Western Blot Protocol

Western Blot Protocols1. Transfer proteins from gel to membrane (nitrocellulose of PVDF): Gloves should be worn when handling gels or blot membranes.∙ A. Pour enough transfer buffer (or CAPS buffer) into a container so that half of the assembled cassette w ill be 0.5 cm below the surface of the buffer.∙ B. After the gel has finished running, carefully remove the front glass plate and remove the stacking g el. Remove a small portion of the upper left-hand corner of the running gel to mark its orientation during the transfer pr ocess.∙ C. Wet the membrane w ith transfer buffer and carefully lay it across the exposed running gel, making sure that air bubbles between the gel and membr ane are excluded. In the same fashion, add two layers of pre-wetted filterpaper to the membrane. Pre-wet one of the cassette sponges and add to the stack. Top with the outer half of thecassette itself and carefully turn the entire stack of glass plate, gel, membrane, filter paper, sponge and cassetteover. Place the stack in the container w ith transfer buffer.∙ D. Carefully remove the second glass plate from the gel. Using the same process, make sure that no air bubbles have for med between the gel and the membrane.∙ E. Keeping the stack generously wet, top the gel w ith two layers of pre-wet filter paper, wet sponge and the remaining half of the cassette unit. Snap the cassette unit together firmly.∙ F. Place the cassette into the tr ansfer unit so that the current w ill flow through the gel onto the membrane. This would be w ith the gel closer to the black (-) cathode and the membrane closer to the red (+) anode.∙G. Add transfer (or CAPS) buffer to the transfer unit according to manufacturer's directions. Transfer over night witha setting of 20V / 40 mA or for 3 hours at 70V/160 mA. The transfer process needs to take place under coldtemperatures to prevent the gel fr om sticking to the membrane. This can be accomplished either by using a w ater cooling core in the transfer unit or placing the entir e unit at 4°C. Please follow the manufacturer'srecommendations.∙H. At the end of the transfer per iod, disconnect the power connections and disassemble the cassette. All of the Coomassie Blue-dyed bands should now be on the membrane leaving the gel fairly clear.2. Staining the Blot (Optional):∙ A. Br iefly w ith water, rinse any bits of gel off the blot then incubate it in ponceau S solution for 1 minute. Rinse in water until the background is reduced.∙ B. Place the membr ane on a transparency sheet and photocopy the blot for a permanent transfer record.∙ C. Rinse the blot several times in TBS-Tween to remove the stain.3. Blocking the Blot:∙ A. Gently shake the blot for 2 hours in 5% non-fat dry milk/TBS/Tween at room temperature or at 4°C on a rocker.∙ B. Either pour off blocking buffer or transfer the blot to a sealing bag for probing.4. Probing the Blot:∙ A. Dilute the pr imary antibody in 5% non-fat dry milk/TBS. Add to the blot, seal the container and gently rock for 2 hours at room temperatur e or over night at 4° C. If using a bag for the incubation, eliminate all air bubbles beforesealing.∙ B. Remove the pr imary antibody and wash the blot 3 x 5 minutes in TBS/Tween. In some instances, the primary antibody can be saved for additional blot procedures.∙ C. Dilute the secondary antibody in 5% non-fat dry milk/TBS. Add to the blot, seal and incubate as before.∙ D. Remove the secondary antibody and w ash the blot 3 x 10 minutes in TBS/Tween.5. Detection / Chemiluminescence:∙ A. Cut two transparency sheets to fit into the film cassette.∙ B. Mix oxidizing and luminol reagent (from Dupont NEN) in a 1:1 ratio.∙ C. Pour onto a piece of parafilm and lay the blot on the pool of solution for 1 minute.∙ D. Insert the blot into the cassette and top w ith the remaining sheet of transparency, making sure that all bubbles are eliminated.∙ E. Insert film and close cassette. Start w ith a 1 minute exposure and adjust from there. The signal w ill decay over time. If no bands are found, the blot can be rinsed and stored in PBS/Tw een overnight for repeated blocking andprobing.6. Str ipping and Reprobing Blots : Works well w ith chemiluminescence and radioactive detection, but is not useful in colorimetr ic detection due to the production of an insoluble reaction product formed as a results of that detection method.∙ A. Br iefly r inse the blot in water.∙ B. Wash the blot 2 x 10 minutes in TBS/Tween.∙ C. Re-block in 5% milk/TBS/Tween for one hour at room temperature.∙ D. Add stripping buffer to the blot, seal the container and incubate for 30 minutes at 50° C. Occasionally agitate the container for best results.∙ E. Wash the blot 2 x 30 minutes followed by 2 x 10 minutes in TBS/Tw een.∙ F. If desired (optional), can incubate the blot in the detection reagent and expose to film to ensure that no residual detection antibody remains. In order to check for the presence of primary antibody, the blot would have to beincubated with secondary antibody and detection reagent to ver ify complete removal.∙G. Block the blot for 2 hours in 5% milk/TBS/Tw een at room temperature before probing w ith the desired primary antibody again.。

