6-2第六章 纤维素酶

检测分析纤维素酶酶活的测定方法河南省科学院生物研究所 刘德海　杨玉华　安明理河南省饲料产品质量监督检验站 陈小鸽 饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。

纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为C1酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(Na-CMC)起水解作用的酶,称为C x酶。

据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于C X酶的CMC法,另一种是适用于C1酶的滤纸法。

下面就此两种方法作一介绍。

1　C MC(羧甲基纤维素)法1.1　材料1.1.1　饲用纤维素酶　由河南省科学院生物研究所提供。

1.1.2　试剂　磷酸氢二钠、柠檬酸、羧甲基纤维素、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。

1.1.3　仪器　721型分光光度计、恒温水浴锅、PHS-2酸度计、秒表。

1.1.4　试剂配制1.1.4.1　pH5.0柠檬酸缓冲液　制取0.2mol/L 磷酸氢二钠液(称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中,定容至100mL)和0.1mol/L的柠檬酸液(称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中,定容至100 mL),取磷酸氢二钠液24.3mL、柠檬酸液25.7mL 混匀,用精密酸度计测至pH值为5.0。

1.1.4.2　羧甲基纤维素溶液　准确称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200mL水中,沸水浴中加热至溶化,过滤,取滤液100mL,加柠檬酸缓冲液20 mL、蒸馏水40mL,混匀,贮存于冰箱中备用。

1.1.4.3　3,5-二硝基水杨酸显色液　准确称取6.3g3,5-二硝基水杨酸置于2mol/L氢氧化钠262mL溶液中,然后加酒石酸钾钠的热溶液(182.0g酒石酸钾钠溶于500mL水中),再加5.0 g苯酚和5.0g亚硫酸钠,搅拌至溶解,冷却后定容至1000mL,贮于棕色瓶中置冰箱中备用。

1.1.4.4　0.1%标准葡萄糖溶液　准确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖250.000mg,溶于蒸馏水中,定容至250mL。

纤维素酶的作用机理及进展的研究摘要：纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，本文论述了纤维素酶的性质，重点介绍了纤维素酶的作用机理、应用及其研究进展，并对其研究前景做了展望。

关键词：纤维素酶；纤维素；作用机理；0引言纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。

纤维素占植物干重的35%-50%[1],是世界上分布最广、含量最丰富的碳水化合物。

对人类而言，它又是自然界中最大的可再生物质。

纤维素的利用和转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义[2]。

1 纤维素酶的性质纤维素酶是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。

纤维素酶是四级结构，,产生纤维素酶的菌种容易退化，导致产酶能力降低。

由于纤维素酶难以提纯，实际应用时一般还含有半纤维素酶和其他相关的酶，如淀粉酶（amylase）、蛋白酶（Protease）等。

纤维素酶的断键机制与溶菌酶一样，遵循双置换机制。

纤维素与酶相互作用中，是酶被底物分子所吸附，然后进行酶解催化，酶的活性较低，仅为淀粉酶的1/100[3] 纤维素酶对底物分子的分解，必须先发生吸附作用。

纤维素酶的吸附不仅与自身性质有关，也与底物密切相关，但纤维素酶的吸附机制总体并未弄清，仍需进一步研究[4]。

2 纤维素酶的作用原理（1）、纤维素酶在提高纤维素、半纤维素分解的同时，可促进植物细胞壁的溶解使更多的植物细胞内溶物溶解出来并能将不易消化的大分子多糖、蛋白质和脂类降解成小分子物质有利于动物胃肠道的消化吸收。

