。

蛋白质的鉴定主要基于其特有的氨基酸序列和空间结构。

本实验采用双缩脲试剂鉴定蛋白质，原理如下：在碱性条件下，蛋白质分子中的肽键与Cu2+离子发生反应，形成紫红色的络合物。

络合物的颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，从而实现蛋白质的定量分析。

三、实验材料1. 蛋白质样品：鸡蛋清、牛奶、豆奶等。

2. 双缩脲试剂：A液（含0.1g/mL NaOH溶液）、B液（含0.01g/mL CuSO4溶液）。

3. pH试纸、试管、移液器、滴管、白瓷板等。

四、实验步骤1. 准备样品：分别取鸡蛋清、牛奶、豆奶等蛋白质样品，用蒸馏水稀释至适当浓度。

2. 检测蛋白质含量：取3支试管，分别加入0.5mL鸡蛋清、牛奶、豆奶样品，再加入1mL蒸馏水。

3. 添加双缩脲试剂：向每支试管中加入1mL A液，摇匀。

4. 观察颜色变化：静置5分钟，观察溶液颜色变化。

5. 比色：取3支试管，分别加入1mL A液、B液，摇匀。

将上述样品试管与比色管进行比对，观察颜色深浅。

五、实验结果与分析1. 鸡蛋清、牛奶、豆奶样品在加入双缩脲试剂后，溶液颜色均呈紫红色，说明蛋白质含量较高。

2. 比色结果显示，鸡蛋清样品颜色最深，牛奶次之，豆奶最浅。

这可能是因为鸡蛋清中的蛋白质含量最高，牛奶次之，豆奶最低。

六、实验讨论1. 本实验中，双缩脲试剂对蛋白质的鉴定具有较高的灵敏度，能够有效区分不同蛋白质样品。

2. 实验过程中，应注意pH值对蛋白质鉴定的影响。

本实验采用碱性条件，有利于蛋白质与Cu2+离子发生反应。

3. 实验结果受蛋白质样品浓度、试剂比例等因素影响。

在实验过程中，应严格控制这些因素，以确保实验结果的准确性。

七、实验结论通过本实验，我们掌握了蛋白质的鉴定方法，学会了使用双缩脲试剂进行蛋白质鉴定实验。

生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称蛋白质含量测定——双缩脲试剂法实验日期实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.1.掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作；1.2.掌握双缩脲试剂的配制；1.3.熟悉血清总蛋白的临床意义；1.4.了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。

二、实验原理2.1.两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。

2.2.蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。

三、材料与方法：3.1.实验材料：3.1.1.实验试剂：①小牛血清；②6.0mol/LNaOH溶液；③双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾；④蛋白质标准液（70g/L）；⑤0.9%NaCl；⑥蒸馏水。

3.1.2.实验器材：①试管；②烧杯；③容量瓶；④加样枪；⑤刻度吸管；⑥玻璃棒；⑥1100分光光度计；⑦电子天平；⑧水浴锅。

3.2.实验步骤0.9%Nacl 0.5 - -双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0测定次数1 2 3 平均吸光度依据公式算出结果：）蛋白质标准液浓度（）血清总蛋白（g/LAAg/LSU⨯=四、结果与讨论：4.1.实验现象：①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0.5ml，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。

②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min，取出后，B试管呈淡蓝色，S试管和U试管均成浅紫色，且S试管的颜色比U试管的颜色深。

（如图一）图一水浴后三支试管颜色图二分光计读数S 0.185 0.184 0.185 0.1847U 0.152 0.151 0.152 管号0.1517结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L)，得出结果：血清总蛋白=57.493g/L。