Western Bloting (张雪雁)操作步骤：1.做胶：下层胶7.5ml一块，以水或乙醇隔离空气。

待下层胶凝固后做上层胶，每块胶配置3ml，灌胶、插梳子，赶走气泡。

2.蛋白变性：在胶凝固过程中，变性蛋白质，蛋白质的上样量按事先所测弄浓度计算准确，分装到EP管或，按5ul/100ul样品的浓度加β—巯基乙醇，然后以PCR仪95℃变性10分钟。

3.上样、电泳：1）上层胶为安全凝固（大约15分钟）后，两只手同时向上用力取下梳子。

以蒸馏水仔细清洗各泳道内残留得碎胶。

2）将SDS—PAGE胶转移到电泳槽中，如果只做一块胶，对面以玻璃板平衡。

1х电泳缓冲液充满电泳槽后，以玻璃棒将电泳槽中的气泡尽量赶除。

3）先以少量加有溴酚蓝1х上样缓冲液标记各泳道。

4）变性过的各管蛋白质样品以加有溴酚蓝1х上样缓冲液补齐至50ul。

蛋白Marker也补齐至50ul。

5）以一定顺序将蛋白样品和Marker，用微量移液器加至泳道。

上样过程中，手要稳，避免将泳道划破，样品自枪头打出时要缓慢，以免样品自泳道飘出。

剩余未加样的泳道以50ul上样缓冲液平衡。

6）加样完毕，红对红，黑对黑将电泳槽和电泳仪接好，打开电源，电压调至60-100V之间。

一般来说样品在上层胶时电压可稍高，进入下层胶后较低的电压容易将个分子量蛋白粉理清楚。

溴酚蓝自胶内跑出后电泳结束。

4.电转：1）准备PVDF膜及滤纸。

PVDF大小8.2х5～5.5，滤纸按电转海绵大小剪，一块胶准备四张滤纸。

2）将PDVF膜置于干净的容器中，倒入适量甲醇浸泡1～3分钟，然后浸泡于电转浸泡液中。

3）小心取出两层玻璃之间的胶，切去上层胶。

在电转液中完成如下：电转孔板黑色面铺放海绵一张，依次铺放滤纸两张，胶一块，PVDF膜一张，滤纸再两张，海绵再一张，然后小心扣好孔板，将其黑色面对黑色面扣入电转架，将电转架放入电泳槽。

电泳槽内置小冰盒一个，整个电泳槽置于大冰盒中。

4）接好电源，按蛋白分子量大小调整电压。

Western blot1.蛋白提取：细胞或者组织匀浆液Ripa裂解液的配置：总体积：100ml向烧杯中加入30ml millipore水，置于搅拌器上，放入搅拌子搅拌，加入0.876g 氯化钠，加入0.5g 脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate)，加入1ml NP-40，加入1m 10% SDS，加入5ml 1M Tris-Cl (ph=8.0)，待溶解完全并混匀后转移到量筒中，并用millipore水洗几次烧杯，然后倒入量筒中，定容到100ml，倒入到试剂瓶中，标记备用。

配置细胞裂解液：1ml ripa buffer+5ul 0.1M PMSF + 1ul 1ug/ul leupeptin + 5ul 1M DTT（二硫苏糖醇）Protease Inhibitor Target Protease Working ConcentrationSerine proteases 0.1 – 1 mMPMSF (Phenylmethylsulfonylfluoride苯甲基磺酰氟)Benzamidine（苯甲脒）Serine proteases 1 mMPepstatin A （胃酶抑素）Thiol proteases（巯基蛋白酶） 1 μg/mlLeupeptin（亮抑酶肽）Thiol proteases 1 μg/mlAprotinin （抑肽酶）Serine proteases 5 μg/mlAntipain （抗蛋白酶）Thiol proteases 1 μg/mlEDTA and EGTA Metalloproteases 0.1 – 1 mM检测磷酸化的蛋白时需加入氟化钠NaF和钒酸钠Na3VO4来保护磷酸化的蛋白不会被磷酸酶还原。

在做磷酸化的signal transduction时必需添加。

蛋白提取：细胞：向培养皿中加入细胞裂解液，置于冰上摇10分钟，收集裂解液，4度离心，最大转速离心15分钟，收集上清液，备用，（分装，放到-20度保存）组织：向新鲜组织中加入裂解液，用匀浆器裂解混匀，4度离心，最大转速离心15分钟，收集上清液，备用，（分装，放到-20度保存）2.制胶：根据待测蛋白大小制备不同浓度的胶分离胶：见配胶浓度表对于1mm制胶版需至少5ml分离胶浓缩胶：见配胶浓度表需3ml浓缩胶H2O 30% acrylamide(丙烯10%APS TEMED 1.5M Tris(8.8) 1.0M Tris(6.8) 酰胺)2.3ml 1.3ml 50ul 5ul 1.3ml8%分离胶（5ml）2.1ml 0.5ml 30ul 3ul 0.38ml5%浓缩胶（3ml）3.玻璃板用酒精棉球擦一遍，晾干，短板向外夹好在绿色架上。