（2）、纤维素酶制剂可激活内源酶的分泌，补充内源酶的不足，并对内源酶进行调整，保证动物正常的消化吸收功能，起到防病，促生长的作用。

有关酶的参考书1．《酶学》作者：郑穗平，郭勇，潘力编著出版社：科学出版社出版时间：2009-9-1 定价：49元目录：前言第一章绪论第一节酶的基本概念第二节酶的分类与命名一、蛋白类酶的分类与命名二、核酸类酶的分类第三节酶的活力测定第四节酶的催化特性一、酶催化作用的专一性二、酶催化作用的效率三、酶催化作用的条件第五节酶的分离纯化一、细胞破碎二、提取三、离心分离四、过滤与膜分离五、沉淀分离六、层析分离七、电泳分离八、萃取分离第二章酶的结构与功能第一节酶的化学组成一、蛋白类酶的基本组成单位一一氨基酸二、核酸类酶的基本组成单位——核苷酸三、酶的辅助因子第二节酶的化学结构一、酶蛋白的化学结构二、酶RNA的化学结构第三节酶的空间结构一、酶蛋白的空间结构二、酶RNA的空间结构第四节酶的活性中心一、酶活性中心上的残基二、接触残基附近的肽链一级结构第五节酶的结构与功能的关系一、酶的一级结构与催化功能的关系二、酶的二、三级结构与催化功能的关系三、酶的四级结构与催化功能的关系第六节酶分子修饰一、酶分子的主链修饰二、酶分子的侧链基团修饰三、酶分子的组成单位置换修饰四、金属离子置换修饰五、酶分子的物理修饰第三章酶的催化作用机制第一节趋近与定向效应第二节构象变化效应一、底物诱导酶分子的构象发生改变二、酶分子诱导底物分子的构象发生改变第三节微环境效应一、胰凝乳蛋白酶催化的微环境效应及其催化机制二、溶菌酶催化的微环境效应及其催化机制第四节酸碱催化机制一、酶蛋白中的酸碱催化基团二、共轭酸与共轭碱的催化通式三、核糖核酸酶的酸碱催化过程第五节共价催化机制一、亲核催化二、亲电催化第六节自我剪接机制一、Ⅰ型内含子剪接酶的剪接机制二、Ⅱ型内含子剪接酶的催化机制第七节自我剪切机制一、锤头形核酸类酶的自我剪切机制二、发夹形核酸类酶的自我剪切机制第八节酶作用机制的研究方法一、X射线衍射法二、中间产物检测法三、酶分子修饰法四、酶反应动力学方法第四章酶反应动力学第一节单底物反应动力学一、引言第五章酶的生物合成及调节机制第六章酶分子的定向进化主要参考文献2.《现代酶学》（第二版）作者：袁勤生主编出版社：华东理工大学出版社出版时间：2007-5-1 定价：58目录：1 酶与应用酶学1.1酶学研究概况1.2从分子水平研究酶的结构与功能1.2.1酶的分子结构1.2.2结构与功能的研究1.3用分子生物学方法改进酶的催化特性及设计新酶1.3.1酶结构与功能关系研究是关键1.3.2基因工程酶1.3.3酶的蛋白质工程构建1.4构建酶---核酶、抗体酶、模拟酶、分子印迹酶1.4.1核酶1.4.2抗体酶1.4.3模拟酶1.4.4分子印迹酶1.5酶工程中的若干应用热点2 酶的分类组成及结构特征3 酶作用动力学和酶的抑制作用4 酶活性的调节和酶的转换5 酶的作用机制6 同工酶7 酶化学修饰的定量处理及不可逆抑制动力学8 氧自由基与酶9 酶与细胞的信号转导10 非水介质中的酶催化反应11 酶的化学修饰12 核酶13 模拟酶14 抗体酶15 分子印迹酶16 组合生物催化17 酶的定向进化18 蛋白酶抑制剂设计与药物19 酶的固化技术20 酶的分离工程21 气体酶学22 酶的生产参考文献3.《酶学及其研究技术》作者：陈清西编著出版社：厦门大学出版社出版时间：2010-8-1 定价：38 目录：第一章概论第一节酶的概念和酶学研究的重要性一、酶是什么二、酶学研究的重要性三、酶学研究历史四、现代酶学概况第二节酶的组成及结构特点一、酶的化学本质二、酶蛋白亚基数的组成特点分类三、酶的组成分类四、酶的辅助因子第三节酶的分类与命名一、习惯命名法二、国际系统命名法三、国际系统分类法第四节酶作为催化剂的特点一、酶与一般催化剂比较的共性二、酶作为催化剂的显著特性第五节酶的专一性一、酶的专一性分类二、几种蛋白酶的专一性第二章酶的分离纯化第一节酶分离纯化的一般原则一、确立酶活力测定方法二、原材料的选择与处理三、酶的纯化方法四、酶的纯度鉴定第二节酶的提取一、生物材料的破碎二、酶的抽提第三节酶的纯化一、沉淀法二、离子交换柱层析技术三、凝胶过滤柱层析法四、亲和层析五、其他分离纯化方法六、酶纯化方法的选择与实验设计第三节酶活力的测定一、酶活力测定的一般原则二、初速度三、酶活力单位四、酶活力测定的主要方法第四节酶制剂的浓缩、干燥及保存一、浓缩的主要方法二、保存第五节酶纯度的鉴定技术一、酶纯度的评价二、电泳法三、其他方法第六节酶的分离纯化应用实例