一、实验目的1. 学习双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。

2. 掌握双缩脲试剂的配制和使用。

3. 了解实验过程中可能出现的误差及解决办法。

二、实验原理双缩脲法是一种经典的蛋白质定量方法，其原理基于蛋白质分子中的肽键与铜离子（Cu2+）在碱性条件下发生反应，生成紫红色络合物。

该络合物在特定波长（如540nm）处的吸光度与蛋白质含量呈正比关系。

通过测量吸光度，可以计算出蛋白质的浓度。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质标准液（已知浓度）- 待测样品（含有未知蛋白质）- 双缩脲试剂A（含CuSO4）- 双缩脲试剂B（含NaOH）- 6mol/L NaOH溶液- 0.1mol/L HCl溶液- 10g/L NaCl溶液- 移液器- 容量瓶- 烧杯- 比色皿- 分光光度计2. 实验仪器：- 移液器- 容量瓶- 烧杯- 比色皿- 分光光度计四、实验步骤1. 配制双缩脲试剂：- 称取0.1g硫酸酮（CuSO4）溶于50mL去离子水中。

- 称取1.5g酒石酸钾钠溶于50mL去离子水中。

- 称取0.05g碘化钾溶于50mL去离子水中。

- 将三种溶液混合，搅拌均匀，备用。

2. 准备蛋白质标准液：- 将蛋白质标准液用去离子水稀释至一定浓度，备用。

3. 准备待测样品：- 称取一定量的待测样品，用去离子水稀释至一定浓度，备用。

4. 标准曲线的制作：- 取7支试管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL蛋白质标准液，然后依次加入1.5mL双缩脲试剂A和1.5mL双缩脲试剂B。

- 将试管放入水浴中加热10分钟，取出冷却至室温。

- 用移液器取0.5mL溶液于比色皿中，以空白试剂为参比，在540nm波长处测定吸光度。

- 以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

5. 待测样品的测定：- 按照标准曲线的制作步骤，对待测样品进行测定。

- 根据标准曲线，计算出待测样品中蛋白质的含量。

五、实验结果与分析1. 标准曲线的制作：- 在540nm波长处，蛋白质含量与吸光度呈良好的线性关系，相关系数R²=0.998。

一、实验目的1. 理解蛋白质测定的原理和方法。

2. 掌握双缩脲试剂法测定蛋白质含量的基本操作步骤。

3. 学会使用分光光度计进行蛋白质定量分析。

二、实验原理蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的大分子有机化合物，具有重要的生物学功能。

蛋白质含量是生物样品中的重要指标之一。

本实验采用双缩脲试剂法测定蛋白质含量，该法基于蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子发生反应，生成紫红色络合物，其吸光度与蛋白质含量成正比。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：鸡蛋清、牛血清白蛋白、牛血清、双缩脲试剂A、双缩脲试剂B、蒸馏水、分光光度计等。

2. 试剂：（1）双缩脲试剂A：称取硫酸铜0.1g，溶于50mL蒸馏水中；（2）双缩脲试剂B：称取酒石酸钾钠0.5g、碘化钾0.1g，溶于50mL蒸馏水中；（3）蛋白质标准溶液：配制浓度为0.1mg/mL的蛋白质标准溶液。

四、实验步骤1. 标准曲线绘制（1）取6支10mL具塞试管，分别加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL蛋白质标准溶液；（2）向各试管中加入1.5mL双缩脲试剂A；（3）混匀，室温放置10分钟；（4）加入5mL双缩脲试剂B；（5）混匀，室温放置10分钟；（6）以蒸馏水为空白，用分光光度计在540nm波长处测定吸光度；（7）以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品测定（1）取6支10mL具塞试管，分别加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL待测样品；（2）同标准曲线绘制步骤，测定吸光度；（3）根据标准曲线，计算样品蛋白质含量。

五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性方程为：y = 0.0019x + 0.0032，相关系数R² = 0.9986。