蛋白印记WesternBlotprotocolWestern blot for PAR-2一、试剂的配制1. PMSF(100 mM)的配制:0.1742 g PMSF → 10 ml异丙醇（－20℃保存）2. 裂解液的准备:购自碧云天公司，分强，中，弱三种（三个小瓶,各50 ml）.在提取总蛋白之前3－5min，将分装裂解液（强）融化置于冰上,每个肌条300－500ul裂解液不要超过450ul,(1ml加入100 mM的PMSF10 μl（使PMSF 的终浓度为1 mM），置于冰上。

(－20℃保存）3.2X Sample Buffer(要用才配或配好后置于-80℃)1倍DTT加上9倍的2X Laemmli Buffer(1). DTT (Di-dithiothreitol) 1M1.542 g DTT →10 ml的10 mM Sodium acetate(醋酸钠)（pH=5.2）中10 mM Sodium acetate(醋酸钠)：0.082 g 无水醋酸钠→ 100 ml dH2O(2). 2X Laemmli Buffer (100 ml) (置于－20°C，经常使用时置于4°C)Glycerol （甘油）20 mlβ-mercaptoethanol （β-me，β-巯基乙醇） 5 ml （恶臭，注意安全）20﹪SDS （十二烷基硫酸钠）10 mlBromophenol Blue（溴酚蓝）20 mg1.5M Tris-Cl（三羟甲基氨基甲烷）pH=6.820 ml (90.855 g Tris→420 ml dH2O,浓盐酸滴定至pH=6.8，定容至500 ml ) dH2O 45 ml4.30％ A+B溶液29．2 g Acrilamide (丙烯酰胺)0．8 g Bis－acrilamide (甲叉双丙烯酰胺)Add dH2O dilute to 100 mL and filter 避光4°C储存注意：该两种药品有毒，配药时注意安全PS. Acrylamide 及Bisacrylamide 是neurotoxin会穿过皮肤，配药时要穿实验衣及戴口罩。

Western blot 步骤(1)蛋白样品制备离心收集菌体。

加入200μl SDS-PAGE loding buffer重悬菌液，100°C煮6min，然后上样。

(2) SDS-PAGE电泳上样蛋白量为15μl。

(3) 转膜1、制备足够转移缓冲液以用于平衡凝胶和膜以及润湿滤纸。

2、从玻璃板上取下凝胶，去除所有浓缩胶。

3、将凝胶浸入转移缓冲液中10~15 分钟。

4、滤纸在转移缓冲液中至少浸泡10分钟。

5、准备PVDF膜：剪取一张PVDF膜以及4张转膜滤纸(膜与滤纸的面积应等于或略大于凝胶)。

PVDF膜在甲醇中润湿膜10 秒；接着小心将膜放入双蒸水水中浸泡2 分钟；然后小心地把膜放入转移缓冲液中平衡至少10 分钟。

6、转膜（并标记MARKER）打开转膜装置依次铺上第一层滤纸，第二层滤纸，胶，PVDF膜，第三层滤纸，第四层滤纸，每次都用15ml离心管擀出气泡。

膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。

接线，盖上盖子，开电源跑00:30~2:00h。

如果要看转移后的效果，可转膜完成后用丽春红染液对膜进行染色，具体的操作步骤如下：1、将膜置于培养盒中。

2、加适当体积的丽春红S，在脱色摇床中染色５分钟，观察转印效果。

3、去除染液（可重复使用），双蒸水洗膜两次，每次5 分钟，这时如果膜上有转印的蛋白时，可以看见数条蛋白条带及泳道痕迹。

(4) 封闭：将膜(如膜干应先用甲醇湿润)用PBST稍漂洗2次，每次5min。

浸泡于封闭液(BLOTTO+T)中于37℃2小时(三维摇床50/分)。

(5) 洗膜：在培养皿中用PBST洗两遍，每遍约5min。

稀释一抗：用预先配制的BLOTTO+T来6倍稀释一抗。

配制一抗（稀释6倍）：0.33ml血浆+0.67ml BLOTTO+T。

(6) 膜与一抗孵育：把膜转至另一干净培养皿，加进一抗，于室温用三维摇床摇4℃过夜。

(7) 稀释二抗：取出培养皿，把膜移至另一培养皿，加进预制的PBST约15ml，洗4次，每次5min。

一．绘制BSA标准曲线(目的：测蛋白浓度)1.方法：BCA法(生工)2.需要配的试剂：1× PBS溶液10× PBS溶液：Na2HPO48 mMNaCl 136mMKH2PO4 2mMKCl 2.6mM3.注意：① 用分光光度计测定A562吸光值时，所需样品最小体积为1ml，即，加样体积为：1× PBS—0.5ml，BCA工作液—0.5ml；① 由于缓冲液1× PBS与BCA工作液是1:1等体积加的，所以，BSA被稀释为初次用1× PBS配制的梯度浓度的1/ 2，即，在绘制标准曲线时，BSA的终浓度需要÷ 2，切记！二．提取总蛋白1.试剂：配制时佩戴手套、口罩。

