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实验⼀质粒DNA提取纯化、DNA电泳检测实验⼀质粒DNA提取纯化、DNA电泳检测⼀、实验⽬的1．掌握质粒DNA的制备的原理和⽅法2．了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离⼆、实验原理1．质粒DNA的制备⽅法质粒(Plasmid)是独⽴存在于染⾊体外、能⾃主复制并能稳定遗传的⼀种环状双链DNA 分⼦，分布于细菌、放线菌、真菌以及⼀些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。
细菌质粒⼤⼩介于1～200Kb之间，是应⽤最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利⽤宿主细胞的复制机构合成质粒⾃⾝的DNA。
质粒DNA的制备包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA⼤量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。
主要⽅法包括：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS；煮沸裂解法：沸⽔煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS，⼀般⽤于质粒⼤量提取。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分⼦⼤⼩、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的⽤途进⾏选择。
本实验选择碱裂解法提取质粒DNA。
2．碱裂解法质粒DNA具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件⼜可以使DNA复性。
碱裂解法根据共价闭合环状质粒DNA和线性染⾊体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。
SDS是⼀种阴离⼦表⾯活性剂，它既能裂解细菌细胞，⼜能使细菌蛋⽩质变性。
SDS 处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从⽽使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。
细菌环状基因组DNA在操作过程中会断裂成线状DNA分⼦，在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开⽽被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕结合在⼀起。
当加⼊pH4.8⼄酸钾缓冲液时，pH恢复⾄中性，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在⼀起，因此复性迅速⽽准确，⽽线性的染⾊体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速⽽准确，它们相互缠绕形成不溶性⽹状结构，⽽复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。
碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。
以下是具体的实验原理和操作步骤。
实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。
接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。
最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。
操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。
在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。
2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。
使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。
将上清液倒掉，保留菌体沉淀。
3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。
4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。
这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。
5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。
上清液中含有蛋白质和其他污染物。
6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。
7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。
将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。
8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。
9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。
注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。
2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。
3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。
4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。
总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。
实验一质粒DNA的提取及定量分析一、实验原理与步骤1.实验原理：碱裂解法抽提质粒DNA质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。
当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开，而共价闭环质粒DNA 的氢键虽被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。
当加入中和液后, 溶液pH调恢复至中性，在高盐浓度的情况下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀；不同的是，质粒DNA复性迅速而准确，保持可溶状态而留在上清中。
这样，通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。
除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
2.质粒DNA提取的方法步骤①收集菌体：取1.5ml培养液至Ep管中，12000rpm离心1min，弃上清，取沉淀。
②溶解菌体：将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，强裂振荡混匀。