一、青蟹碱性磷酸酶二、南美白对虾N一乙酰J3一D一氨基葡萄糖苷酶第三章酶的理化性质研究第一节酶亚基数及分子量的测定一、酶蛋白亚基数及亚基分子量的测定原理与方法二、酶蛋白总分子量的测定原理与方法第二节酶的等电点测定一、等电点测定的原理二、等电聚焦电泳技术第三节酶的氨基酸组成一、氨基酸组成分析二、特殊氨基酸含量的测定三、酰胺含量的测定第四节糖基酶中糖的组成与连接方式的研究一、糖蛋白的分析二、糖蛋白中糖成分的分析三、糖基连接方式的研究第五节几种海洋动物酶的理化性质的研究实例一、锯缘青蟹碱性磷酸酶的理化性质研究二、南美白对虾N一乙酰一J3一D一氨基葡萄糖苷酶的理化性质研究第四章酶催化的动力学性质研究第一节酶促反应的基本动力学一、Michaelis—Menten方程的建立二、Briggs—Haldane修正的Michaelis—Menten方程三、关于Michaelis一Menten方程的讨论四、米氏常数Km的意义五、米氏常数Km和最大反应速度V m的图解法测定六、米氏方程的积分形式第二节King—Altman方法推导速度方程一、用稳态法推导动力学方程的基本步骤二、King—Altman图像法推导动力学方程三、wang和Hanes结构法则第三节酶浓度对反应速度的影响第四节产物浓度对酶促反应的影响一、产物对酶初速度的影响的动力学二、可逆反应的Haldane关系式第五节高底物浓度对酶活力的影响一、动力学模型建立二、动力学方程的推导第五章酶的抑制剂第一节酶抑制剂的类型一、酶抑制剂两大类型二、区别可逆抑制剂与不可逆抑制剂的实验设计与操作第二节不可逆的抑制剂一、非专一性的不可逆抑制剂二、专一性不可逆抑制剂第三节可逆抑制剂作用的动力学一、竞争性抑制作用的动力学二、非竞争性抑制作用的动力学三、反竞争性抑制作用的动力学四、混合型抑制作用的动力学第六章pH对酶活力的影响第一节pH对酶催化的效应一、酶促反应的最适pH二、酶的pH稳定性第二节pH对酶可逆作用的动力学一、酶活性中心可解离基团的解离常数二、pH影响酶活性中心解离基团的动力学模型的建立三、酶活性中心解离基团的解离常数的测定第三节有机溶剂对酶活性中心解离基团的微扰作用第四节pH对酶效应研究的实例一、pH对青蟹碱性磷酸酶（ALPase）催化pNPP水解反应的效应二、酶活性中心解离基团解离常数的测定第七章温度对酶活力的影响第一节温度对酶催化反应的影响一、酶促反应的最适温度二、酶的热稳定性第二节温度对酶催化反应速度常数的影响一、温度与速度常数二、酶促反应的热力学参数的测定第三节温度对酶催化反应速度常数的影响一、酶活性中心解离基团的标准热焓二、酶促反应的热力学常数测定实例三、酶活性中心解离基团的解离热焓测定实例第四节酶的热失活动力学一、经典的酶热失活研究方法二、酶失活过程中的底物反应动力学方法三、酶的热失活表观速度常数的测定四、酶热失活的微观速度常数的测定第八章酶的多底物动力学第一节术语一、多底物催化反应历程的Cleland表示法二、多底物反应的酶中间物三、多底物反应历程的分类四、多底物反应的动力学参数表示法五、多底物反应机理的图形表示法第二节OrderedBiBi机理一、反应模型的Clleland表示法二、动力学方程的推导（King—Altman推导法）三、反应速度方程用动力学常数表示的基本方法四、作图法求解动力学参数第三节RandomBiBi机理第四节PingPongBiBi机理第五节多底物反应机理的判断第六节产物的抑制作用机理的判断一、有序双双反应（OrderedBiBi）的产物抑制作用的判断二、乒乓双双反应（PingPongBiBi）的产物抑制作用的判断三、Cleland的产物抑制作用的判断规则第九章酶功能基团的化学修饰第一节化学修饰的原理一、影响酶的功能基团反应活性的主要因素二、修饰剂反应性的决定因素第二节采用非特异性试剂对酶功能基团进行修饰一、特殊氨基酸残基的化学修饰二、修饰剂和修饰反应条件的选择第三节亲和标记和差示标记一、亲和标记法的原理二、差示标记法的原理第四节酶活性中心必需基团数的测定一、酶修饰失活动力学二、酶修饰失活速度常数比较法判断必需基团数（Ray—Koshland方法）三、邹氏图解法求必需基团数第十章酶的分子结构基础及催化作用机理第十一章酶抑制剂的设计与应用第十二章酶分子构象的研究技术第十三章多酶体系及调节酶第十四章酶活性调控4．