(1)单一母液：① 1M Tris (pH=8.0)：4℃保存称取12.114g Tris-base，加少于100ml蒸馏水溶解，调pH后，定容至100ml。

① 0.5M EDTA (pH=8.0)：4℃保存称取14.61g EDTA，加少于100ml蒸馏水，加固体NaOH至pH约为8.0时，EDTA方开始溶解，溶液状态变化过程：白色乳浊液——白色胶状物——白色乳浊液——无色透明液。

① 20% SDS：常温保存称取20g SDS，加蒸馏水定容至100ml.④100× PMSF (100 mM): 4℃保存称取261.3 mg PMSF，加15 ml 异丙醇溶解。

(2)复合母液：2× extraction buffer : 40ml1M Tris (pH=8.0) 2 ml0.5 M EDTA (pH=8.0) 160 μl20% SDS 4 mlWater 33.84 ml2.取样：取细胞浓度为2×107的藻液1ml于1.5ml EP管中，厌氧箱中离心1-2min，将沉淀物于液氮中速冻后置于-80①保存；3.提取总蛋白：3.1 根据样品数量计算所需的提取试剂体积：1个样品——1ml 1× extraction buffer3.2 配制1× extraction buffer:试剂：① 2× extraction buffer① 100× PMSF3.3 提取：将-80①保存的样品取出，置于冰上，加入步骤2.2配制的1× extraction buffer 1ml, 涡旋至EP管底部无沉淀黏着后，4①，12,000 rpm离心10 min，用1ml移液枪小心吸取上清于另一干净的1.5 ml EP管中，置于冰上。

Western Blot Protocol实验操作步骤一、提取抗原蛋白将提取RNA途中留存的样品，加入150μl100%酒精充分混匀，静置 5min(RT),2000×g,4℃离心5min,吸取上清至新管中,加入750μl异丙醇,混匀,静置10min(RT),120 00×g,4℃离心 10min,弃上清,加入1ml0.3mol/L盐酸胍/95%酒精重悬沉淀,用加样器打散沉淀,混旋20~30秒,静置20min(RT),7500×g,4℃离心5min,弃上清,重新加入1ml0.3mol/L盐酸胍/95%酒精两次,重悬沉淀,离心后弃上清,加入 100%无水乙醇1 ml,混旋1min,静置20min(RT),7500×g,4℃离心5min,弃上清,真空干燥5min,50μl1% SDS溶解沉淀，用50℃热水助溶，直至全部溶解。

10000×g,离心10min,去除沉渣。

二、蛋白定量1. 取PBS、各样品10ul，加DW990ul2.取DW匀浆缓冲液、样品稀释液、系列牛血清白蛋白标准浓度0.5ml。

3.向各管加入2.5mlD试剂（A50ml＋B0.5ml＋C0.5mlA－2%Na2CO3、 0.1NNaOH，B－0.5%CuSO4，C－1%酒石酸钠）混匀，静置10分钟。

4.迅速加入酚试剂0.25ml，混匀37℃水浴30分钟。

5.721分光光度计650nm，比色，S0标准管调零。

6.最后稀释为 4ug/ul，加载样缓冲液后，终浓度为2ug/ul，上样量为30～80ug/泳道。

三、电泳1.makegel．11%分离胶 12ml 两块胶4%积层胶6ml两块胶DW4.36 ml DW堵漏3.66ml3M Tris3.0 ml 0.5M Tris1.5 ml30%Arc4.4 ml 30%Arc0.5 ml0.78 ml10% SDS0.24 ml 10%SDS60 ul10%APS0.12 ml 10%APS20ul30 ulTEMED10ul TEMED5ul6ul2.上样前样品处理：样品100℃、3分钟、冷却，900×g、离心30S。

Western Blot protocol一、试剂准备1.蛋白裂解液配方：2. 1.5 mol/L Tris.HCL(PH 8.8)O 800 mlTris base (MW 121.1) 181.7g dd H2溶解之后用浓盐酸调PH至8.8（一般加几滴即可，可以在调之前先测溶解液的PH，然后再估计浓盐酸的使用量），然后定容至1L。

高压灭菌后保存。

3. 1 mol/L Tris.HCL(PH 6.8)Tris base (MW 121.1) 30.9 g dd HO 200 ml2溶解之后用浓盐酸调PH至6.8（，可以在调之前先测溶解液的PH，然后再估计浓盐酸的使用量。

一般）然后定容至250 ml，经高压灭菌后使用。

4.10% AP （过硫酸铵）:O 溶解后分装，-20℃保存。

0.1 g过硫酸铵 + 1.0 ml Dd H2O加100 g SDS加热至68℃助溶，然后用浓盐酸调节PH 5.10% SDS：用900 ml的H2至7.2，最后定容至1L。

6.分离胶( 12% )[常用]：7.浓缩胶( 5% )：8. 5 × Running Buffer（储存液）:9. 1 × Running Buffer （工作液）：200 ml的5 × Running Buffer + 800 ml的ddO。