2. 样品测定根据标准曲线，计算各样品蛋白质含量如下：（1）鸡蛋清：0.5mg/mL；（2）牛血清：0.4mg/mL。

一、实验目的1. 了解双缩脲反应的原理及实验方法。

2. 掌握双缩脲试剂的配制方法。

3. 学会使用分光光度计进行定量测定。

4. 分析实验结果，验证双缩脲反应的原理。

二、实验原理双缩脲反应是蛋白质和多肽分子中肽键在碱性溶液中与硫酸铜反应，生成紫红色的络合物。

该络合物在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。

通过测定吸光度，可以计算出蛋白质的含量。

实验原理如下：1. 蛋白质和多肽分子中含有大量的肽键（-CO-NH-）。

2. 在碱性溶液中，肽键与Cu2+离子发生络合反应，生成紫红色的络合物。

3. 紫红色络合物在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质标准溶液（如牛血清蛋白）- 待测样品- 双缩脲试剂A（含CuSO4）- 双缩脲试剂B（含NaOH）- 6mol/L NaOH溶液- 0.1mol/L HCl溶液- 容量瓶- 移液器- 分光光度计- 10mm光程比色皿2. 实验仪器：- 电子天平- 烧杯- 玻璃棒- 移液管- 滴定管四、实验步骤1. 标准曲线的制作：- 准备一系列已知浓度的蛋白质标准溶液。

- 将标准溶液按照一定比例稀释，使其浓度在10～120g/L范围内。

- 取10mm光程比色皿，依次加入标准溶液、双缩脲试剂A、双缩脲试剂B，混匀。

- 在540nm波长下，用分光光度计测定吸光度。

- 以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 待测样品的测定：- 取10mm光程比色皿，依次加入待测样品、双缩脲试剂A、双缩脲试剂B，混匀。

- 在540nm波长下，用分光光度计测定吸光度。

- 从标准曲线上查出待测样品的蛋白质含量。

3. 结果分析：- 根据实验数据，计算待测样品的蛋白质含量。

- 分析实验结果，验证双缩脲反应的原理。

五、实验结果与分析1. 标准曲线的制作：- 标准曲线呈线性，相关系数R²>0.99，说明双缩脲反应在实验条件下具有良好的线性关系。

1. 理解并掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理。

2. 学会使用双缩脲试剂进行蛋白质含量的测定。

3. 通过实验，了解实验误差的产生及其控制方法。

二、实验原理双缩脲法是一种基于蛋白质分子中肽键与铜离子反应产生紫色络合物的分析方法。

当蛋白质分子中的肽键在碱性条件下与铜离子作用时，会形成紫红色的络合物。

该络合物在540nm波长处的吸光度与蛋白质含量呈正比关系，因此可以通过测定吸光度来推算蛋白质的含量。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质标准品- 待测蛋白质样品- 双缩脲试剂- 6mol/L的NaOH溶液- 0.1g/mL的硫酸铜溶液- 7支试管- 移液器- 分光光度计2. 实验仪器：- 磁力搅拌器- 电子天平- 移液管- 量筒1. 标准曲线的制作：- 取7支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的蛋白质标准品溶液，用水补足至1ml。

- 各管中加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀。

- 在室温下反应30分钟。

- 使用分光光度计在540nm波长处测定吸光度。

- 以蛋白质标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2. 样品测定：- 取待测蛋白质样品1ml，加入4ml双缩脲试剂，充分摇匀。

- 在室温下反应30分钟。

- 使用分光光度计在540nm波长处测定吸光度。

- 从标准曲线上查找对应的蛋白质含量。

五、实验结果与分析根据实验步骤，绘制标准曲线，并在标准曲线上查找待测样品的蛋白质含量。

实验结果显示，待测样品的蛋白质含量为X mg/mL。

六、实验讨论1. 误差分析：- 误差主要来源于实验操作、试剂质量、仪器精度等因素。

- 为了减少误差，需要严格控制实验操作，使用高精度的仪器，并确保试剂质量。

2. 干扰因素：- 双缩脲法测定蛋白质含量时，一些物质可能会产生干扰，如三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等。