《酶工程原理》作者：由德林主编出版社：科学出版社出版时间：2011-7-1 定价：35目录：丛书序前言前言1 酶与酶工程1.1 酶工程的发展历程1.2 酶作为催化剂的特点1.2.1 酶的高效催化能力1.2.2 酶的专一性1.2.3 酶的作用条件温和1.2.4 酶的活性可调节1.3 酶的命名及分类1.4 酶催化功能的结构基础1.4.1 酶的高级结构是其发挥活性的基础1.4.2 酶的活性中心1.4.3 酶的活性部位模型假说1.5 酶催化反应的本质1.5.1 酶促反应的过渡态1.5.2 邻近效应和定向效应1.5.3 共价催化1.5.4 酸碱催化1.5.5 金属离子催化1.5.6 微环境影响1.6 酶动力学1.6.1 影响酶反应速率的因素1.6.2 单底物反应1.6.3 双底物反应动力学1.6.4 失活（稳定性）动力学1.7 酶的稳定性1.7.1 酶的失活模型1.7.2 酶蛋白不稳定的原因1.7.3 稳定酶的方法1.8 非水酶学1.8.1 非水介质中酶催化反应的特征1.8.2 非水介质中酶的催化基础1.8.3 底物特异性（思考题）（参考文献）2 酶的生产、分离纯化和制剂2.1 原料的选择2.2 产酶微生物发酵技术2.2.1 培养基2.2.2 发酵工艺控制2.3 工程菌的高密度发酵2.3.1 基因工程菌的构建2.3.2 基因工程菌的培养方式2.3.3 高密度发酵工艺2.4 提高酶产量的方法2.4.1 酶合成的调控机理2.4.2 通过条件控制提高酶产量2.4.3 通过基因突变提高酶产量2.4.4 通过体内基因重组提高酶产量2.4.5 通过体外基因重组提高酶产量2.4.6 定向进化提高酶产量2.5 酶分离纯化的原理与方法2.5.1 酶分离纯化的基本原则2.5.2 目标蛋白从生物机体内的释放2.5.3 粗分离2.5.4 根据相对分子质量不同的纯化方法2.5.5 根据分子电荷不同的纯化方法2.5.6 根据分子极性不同的纯化方法2.5.7 根据蛋白质亲和力不同的纯化方法2.6 酶的剂型与保存2.6.1 酶的剂型3 酶的固定化和酶反应器4 酶的分子改造5 酶的模拟6 酶与生物催化7 酶与生物降解8 酶与代谢工程索引5.《酶――在生活与工业中广为使用的超级分子催化剂》作者：（德）伦内贝格著，杨毅，张皖蓉，王健美译出版社：科学出版社出版时间：2009-3-1 定价：35目录：丛书序本册简介原版前言1 酶是具有高度特异性的高效生物催化剂2 溶菌酶：在微小分子水平上最早被了解其结构和功能的酶类3 辅助因子在复合酶类中的作用4 酶类的来源：动物、植物以及微生物5 胞外水解酶将生物高分子聚合物降解为小分子6 用于酿酒、烘焙以及退浆的淀粉酶7 用于增加蔬果汁产量的果胶酶8 生物清洁剂：应用最广泛的水解酶9 软化肉类与皮革的蛋白酶10 固定：酶类的重复使用11 葡萄糖异构酶与果糖糖浆：提高糖的甜度12 固态酶在人类与动物食品生产中的应用13酶膜反应器：辅助因子再生性的应用14固定细胞小测验参考文献与推荐读物相关网络链接6.《酶工程技术》作者：吴士筠，周岿，张凡主编出版社：华中师范大学出版社出版时间：2009-12-1 定价：16目录：第1章绪论1.1 酶工程研究现状1.1.1 国内外酶制剂的生产和应用现状1.1.2 工业酶制剂的来源及特点1.2 酶工程技术应用1.2.1 活性肽的开发研究1.2.2 酶工程在医药方面的应用1.2.3 酶在污染治理中的应用1.2.4 酶在农业中的应用1.2.5 酶在饲料生产方面的应用1.2.6 酶在轻化工领域中的应用1.3 国内外酶工程产业发展趋势第2章乙醇脱氢酶2.1 简介2.1.1 乙醇脱氢酶研究现状2.1.2 乙醇脱氢酶的应用2.1.3 乙醇脱氢酶的分离纯化2.2 乙醇脱氢酶酶学性质研究2.2.1 简介2.2.2 乙醇脱氢酶酶学性质阶段研究2.2.3 乙醇脱氢酶酶学性质研究关键技术2.2.4 乙醇脱氢酶酶学性质研究过程控制2.3 乙醇脱氢酶提取研究2.3.1 简介2.3.2 乙醇脱氢酶提取阶段研究2.3.3 乙醇脱氢酶提取关键技术2.3.4 乙醇脱氢酶提取过程控制2.4 乙醇脱氢酶分离纯化研究2.4.1 简介2.4.2 乙醇脱氢酶分离纯化阶段研究2.4.3 乙醇脱氢酶分离纯化关键技术2.4.4 乙醇脱氢酶分离纯化过程控制2.5 乙醇脱氢酶催化动力学研究2.5.1 简介第3章蛋白酶第4章a－淀粉酶第5章植酸酶第6章纤维素酶参考文献7.《酶工程》作者：陈宁主编出版社：中国轻工业出版社出版时间：2011-6-1 定价：36目录：第一章绪论第一节酶工程的定义第二节酶工程发展历史第三节酶工程的研究概况及发展前景一、新酶的研究与开发二、化学酶工程三、生物酶工程四、酶的优化生产五、酶的高效应用第四节我国酶制剂工业现状及发展对策一、我国酶制剂工业发展现状。