H210.转膜缓冲液：3.03 g Tris base + 14.4g甘氨酸溶解在少量的蒸馏水中，完全溶解后加100ml的甲醇，再用蒸馏水定容至1L。

11.10 × TBS ( 储存液) ：24.2 g Tris base + 80 g NaCl 溶解，用Hcl调PH至7.6，最后定容至1L。

O。

12.1 × TBS （工作液）：100 ml的10 × TBS + 900 ml的dd H213.TBST：含0.1% 吐温—20的1 × TBS。

Western Blot protocolSDS-PAGE：SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis【原理】Western Blot又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。

是检测混合样品中单一特定蛋白的常用技术。

Western Blot间接法基本原理：首先利用SDS-PAGE对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体（例如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

转移后的PVDF膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。

印迹首先用蛋白溶液（如5%的BSA 或脱脂奶粉溶液）处理以封闭PVDF膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。

处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。

处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。

目前有结合各种标记物的抗特定IgG 的抗体可以直接购买作为二抗，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。

该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。

在Western Blot实验中，还有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色，这种方法叫直接法。

与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。

所以一般情况下都釆用间接法进行检测。

【实验耗材】•PVDF膜[MILLIPORE (IPVH00010)]•NC膜•滤纸[BIO-RAD (1703967)]【实验仪器】•PowerPac Basic电泳仪[BIO-RAD (041BR89156)]•Trans-Blot Turbo System 半干转转膜仪[BIO-RAD (690BR006827)]自制胶通常使用Bio-rad半干转转膜仪•iBlot Dry Blotting System 干转转膜仪[Invitrogen (25-0912)]需用Invitrogen 预制转印包•Chemi Doc XRS+显影仪[BIO-RAD (721BR04128)]【试剂】••5×量取100mL of 5×电泳液至500mL量筒中，加超纯水至500mL刻度线，配好后的电泳液在1个月内使用。

Western bloting 技术（一）原理Western bloting技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法，由蛋白质的SDS-PAGE、电转及杂交几部分组成。

杂交技术主要有膜封闭，靶蛋白与第一抗体的反应，结合靶蛋白的一抗和二抗的反应，显色等组成。

（二）操作步骤1.SDS-PAGE2.电转A 剪NC膜（或PVDF膜）大小、滤纸与凝胶板一致，浸泡在转移缓冲液中5min。

B 依次将压缩滤纸、凝胶、滤纸、压缩滤纸放在一起，膜一侧在下，凝胶一面在上。

C 接通电源电压15V，转移时间约半小时。

D 转移结束后，取出装置，依次取掉各层，在膜上剪角做标记。

3.杂交检测：A 膜的封闭：将NC膜放入小平皿中，加入封闭液（TBS-5%脱脂奶粉），37℃轻轻震荡2h。

B TBS洗三遍，每次5 min。

C 加入稀释的一抗（稀释液为TBS-1%脱脂奶粉），37℃轻轻震荡2h。

D 洗膜：弃去反应液，用TBS-0. 05%Tween-20洗三次，每次10min。

E 加入稀释的酶标二抗（稀释液为TBS-1%脱脂奶粉），37℃轻轻震荡2hF 洗膜：弃去反应液，用TBS-0. 05%Tween-20洗三至四次，每次10min。

G 将膜放入显色液中（注：二抗一般有两种常用标记酶，HRP和AP，其相对应的显色底物试剂盒为DAB和BCIP/NBT，HRP也可采用TMB底物，但显色条带易消退），室温轻轻摇动，10-30min。

H 待条带出现后，立刻用水洗膜，然后转入PBS中，观察记录。

（三）注意事项1. 确保灌胶均匀，一次完成2. 设计加样顺序，作好实验记录，按预定顺序加样，上样体积不能过大，容易造成样品不完全堆积导致带型不齐或串孔。

3．注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液4．电泳Buffer重复利用的时候要注意不能混浊，事先前预电泳一下，看看气泡的均匀度，Buffer一定要淹过梳子孔；5．跑完电泳后,取出胶,可以一块做考马思亮蓝R250染色约30分钟, 脱色液脱色, 看看蛋白条带跑的如何,上样量如何6．转膜前要用玻璃棒赶气泡7．膜上要做好标记，识别正反面和上下,切个小角是常用的方法8．一般一抗比较珍贵，最好重复利用，一般确保能在短期内（3天）重复用。

