粪大肠菌群的测定步骤

GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定

1 范围

本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。

2 定义

粪大肠菌群 fecal coliforms

系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。

粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。

3 设备和材料（内容略）

4 培养基和试剂

培养基：遵照附录A的规定。

革兰氏染色液：遵照附录B的规定 （略）。

5 检验步骤

样品稀释

在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200 r/min充分振荡30min，即成10-1稀释液。

用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。

乳糖发酵试验

选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。

分离培养

从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。

证实试验

从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。

结果

证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。

附 录 A

（规范性附录）

培养基

乳糖胆盐发酵培养基

蛋白胨 g

猪胆盐 g

乳糖 g

%溴甲酚紫水溶液 mL

职业教育环境监测与治理技术专业教学资源库 《环境监测》单元教学要求

项目四 城镇污水监测

任务7 水中粪大肠菌群的测定（多管发酵法）

单元教学要求

一、教学目标

（粪）大肠菌群是我国环境质量标准和污染物排放标准的重要监测指标，水中粪大肠菌群的测定是环境监测工作中的一项污水监测的核心技能，所涉及的工作任务直接体现在各级环境监测站、城镇污水处理厂、工矿企业环境监测机构等工作岗位上。目前，多管发酵法是传统的粪大肠菌群检测方法，具有不受浊度的影响、价格便宜等优点。通过该项目实施使学习者学会水中粪大肠菌群测定的依据、培养基配制、灭菌步骤、培养过程、鉴别方法等，能根据测定结果判断出水是否符合相应排放要求，并能为污水处理工艺运行管理提出合理化建议。

1. 知识目标

（1）掌握粪大肠菌群的数量在卫生学上的重要性；

（2）掌握多管发酵法测定粪大肠菌群的原理及方法。

2. 技能目标

（1）熟练掌握多管发酵法测定粪大肠菌群的试验步骤；

（2）掌握实验室微生物无菌操作的步骤和注意事项。

3. 素质目标

（1）遵守实验室纪律；

（2）培养与组员配合协作的能力。

二、教学条件

（1）主讲教师：有相关专业的学历背景，有从事环境监测及微生物培养工作岗位的经历；并经过高职教育教学的培训，能胜任“教学练做”一体化的教学模式。

（2）教学材料：正式出版的高职类环境监测规划教材、国家环境保护行业标准测定方法及工学结合特色明显的案例。

（3）实验实训设备条件：学习场地、教学设施设备要适应“教、学、练、做”项目化的要求，配置一定的多媒体、仿真、实训场地。

三、教学安排

1.小组课下活动：学习小组查阅关于水中粪大肠菌群测定的资料、相关的标准、技术规范等。

2.课下准备：教师指导，学生实验小组根据国家环境保护行业中关于水中粪大肠菌群的标准测定方法，经讨论分析，确定测定项目。 职业教育环境监测与治理技术专业教学资源库 《环境监测》单元教学要求

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粪大肠菌群计数步骤 GB/T 4789.39-2008

一、设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ 。

2 冰箱：2℃~ 5 ℃ ．

3 恒温水浴箱：44.5 ℃±0.2 ℃ 。

4 天平：感量0.1g 。

5 均质器。

6 振荡器。

7 无菌吸管：1 mL （具0.01 mL 刻度）、10 mL （具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。

8 无菌锥形瓶：容量500 mL 。

9 无菌培养皿：直径90 mm 。

10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。

二、培养基及试剂

1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（lauryl sulfate tryptose , LST ）肉汤

2 EC 肉汤（E.coli broth )

3 无菌生理盐水：称取8.5g 氯化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中，121 ℃ 高压灭菌15 min。

4 4mol/L 氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中

5 1 mol/L 盐酸（HCl ） ：移取浓盐酸90 mL ，用蒸馏水稀释至1 000 mL

操作步骤

6.1 样品的稀释

6.1.1 固体和半固体样品：称取25g 样品，置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min ~10000r/min 均质1 min ~2 min ，制成1：10 样品匀液，或置225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍打式均质器拍打1 min ~2 min ，制成1 : 10 的样品匀液。

6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取样品25 mL 置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1 : 10 的样品匀液。

6.1.3 样品匀液的pH 值应在6.5 ~7.5 之间，必要时分别用1 mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。

粪大肠菌群的测定

1 卫生学意义

粪大肠菌群测定的卫生学意义：一、与大肠菌群相比，粪大肠菌群在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。因此，粪大肠菌群的存在表明食品近期内可能直接或间接的受到了粪便的污染；二、作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性；三、常用做贝类和贝类养殖用水的卫生指标 。

2 检验方法

2.1 术语与定义

一群在44.5℃培养24h-48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

卫生学概念，又称为耐热大肠菌群，主要是大肠杆菌，但也包括克雷伯氏菌属等。

2.2 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

（1）恒温培养箱：36℃±1℃。

（2）冰箱：2℃～5℃。

（3）恒温水浴箱：46℃±1℃。

（4）天平：感量0.1g。

（5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

（6）无菌锥形瓶：容量500mL。

（7）无菌培养皿：直径90mm。

（8）pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。

2.3 培养基和试剂

（1）月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：

1）成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0g；氯化钠：5.0g；乳糖：5.0g；磷酸氢二钾（K2HPO4）：2.75g；磷酸二氢钾（KH2PO4）：2.75g；月桂基硫酸钠：0.1g；蒸馏水：1000mL；pH：6.8±0.2

2）制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 ℃高压灭菌15 min。

（2）EC肉汤（E.coli，BGLB）：

1）成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0 g；3号胆盐或混合胆盐：1.5 g；乳糖：5.0g；磷酸氢二钾（K2HPO4）：4.0g；磷酸二氢钾（KH2PO4）：1.5g；氯化钠：5.0g；蒸馏水：1000mL；pH：6.9±0.1。