纤维素合酶的结构及细胞壁中纤维素的合成过程（综述）莫文洲(中国农业大学农学与生物技术学院植物108，1001080823)摘要：纤维素地球上最丰富的生物大分子和最重要的可再生资源，，植物纤维素的生物合成需要多个纤维素合成酶与其他相关酶，本文综述了从蛋白结构和基因组成上总结了纤维素合酶的特点以及植物细胞壁中纤维素合成的过程。

关键词：纤维素合酶纤维素的合成纤维素是地球上数量最多的有机大分子物质，是构成细胞壁的基础物质，占初生细胞壁物质的20%~30%。

纤维素分子是由β（1-4）连接的D-葡聚糖组成的高分子聚合物，并通过分子内氢键使其形成一种类螺旋状的结构。

随着社会的快速发展，人类对植物纤维的需求激增，而过度利用自然界的植物纤维资源将对人类生存造成极大的破坏。

植物纤维素生物合成机制的研究对材质改良，木材定向培育以及农业、造纸等化工业都十分重要。

而纤维素主要有纤维素合酶来合成，所以对植物纤维素台酶基因及其蛋白的研究显得更有价值。

要掌握纤维素合成酶基因的调控。

1.纤维素合酶的结构1.1纤维素合酶蛋白结构特点在不同植物的纤维素合成中，不同的纤维素合成酶(CesA)基因的具体作用是不同的，并且在纤维素的生物合成中，需要多个纤维素合成酶基目的共同作用。

纤维素的糖基转移酶有两个催化位点。

所有的CesA和Csl蛋白都具有跨膜蛋白的特征，在N一端与C一端具2个或多个跨膜区域，其中间为亲水胞内区，CesA与Csl蛋白之间最大的同源性出现在中间胞内区。

植物纤维素合成酶的N末端一段氨基酸可形成一个特殊的结构域，类似于锌指状或LIM 转录因子构向，此种该结构域具有保守序列CxxC(半胱氨酸氨一x 半胱氨酸氨)，与蛋白间的相互作用有关。

其次，植物纤维素合成酶包含有2个高变区，其中一个在N端，约150个氨基酸残基，富含酸性氨基酸，另一个在A 区与B区之间，约5O个氨基酸。

A 区和B区是植物纤维素合成酶基因所特有的保守区，A 区含有几个保守的天冬氨酸残基，排列特征为Dx⋯xDxD(D 为天冬氨酸)。

纤维素合酶的结构及细胞壁中纤维素的合成过程（综述）莫文洲(中国农业大学农学与生物技术学院植物108，1001080823)摘要：纤维素地球上最丰富的生物大分子和最重要的可再生资源，，植物纤维素的生物合成需要多个纤维素合成酶与其他相关酶，本文综述了从蛋白结构和基因组成上总结了纤维素合酶的特点以及植物细胞壁中纤维素合成的过程。

关键词：纤维素合酶纤维素的合成纤维素是地球上数量最多的有机大分子物质，是构成细胞壁的基础物质，占初生细胞壁物质的20%~30%。

纤维素分子是由β（1-4）连接的D-葡聚糖组成的高分子聚合物，并通过分子内氢键使其形成一种类螺旋状的结构。

随着社会的快速发展，人类对植物纤维的需求激增，而过度利用自然界的植物纤维资源将对人类生存造成极大的破坏。

植物纤维素生物合成机制的研究对材质改良，木材定向培育以及农业、造纸等化工业都十分重要。

而纤维素主要有纤维素合酶来合成，所以对植物纤维素台酶基因及其蛋白的研究显得更有价值。

要掌握纤维素合成酶基因的调控。

1.纤维素合酶的结构1.1纤维素合酶蛋白结构特点在不同植物的纤维素合成中，不同的纤维素合成酶(CesA)基因的具体作用是不同的，并且在纤维素的生物合成中，需要多个纤维素合成酶基目的共同作用。

纤维素的糖基转移酶有两个催化位点。

所有的CesA和Csl蛋白都具有跨膜蛋白的特征，在N一端与C一端具2个或多个跨膜区域，其中间为亲水胞内区，CesA与Csl蛋白之间最大的同源性出现在中间胞内区。

植物纤维素合成酶的N末端一段氨基酸可形成一个特殊的结构域，类似于锌指状或LIM 转录因子构向，此种该结构域具有保守序列CxxC(半胱氨酸氨一x 半胱氨酸氨)，与蛋白间的相互作用有关。