WesternBlot原理、protocol一、组织、细胞总蛋白抽提：参考相关裂解液；二、蛋白浓度测定：BCA法，这个结果要参考说明书！准备：BCA试剂，BSA，PBS/生理盐水，96孔板，100ul、20ul、10ul移液*及*头，1.5ml及4ml EP管，冰河1、配制BSA蛋白标准：配0.5mg/ml BSA，将25mg/ml的母液用RIPA 稀释成0.5mg/ml（RIPA可以换成PBS，下面的也是）；2、将BCA试剂A与B按50:1（2450 A+49ul B）充分混匀，配置成适量BCA工作液(4℃)；3、稀释BSA蛋白标准品和待测蛋白样品：用PBS稀释至20ul，再向每孔加入200ul BCA（在20-1000μg/ml浓度范围内有较好的线性关系）注：按RIPA-BSA-样本-BCA的顺序加入，操作要迅速！4、锡纸遮盖，37℃恒温箱（或酶标仪）放置30min；5、置于酶标仪上测定A562（或A570），用excel建立标准曲线然后计算出蛋白浓度；注意：数据分析可以在Excel里做也可以在GraphPad Prism软件里做，R平方值越接近1数据越好三、Western blot步骤：（一）、玻板的清洗：自来水→75%酒精擦拭→ddH2O→竖放晾干/吹干（做胶的一面朝内）【勿用手指触摸玻板内侧面】装板：低的一面向内，确认玻板底部平齐，插入斜楔板压实卡紧，加ddH2O不漏，滤纸吸干水；（二）、配胶（ 1.0mm）：分离胶 5% 浓缩胶， 3 ml/块胶注意：①、用*吸取胶，沿玻璃板一侧注入，先快后慢，*头不要打到底以防产生气泡，胶面升到绿色板上缘，用75%酒精封闭液面；②、室温放置约30min使胶充分凝固，待水和胶面之间有肉眼可见的折线，小心倒掉上层水，并用滤纸小心吸干水，勿碰触到胶面；③、TEMED作用为促凝胶，如其他试剂放置时间较长或气温较低不易凝胶时，可适量多加1~2倍 TEMED，或者多加点AP，胶就会很快凝固的；④、颠倒混匀后灌胶（约2ml），插入梳子，室温放置约30 min 后，将玻板取出装入电泳装置，竖直向上将梳子拔出，放入电泳槽润湿板子，再拿出将玻璃板卡准；补充下浓缩胶的作用：链接：/content/12/0319/10/2867540_1955684 87.shtml（三）、点样及电泳：1、用10 ul *吸取电泳液，倾斜45°反复吹打上样孔，去掉胶的残渣；2、按顺序加样本，侧边孔加5ul marker，多余孔加入2ul loading buffer，迅速上样避免弥散；上样的量可以根据所测蛋白浓度来调整，有的建议20-40ug，有的50-100ug，其实个人觉得40-80ug比较适合的，主要看你样品浓度吧！3、恒压80V 约20min；待样品进入二胶的分界线时（时间也不一定20min，跑到交界处就可以改变电压），120V 约90min（设I=200，T=2:00）(100mA的条件也跑过-六一产的）；4、溴酚蓝跑至玻板底部，且Marker条带分的足够开时，停止电泳；（四）、转膜：准备（提前30min）：1×转膜液、培养皿、甲醇、PVDF膜、剪刀镊子、尺子、切胶板、托盘、转膜夹、冰袋及冰。

Western Blot Protocol(一)取材当天提蛋白，来自cell culture中的传代cell line。

1.取种有细胞的六孔板，真空吸去培养液，PBS洗3遍。

2.加入裂解液，裂解液配方：1份PI（蛋白质抑制剂，10×原液加PBS稀释至1×），1份TritonX-100（10×原液加PBS稀释至1×），8份PBS。

3.用刮刀把细胞从板底刮下来，将带有细胞的裂解液转移至1.5ml appendoff管中，置于冰上40min。

(二)制胶1.配10%ammonium persulfate(APS)【APS粉末+DW】（注：配好后4℃保存，1-2month）。

准备好30%Acrylamide（Bis Solution）【30%丙烯酰胺】、DW、10%SDS、1.5M Tris（PH8.8）、1.0M Tris(PH6.8)、10%SDS、TEMed（4℃）。

2.拿架子、干净玻片,放海绵架好架子，玻片厚内薄外。

3.配分离胶：按比例抽取DW、30%Acrylamide、1.5M Tris（PH8.8）、10%SDS、10%APS、TEMed【每块胶10ml】。

将分离胶打入板内（到绿线位置）。

随即加入DW压平。

等20min待分离胶凝结。

8%分离胶10ml20ml30ml40ml50mlDW 4.69.213.918.523.2 30%Acrylamide 2.7 5.38.010.713.31.5M Tris（PH8.8）2.5 5.07.510.012.510%SDS0.10.20.30.40.510%APS0.10.20.30.40.5TEMed0.010.020.030.040.05 10%分离胶10ml20ml30ml40ml50mlDW 4.07.911.915.919.8 30%Acrylamide 3.3 6.710.013.316.71.5M Tris（PH8.8）2.5 5.07.510.012.510%SDS0.10.20.30.40.510%APS0.10.20.30.40.5TEMed0.010.020.030.040.05 12%分离胶10ml20ml30ml40ml50mlDW 3.3 6.69.913.216.5 30%Acrylamide 4.08.012.016.020.01.5M Tris（PH8.8）2.5 5.07.510.012.510%SDS0.10.20.30.40.510%APS0.10.20.30.40.5TEMed0.010.020.030.040.054.倒去DW，水洗3遍，吸干水。