- 为了排除干扰，可以在实验前对样品进行预处理，如透析、凝胶过滤等。

3. 注意事项：- 在使用双缩脲试剂时，必须注意试剂的配制和储存条件。

双缩脲法测定蛋白质实验报告
蛋白质的双缩脲法测定是常见的生物化学实验。

它是用来测定有机物中大量焦磷酸核苷（DNS）和蛋白质的10比热容变（TN）的定性分析试验。

一般根据实验结果，可求出有机物中蛋白质的含量。

本实验使用DNS溶液，蛋白质粉末（2mg），有机溶液（2mL），稀盐酸，硫酸、蒸馏水等试剂，运用比热容法来定量测定蛋白质，把响应者溶液和反应者溶液放入比热容杯中，先测测热曲线，记录溶液温度, 再加入反应者，再测测热曲线，记录溶液温度。

之后计算比热容，再从比热容图中求出10比热容变（TN），可由TN和蛋白质抗原浓度（P）重新计算出C蛋白质浓度，以检验蛋白质是否重正确。

本实验首先将22.725mL的2mol/L的硫酸溶液加入比热容杯中，用比热容仪对其温度变化进行测定，测得TN值为10.27 J/g•°C。

然后将8mg的蛋白质粉末和2 mL的稀盐酸中加入到比热容杯中，再测定温度，得到TN值为20.72 J/g•°C。

最后，将TN值相减，得出蛋白质的10比热容变（TN）值为10.45 J/g•°C，根据 TN与P的关系，得出蛋白质浓度C 为1.575mg/mL。

试验结果表明，采用双缩脲法测定有机物中蛋白质的含量是简单、准确、快捷的方法，可以更有效地进行蛋白质测定实验。

蛋白质含量测定——双缩脲试剂法-实验报告生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：生物化学与分子生物学实验教学中心3.2.实验步骤四、结果与讨论：4.1.实验现象：①选取三支洁净无损的试管，从左往右依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的小牛血清各0.5ml，分别命名为B试管、S试管和U试管，再分别向三支试管内加入4ml的双缩脲试剂，溶液均成蓝色透明状。

②将三支试管放入37℃水浴锅中加热20min ，取出后，B 试管呈淡蓝色，S 试管和U 试管均成浅紫色，且S 试管的颜色比U 试管的颜色深。

（如图一）图一 水浴后三支试管颜色 图二 分光计读数S 0.185 0.184 0.185 0.1847 U 0.152 0.151 0.152 0.1517结果计算：代入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X 蛋白质标准液浓度（g/L)，得出结果：血清总蛋白=57.493g/L 。

4.3.结果讨论经查阅资料得：正常成人血清总蛋白含量为60～80g/L ，而小牛血清总蛋白含量比正常成人血清总蛋白含量略低一点，本次结果得出小牛血清总蛋白含量为57.493g/L ，符合情况。

4.3.1.成功原因：①本次试验的试剂混合水浴后出现了预期效果：B 试管呈淡蓝色，S 试管和U 试管均成浅紫色，且S 试管的颜色比U 试管的颜色深。

B 试管呈淡蓝色是因为B 试管中没有发生任何反应，所以呈现双缩脲试剂本来的淡蓝色，而S 试管和U 试管呈浅紫色是因为试剂中的蛋白质和双缩脲发生了双缩脲反应而呈浅紫色。

②吸光度测试后得到的数据，经计算后得到了预期中的结果，是因为前面操作严谨。

4.3.2.误差分析①三次重复测定过程中出现了一些浮动数据，可能是因为仪器本身存在的可允许的误差范围。

②第一次尝试使用分光光度计的时候得到了负值，经查明是因为放置在其内的比色杯将磨面对准了通光面，经调整后，获得了正确的数据。

4.4.课后复习题4.4.1.什么叫双缩脲试剂？为什么要在双缩脲试剂中加入酒石酸钾钠和碘化钾？答：双缩脲试剂是一个用于鉴定蛋白质的分析化学试剂，遇到蛋白质显紫色。