其次，植物纤维素合成酶包含有2个高变区，其中一个在N端，约150个氨基酸残基，富含酸性氨基酸，另一个在A 区与B区之间，约5O个氨基酸。

A 区和B区是植物纤维素合成酶基因所特有的保守区，A 区含有几个保守的天冬氨酸残基，排列特征为Dx⋯xDxD(D 为天冬氨酸)。

纤维素酶Celluclast第23卷第6期2004年11月无锡轻工大学JournalofWuxiUniversityofLightIndustryV o1.23No.6Nov.2004文章编号:1009—038X(2004)06—0100—03纤维素酶Celluclast1.5L在酵母菌原生质体制备及再生中的应用冯小树,何萍,沈国强,姜文候,钱俊佳(1.江南大学生物工程学院,江苏无锡214036;2.江苏省生物活性制品加工工程技术研究中心,江苏无锡214036)摘要:比较了在不同的酶浓度,处理时间,渗透剂和pH值下纤维素酶Celluclast1.5L 和蜗牛酶在酵母茵原生质体的形成和再生中的应用.在最佳条件下,单独使用纤维素酶的原生质体的形成率可达60左右,原生质体的再生率可达10以上,与蜗牛酶类似.关键词:纤维素酶Celluclast1.5L;酵母菌;原生质体;再生中图分类号:Q55文献标识码:ATheUseofEnzymeCelluclast1.5LinProductionand RegenerationofYeastProtoplastFENGXiao—shu1,HEPing,SHENGuo—qiang,JIANGWen—hou,QIANJun—jia (1.Schoo1ofBiotechno1ogy,SouthernY angtzeUniversity,Wuxi214036.China;2.Jiangsu EngineeringResearch CenterforBioactiveProductsProcessingTechnology,Wuxi214036,China)Abstract:ThispaperindicatedtheuseofenzymeCelluclast1.5L(aliquidcellulasepreparatio n)inproductionandregenerationofprotoplastofyeast.Undertheoptimumconditions,the productionyieldofyeastprotoplastisabout60andtheregenerationyieldofyeastprotoplastis above10.Keywords:Celluclast1.5L;yeast;protoplast;regeneration在酵母菌原生质体的形成与再生中使用的工具酶通常是从玛瑙螺胃液中提取的蜗牛酶.这种酶虽然对酵母菌的细胞壁具有良好的水解作用,但因为它实际上是含有纤维素酶,甘露聚糖酶,葡糖酸酶,几丁质酶,脂酶等3O多种酶的混合物,因此难以通过原生质体形成与再生时的动力学研究来了解酵母菌细胞壁的构建方式和过程.纤维素酶Cel—luclast1.5L是一种专门作用于葡聚糖的商品化收稿日期:2003—09—22;修回日期:2003—12—16.作者简介:冯小树(1945一),男,江苏无锡人,副教授.纤维素分解酶,而维持酵母菌细胞壁强度的主要物质是位于细胞壁内层的葡聚糖.因此用Celluclast1.5L酶取代蜗牛酶来实施酵母菌原生质体的制备与再生,不仅为酵母菌原生质体的制备提供了一种新的方法,而且可以通过酵母菌原生质体形成与再生的动力学研究来了解酵母菌细胞壁的构建方式和构建过程.作者研究了Celluclast1.5L酶在酵母菌原生质体形成和再生中的几个主要条件.第5期冯小树等:纤维素酶Celluclast1.5L在酵母菌原生质体制备及再生中的应用1011材料与方法1.1菌种酿酒酵母(S.cerevisia)1023由江南大学生物工程学院微生物教研室提供.1.2培养基1.2.1完全培养基蛋白胨2g/dL,牛肉膏1.0g/dL,葡萄糖2g/dL.如果固体培养,则另加入2g/dL琼脂.自然pH,0.08MPa灭菌20min.1.2.2高渗再生培养基在上述固体培养基中加入0.6mol/L蔗糖或按需要加入0.6mol/L其它物质.1.3主要试剂1.3.1工具酶蜗牛酶(Snailase):购自上海化学试剂公司;纤维素酶(Celluclast1.5L):由广州诺维信公司提供.蜗牛酶(固体)在使用前用磷酸缓冲液配成1酶液.Celluclast1.5L(液体)在使用前以磷酸缓冲液配成40的酶液,均以0.22m的微孔滤膜过滤除菌.1.3.2高渗稳定剂0.2mol/L的磷酸缓冲液中分别加入0.6mol/L的蔗糖,甘露醇,山梨醇,NaC1 而成.1.3.3原生质体的制备将酵母菌从斜面上接入装有30mL完全培养基的150mL三角烧瓶中,在摇床上以120r/min,30℃振荡培养20h;吸取此培养菌液1.5mL接入另一个装有30mL完全培养基的150mL三角烧瓶中,继续振荡培养6h.吸取10mL菌液于离心管中,1500r/min离心15rain,弃上清液,沉淀以生理盐水洗涤2次,最后一次洗涤后定容到10mL.吸取1mL菌液以生理盐水做稀释度,以10一,10倍的菌液在完全固体培养基上涂布培养,记数,得到的数据为每毫升原始菌液中的菌数A另吸取2mL菌液置于一个100mL的三角烧瓶中,加入2mL高渗稳定液和1mL酶液后,置于摇床上以30℃,120r/min振荡培养1h.从三角烧瓶中吸取1mL混合液于离心管中,1500 r/min离心10min,用高渗稳定液洗涤2次后定容到2mL.吸取0.5mL菌液用无菌水稀释,以10一,10_.,10倍在高渗再生培养基上涂布培养, 记数,余液待用.得到的数据经计算后为每毫升原始菌液中残留的菌数B.从A—B可以得到每毫升菌液中产生的原生质体数.