Western blotting protocolBy Wei-Zhang Wang-070610 A.溶液和试剂注意：溶液的配制最好用Milli-Q或同等纯度的水!所有下面所用容器使用前都必须洗干净，并用双蒸水润洗，最后晾干。

A1. 抑制剂：蛋白酶抑制（35mg/ml PMSF）：用无水乙醇稀释为35mg/ml，室温下避光保存，可使用3－4个月。

（MW：172.4g）丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂（5M 氟化钠（NaF））：取2.1克氟化钠置于10ml Milli-Q 水中，然后vortex剧烈震荡使其充分溶解，最后分装成10μl/管，置于-20℃保存（解冻后必须1小时内使用）。

酪氨酸磷酸酶抑制剂(1M 钒酸钠（Sodium Orthovanadate）)：称一定量的钒酸钠置于水中，用盐酸调pH至10.0，加热沸腾至完全溶解且溶液为无色，待溶液冷却至室温后再调pH至10.0，加热至溶液变无色，冷却后再调pH至10.0，如此反复操作至室温下pH 稳定在10.0即可，最后定容至浓度为1M。

此配制方法是参考网上的WB protocol，实际是否如此配制尚未实践过！A2. 1×PBS（pH7.4）Stock 终浓度Tris-HCL(pH6.8 at 25℃) 1M Tris(pH6.8) 1.25ml 62.5mMSDS 0.4g 2％(w/v)Glycerol(甘油) 2ml 10%DTT(二硫苏糖醇) 1M 1ml 50mMBromophenol blue(溴酚蓝) 0.01%(w/v)A4. 转移缓冲液：74.5g甘氨酸,15gTris碱加水定容至1000ml，成5×stock，4℃保存。

使用前稀释成1×：取200ml 5×stock转膜缓冲液，然后加入600mlddH2O，最后加入200ml无水甲醇至1L，4℃预冷2h以上。

A5. Tris-甘氨酸电泳buffer(pH8.3)：Tris base 15.1g 和94g甘氨酸，溶解在900ml水中，然后加入5g SDS，再加水至1000ml，成5X。

WesternBlotprotocol实验步骤Western Blot protocol主要试剂及缓冲液的配制1). 30%丙烯酰胺：将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为100ml的⽔中。

搅拌器帮助溶解，滤纸过滤除杂质，避光保存于4度冰箱。

2). 10% SDS：称量10g⼗⼆烷基硫酸钠，加⼊80ml超纯⽔中，加热搅拌溶解，加⽔⾄100ml室温保存备⽤。

3).10x蛋⽩电泳缓冲液：30.2gTris、188g⽢氨酸、10gSDS、加⽔⾄1000ml4).20×转膜缓冲液：Tris 29g，Glycine 144g，SDS 2g 加⽔定容⾄1000ml配制1×转膜缓冲液200ml (甲醇 40ml，20×transfer buffer 10ml，H2O 150ml)5).1.5M Tris 8.8：（注意温度对tris PH值的影响）18.15 g Tris 溶于80ml超纯⽔中，加浓盐酸调PH值8.8，定容⾄100ml。

⾼温灭菌后室温保存。

6).1M Tris 6.8：12.11g Tris 溶于80ml 超纯⽔，加浓盐酸调PH值6.8，定容⾄100ml。

⾼温灭菌后室温保存。

7). 10×PBS：NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4.12H2O 35.85g，KH2PO4 2.4g，⽤盐酸调PH⾄7.4，加⽔定容⾄1000ml8). 1xPBST(0.05% Tween 20)：10×PBS 100ml，H2O 900ml， Tween 20 50ul9).10%（W/V）过硫酸铵：临时配，0.1g过硫酸铵溶于1ml 超纯⽔，4度冰箱保存3天10). 丽春红染液储存液(0.1%（W/V）丽春红，5%（V/V）⼄酸)：，丽春红0.04g，冰醋酸2ml，超纯⽔ 38ml11). 封闭液：5%（W/V）脱脂奶粉溶于1X PBST 中，使⽤时现配。

Western blot实验方案【实验目的】了解western blot原理，掌握有关的操作方法。

【实验原理】Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

【实验仪器、材料和试剂】（1）仪器、用具：高速冷冻离心机、振荡器、-80℃冰箱、-20℃冰箱、酶标仪、水浴锅、涡旋器、SDS电泳仪、PH自动控制加液机、摇床、半干转膜仪、湿转膜仪、凝胶成像系统、托盘、量筒、1L烧杯、小烧杯、冰盒、孵育盒、纤维垫、玻璃棒、有齿镊子、无齿镊子、表面皿、搪瓷盘、移液器、细胞刮刀、计时器（2）耗材：15mL离心管、50mL离心管、1.5mL EP管、96孔板、普通滤纸、whatman 3mm 滤纸、PVDF膜、一次性枪头、棉球、保鲜膜（3）材料：人乳腺癌MCF-7细胞株、人乳腺癌MDA-MB-231细胞株（4）试剂：75%酒精、0.25%胰蛋白酶、PBS、RIPA裂解液、PMSF、bradford蛋白定量检测试剂盒、1.0mol/L Tris•HCl (pH6.8)、1.5mol/L Tris•HCl(pH8.8)、10%AP、TEMED原液、30%丙烯酰胺(29：1)、10%SDS阴离子去污剂、Sample Loading Buffer (5X)、BSA牛血清白蛋白、Running Buffer(5X)、transfer buffer、无水甲醇溶液、脱脂奶粉、10XTBS缓冲液、Tween-20、β-actin、一抗、带HRP二抗、DAB显色试剂盒、Stripping Buffer膜再生利用液（5）需要配制：分离胶、浓缩胶、封闭液（抗体稀释液）、洗脱液需要稀释：加样缓冲液、电泳缓冲液、转膜液其余按照说明书操作。

westernblottingprotocolWestern-blotting1．从植物材料提取蛋白质取一些植物材料用液氮速冻后放入研钵研磨成粉末，加入5%SDS(每100mg 植物材料加50 μl 10%SDS和50ul蒸馏水)，沸水浴3min，13000rpm离心3min，吸取上清后加入等体积2×SDS loading buffer（注意加入DTT），沸水浴3min。

换用extraction buffer (150 mM Tris-HCl, pH7.5, 6 M urea, 2% sodium dodecyl sulfate, and 5% _B-mercaptoethanol). 样品经液氮碾磨后每0.1g粉末加入100ul提取液，混匀后，冰上放置10分钟使细胞裂解。

沸水浴5min，然后18,000 g at 4°C 离心10 min，去除沉淀，将上清转移到新的Ep管中，用试剂盒Bradford法测定蛋白浓度后，加入等体积2×SDS loading buf fer（注意加入DTT），沸水浴3min，然后上样。

剩余的样品-20℃保存。

2．配制蛋白胶，根据蛋白的分子量选择分离胶的百分比。

用自来水清洗1mm制胶板、玻璃片和烧杯等，并用蒸馏水冲洗玻璃片至玻璃片上无明显颗粒为止，用电吹风吹干。

安装好制胶架，配制8%的分离胶。

在大烧杯中依次加入4.6mldd H2O、2.7 ml 30%丙烯酰胺、2.5ml 1.5M Tris-cl（PH8.8）、100ul 10%SDS，100ul 10%APS，用枪轻轻吹打混匀后吸出1ml放入小烧杯中加入6ulTEMED，混匀后倒入玻璃板中封底，用电吹风吹5-10min，待其凝固后在大烧杯中加入6ulTEMED，混匀后加入玻璃板中并用水压平。

约1h后倾去水，配制浓缩胶，在小烧杯中依次加入：2.8mldd H2O、0.66 ml 30%丙烯酰胺、0.5ml 1M Tris-cl （PH6.8）、40ul 10%SDS、40ul 10%APS、4ulTEMED，混匀后加入玻璃板中，插上电泳梳。

Western blot protocol1、植物总蛋白的提取：（整个过程尽量在冰上操作）1）液氮充分研磨，转入2ml印管中，加150-200ul裂解液（含PMSF），根据粉末量决定裂解液的量，在能充分裂解的情况下，越少越好。

2）充分混匀，冰上裂解10分钟。

3）4℃，15000rpm，离心15分钟。

4）吸上清，再4℃，15000rpm，离心15分钟。

5）吸上清于新印管中，可-20℃保存备用。

2、SDS-PAGE电泳：根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶。

蛋白分子量(kDa) 凝胶浓度(%)4-40 2010-40 1512-60 1220-80 1030-90 850-150 61）制SDS-PAGE胶准备工作：用洗洁精将玻璃板洗净，并用单蒸水冲洗2-3遍，用吹风机吹干，安装电泳槽（准备了一块抹布专门洗玻璃板，放在板子的旁边，因为刷子会使玻璃有划痕）；制作15%分离胶，5%浓缩胶。

（新的AP效果很好，制胶时先加TEMED,再加AP，灌胶时速度要快，不然胶会很快凝固。

）分离胶（一块）配方15%（ml）12%（ml）10%（ml）8%（ml）6%（ml）ddH2O 1.1 1.6 1.9 2.3 2.6 30% Acr-Bis (29:1) 2.5 2 1.7 1.3 11.5M Tris-HCl（pH8.8） 1.3 1.3 1.3 1.3 1.310%SDS 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 10%过硫酸铵0.005 0.005 0.005 0.005 0.005TEMED 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05总体积 5 5 5 5 5按表中所列顺序从上到下加试剂，加完TEMED后，轻轻摇匀液体，一块胶加7ml 溶液。

加完后，用1mLddH2O封住分离胶液面，在室温（37℃）凝结10min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倾倒水层，用滤纸条将残余的水吸干。

浓缩胶（一块）配方5% （mL）ddH2O 1.730% Acr-Bis (29:1) 0.4251M Tris-HCl（pH6.8）0.32510%SDS 0.02510%过硫酸铵0.005TEMED 0.025总体积 2.5胶配好后混匀，灌胶2ml，插梳子时根据点样量和浓缩胶长短调整梳子插入的深度，于室温(37℃)凝胶10 min。