从(A—B)/A可得到原生质体的产生率.1.3.4原生质体的再生从待用的离心管中吸0.5mL菌液,以高渗培养液做稀释,以10一,10_., 10～s倍在高渗再生培养基上涂布培养,记数.得到的数据经计算后,为经再生处理后每毫升原始菌液中的菌数C.从C—B可得到每毫升酶处理后经再生的菌液中的再生原生质体数.所以,从(C—B)/ (A—B)可得到原生质体的再生率.2结果2.1酶液对原生质体形成与再生的影响采用3种不同的酶液组成来研究不同的酶液组成对原生质体形成和再生的影响.第一种是用1的蜗牛酶1mL,第二种用40的Celluclast1.5L1mL,第三种是上述两种酶的混合液(每种酶各占0.5mL).原始菌液为3.2×10.CFU,酶处理时间为1h,缓冲液pH值为5.8,再生培养基中加入0.6mol/L的蔗糖,结果见表1.表1酶液组成对原生质体形成和再生的影响Tab.1Influenceofdifferentenzymepreparationsonthe productionandregenerationofyeastprotoplast从表1可见,Celluclast1.5L酶对原生质体的形成与再生的作用与蜗牛酶基本相似,而且再生率还略高于蜗牛酶.因此用Celluclast1.5L来替代蜗牛酶进行酵母菌原生质体制备和再生的方法是可行的.由于Celluclast1.5L酶对葡聚糖的专一水解作用,可以进一步通过酵母菌原生质体形成和再生的动力学研究来了解酵母菌细胞壁的构建.2.2酶处理时间的影响研究了酶处理时间对酵母菌原生质体形成和再生的影响,发现酶处理时间的增加,虽然可以增加原生质体的产生率,但原生质体的再生率反而下降了.这可能是随着作用时间的增加,酶对酵母细胞造成的损伤也随之增加的缘故,结果见表2.表2酶处理时间的影响Tab.2Effectofenzymetreatmenttime1O2无锡轻工大学第23卷2.3渗透稳定剂的影响分别用0.6mol/L的蔗糖甘露醇,山梨醇和NaCI来配制高渗缓冲液和高渗再生培养基,以研究不同的渗透稳定剂对原生质体形成和再生的影响. 原始菌液为7.0×10CFU,缓冲液pH值为5.8,工具酶为Celluclast1.5L,结果见表3.表3渗透稳定剂的影响Tab.3Effectofosmoticstabilizers从表3可见,本实验结果与其他研究者报道的结果"在真菌原生质体形成和再生中有机稳定剂的效果好于无机稳定剂,有机稳定剂中蔗糖的效果最好,甘露醇的效果次之"是一致的.2.4pH值的影响为研究不同的PH值对酵母菌原生质体形成和再生的影响,作者用0.6mol/L的蔗糖配制高渗缓冲液和高渗再生培养基,研究缓冲液pH值分别为5.8,6.8,7.2时酵母菌原生质体的产生率和再生率,原始菌液为5.6×10CFU.工具酶用Celluclast1.5L,酶处理时间为1h,结果见表4.参考文献:表4pH值的影响Tab.4EffectofpH以Celluclast1.5L为工具酶时,在酸性条件下,原生质体的产生率和形成率均比较高,其中pH5.8和pH6.8原生质体产生率几乎无差异,但是原生质体的再生率还是有一定差异的,pH值为5.8时的再生率明显高于pH值为6.8时的再生率.在pH值超过7.0后,无论是原生质体的产生率还是原生质体的再生率均大幅度降低,这种情况与酵母菌喜好在偏酸性的环境中生长是一致的.3结论纤维素酶Celluclast1.5L可以作为酵母菌原生质体的形成和再生中使用的工具酶,最佳条件是:以pH5.8的磷酸缓冲液配制的0.6mol/L蔗糖液为高渗稳定剂,质量分数8%的酶液处理lh,菌龄6h,酶处理后在加0.6mol/L蔗糖的完全培养基上再生24h.在这样的条件下,原生质体产生率与再生率与用蜗牛酶做工具酶类似.r1]LinLF,LevinRE.RelativeeffectivenessofyeastcellwalldigestingenzymesonY arrrowia lipolytica[J].Microbios,1990,63(255):109—115.[2]ByongKakKim.Mycelialprotoplastisolationandregenerationoflentinuslepideus[J].LifeSciences,2000?66(14):1359--1367.[3]单志萍.姜文候.孟妤.丝状真菌三孢布拉霉原生质体制备及再生条件的研究[J].江苏食品与发酵,1999?(3):11—14.[4]王赓,杜连祥.新月弯孢霉原生质体制备及再生条件的研究[J].微生物通报,1999,26(1):21--23..(责任编辑:李春丽)(上接第99页)参考文献:[1]王立泽,叶家栋,游庄信,等.食用菌栽培[M].合肥:安徽科技出版社,1998.[2]黄年来.中国食用菌百科[M].北京:中国农业出版社,1997.153—155.[3]唐薇,鲁新成.美味牛肝菌多糖的生物活性及抗S-180肿瘤的效应[J].西南师大(自然科学版),1999,(4):478[4]赵国华,陈宗道,李志孝,等.活性多糖研究新进展[J].食品与发酵.2001,27(7):45—48.[5]杨新美.食用菌研究法[M].北京:中国农业出版社,1998.212—213.[6]中山大学生物系生化微生物教研室.生化技术导论[M].北京:人民教育出版社,1978.9—10.[7]贾身茂,张金霞.食用菌标准汇编(一)[M].北京:中国标准出版社,1997.107—109.[8]中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所.食物营养测定法[M].北京:人民卫生出版社,1991.[9]何培新.名特新食用菌3O种[M].北京:中国农业出版社,2000.[io3扬革.担子菌纲8种真菌的营养成分[J].无锡轻工大学,2000,i9(2):174. [11]应建浙,卯晓岚.马启明.中国药用真菌图鉴[M].北京:科学出版社,1987.(责任编辑:杨勇)。

纤维素酶的组成及功能主治组成纤维素酶是一种酶类，主要由以下几种成分组成：1.β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）：负责将纤维素分解成葡萄糖，是纤维素酶中最重要的成分之一。

2.β-葡萄糖甘醇异构酶（β-glucoside glucohydrolase isomerase）：在纤维素酶作用的过程中，参与葡萄糖生成的异构化反应。

3.β-葡萄糖甘醇脱氢酶（β-glucoside glucohydrolase dehydrogenase）：在纤维素酶作用的过程中，参与葡萄糖生成的脱氢反应。

4.β-葡糖苷酶（β-glycoside hydrolase）：参与纤维素酶反应的酶类，能催化酯水解反应。

5.β-葡糖激酶（β-glycosyl kinase）：在纤维素酶反应过程中，催化葡萄糖转化为葡糖激酸。

6.β-葡糖转酶（β-glycosyl-transferase）：参与纤维素酶作用的酶类，催化糖基转移。

功能主治纤维素酶是一种重要的酶类，具有以下功能主治：1.有助于消化纤维素：纤维素酶能够分解纤维素，将其转化为可被人体消化吸收的葡萄糖。

纤维素是植物细胞壁中的一种多糖，人体无法自身分解纤维素，而纤维素酶可以帮助人体消化并吸收其中的营养物质。

2.改善胃肠道健康：纤维素酶具有促进胃肠道蠕动的作用，帮助促进消化道的蠕动，从而改善胃肠道功能，减少便秘和腹胀等胃肠道问题。

3.提高营养吸收：由于纤维素酶能够将纤维素分解成可被人体吸收的葡萄糖，因此能提高人体对纤维素的消化吸收效率，进而提高对营养物质的吸收效率。

4.降低血糖水平：纤维素酶通过将纤维素分解成葡萄糖，能够提高人体对葡萄糖的代谢能力，从而降低血糖水平。

5.促进肠道菌群平衡：纤维素酶具有调节肠道菌群平衡的作用，可以帮助提高有益菌的数量，减少有害菌的生长，进而促进肠道健康。

综上所述，纤维素酶是一种重要的酶类，具有多种功能主治，包括消化纤维素、改善胃肠道健康、提高营养吸收、降低血糖水平和促进肠道菌群平衡等。