③变性：加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒5-6次以混匀内容物，冰上放置5分钟。
④复性：加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟。
⑤12000rpm 离心５分钟，取上清移到１个新的Ep管中。
⑥取上清（≈ 420ul），分别加入1/2体积酚(210ul)，和1/2体积氯仿/异戊醇（24:１） (210ul) ，涡旋震荡混匀溶液。
⑦12000rpm、离心5分钟。
小心移取上清液（≈ 400μl)至另一个新1.5mlEp 管中。
⑧上清液加入２倍体积（≈ 800ul ）预冷无水乙醇，混匀，于 -20℃中静置0.5h。
⑨12000rpm, 离心5分钟。
弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，12000rpm 离心10分钟。
10.干燥DNA：用移液器小心吸走上清液，然后瞬时离心，再将残余的少量液体移走，用温和的电吹风吹干DNA沉淀（以看不到液滴为准）。
质粒DNA的提取、纯化及验证姓名：肖风学号：2 2010级生物工程一、【实验目的】1、掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用，掌握碱变性法提取质粒DNA 的方法。
2、掌握质粒DNA的纯化方法，即用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质。
3、学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及凝胶中DNA的分离纯化方法。
二、【实验原理】1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
质粒dna提取实验报告质粒DNA提取实验报告引言：质粒DNA提取是分子生物学研究中常用的技术手段之一。
通过提取质粒DNA，我们可以获得特定的基因片段，进一步进行基因克隆、转染、PCR扩增等实验。
本实验旨在探究质粒DNA提取的方法和步骤，并验证提取的质粒DNA是否纯度高、浓度适宜。
材料与方法：1. 细菌培养：选择含有目标质粒的细菌菌株，如大肠杆菌。
2. 培养基制备：制备含有适当抗生素的LB培养基。
3. 菌液培养：在培养基中接种细菌菌液，培养至适当的生长期。
4. 细菌收获：离心细菌培养液，收集菌体沉淀。
5. 细胞裂解：使用裂解液将细菌细胞壁破裂，释放细胞内的DNA。
6. 蛋白质沉淀：通过加入盐溶液，将蛋白质沉淀下来。
7. DNA沉淀：加入酒精，使DNA沉淀出来。
8. 洗涤：使用乙醇洗涤沉淀的DNA，去除杂质。
9. 干燥：将洗涤后的DNA干燥至无水状。
结果与讨论：经过以上步骤，我们成功提取到了质粒DNA。
下面将对实验结果进行分析和讨论。
首先，我们需要评估提取的质粒DNA的纯度。
常用的方法是使用比色法或分光光度法测量DNA溶液的吸光度比值（A260/A280）。
纯度较高的DNA溶液其吸光度比值通常在1.8-2.0之间。
如果比值低于1.8，说明可能存在蛋白质、RNA 或其他杂质的污染，需要进一步纯化处理。
其次，我们需要评估提取的质粒DNA的浓度。
常用的方法是使用比色法或分光光度法测量DNA溶液的吸光度（A260）。
通过测量吸光度并使用标准曲线，我们可以计算出DNA的浓度。
在实验中，我们可以根据需要调整DNA的浓度，以适应后续实验的要求。
此外，我们还可以通过琼脂糖凝胶电泳来评估提取的质粒DNA的完整性。
将DNA样品与DNA标准品一同加载到琼脂糖凝胶上，经电泳分离后，通过比较DNA带的大小和形态，我们可以初步判断提取的质粒DNA是否完整。
在实验过程中，需要注意的是避免DNA的降解。
DNA在裂解液中容易受到核酸酶的降解，因此在裂解过程中应尽量避免长时间的暴露。
质粒DNA的提取与鉴定实验报告1. 实验目的本实验的目的是通过提取和鉴定质粒DNA，掌握质粒DNA的提取方法并验证提取的质粒DNA的纯度和完整性。
2. 实验原理质粒DNA提取是将质粒DNA从细菌细胞中分离出来的过程。
常用的提取方法包括碱裂解法和商业试剂盒法。
本实验使用商业试剂盒法进行质粒DNA的提取。
步骤如下： 1. 培养目标细菌，并收集细菌培养物。
2. 细菌培养物离心，收集细菌沉淀。
3. 加入细胞裂解缓冲液裂解细胞膜。
4. 加入溶解剂，使细胞溶解。
5. 加入酒精，沉淀出质粒DNA。
6. 分离质粒DNA，去除其他杂质。
7. 测定质粒DNA的纯度和完整性。
3. 实验步骤3.1 培养目标细菌1.取出目标细菌的冻存管，从-80°C的冷冻库中快速解冻。
2.取出琼脂平板，用无菌技术将细菌转接到琼脂平板上，利用无菌鹤嘴锄均匀涂抹。
3.将琼脂平板倒置放置在37°C恒温培养箱中，培养一夜。
3.2 收集细菌培养物1.取出含有细菌的琼脂平板，加入适量的无菌LB培养基。
2.用无菌移液管将培养基中的细菌转移到无菌离心管中。
3.将离心管放入低速离心机中，离心5分钟，将细菌沉淀收集。
3.3 细胞裂解1.向细菌沉淀中加入适量的细胞裂解缓冲液。
2.充分混合后，放置在冰上浸泡20分钟，使细菌细胞膜裂解。
3.4 细胞溶解1.加入等体积的溶解剂，充分混合。
2.将含有细胞裂解物的离心管放入冰上浸泡5分钟。
3.5 DNA沉淀1.向离心管中加入等体积的冷酒精。
2.轻轻倾斜离心管，使酒精与溶液充分混合。
3.放置在-20°C冷冻库中沉淀20分钟。
3.6 分离质粒DNA1.将离心管放入高速离心机中，离心10分钟。
2.将上清液倒出，保留下沉淀。
3.7 测定质粒DNA的纯度和完整性1.使用纳米比色计测定质粒DNA的浓度和纯度。
2.利用琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的完整性。
4. 结果与讨论根据实验结果，我们成功提取到了质粒DNA，并验证了其纯度和完整性。
质粒dna的提取实验报告质粒DNA的提取实验报告。
实验目的，通过实验，掌握质粒DNA的提取方法，了解质粒DNA的结构和特点。
实验原理，质粒DNA是细菌细胞内的一种环状双链DNA，具有自主复制的能力。
提取质粒DNA的方法一般包括细胞破裂、蛋白质和RNA的去除、质粒DNA的纯化等步骤。
实验材料，细菌培养物、质粒DNA提取试剂盒、离心管、离心机、PCR仪等。
实验步骤：1. 取细菌培养物1ml，进行细菌离心，将菌体沉淀。
2. 加入细菌破裂液，使菌体破裂释放质粒DNA。
3. 加入蛋白酶和RNase，去除蛋白质和RNA。
4. 用离心机离心，将沉淀物中的DNA纯化。
5. 用PCR仪进行PCR扩增，验证提取的质粒DNA。
实验结果：经过实验，成功提取到了质粒DNA。
通过PCR扩增，验证了提取的质粒DNA 的完整性和纯度。
实验结论：通过本次实验，我们成功掌握了质粒DNA的提取方法，了解了质粒DNA的结构和特点。
质粒DNA的提取是分子生物学研究中的重要步骤，掌握了这一技术，将为我们今后的科研工作提供有力支持。
实验注意事项：1. 在实验过程中要注意细菌培养物的处理和离心操作的安全性。
2. 实验中使用的试剂盒要按照说明书操作，注意避光和保存条件。
3. 实验过程中要注意保持实验环境的清洁和整洁，避免外源DNA的污染。
4. 实验结束后要及时清理实验台和设备，保持实验室的整洁。
通过本次实验，我们不仅掌握了质粒DNA的提取方法，还培养了实验操作的技能和实验室的安全意识。
这对我们今后的科研工作具有重要的指导意义。
试验四质粒DNA提取, 纯化与判定DNA体外重组技术【试验原理】是在分子水平上, 依据大家需要以人工方法取得感爱好目基因, 在体外与载体DNA分子重组, 然后将重组分子转入受体细胞, 并筛选出能表示重组DNA活细胞, 加以纯化、扩增, 成为克隆。
【试验步骤】1.分离或合成感爱好目基因及载体---分2.构建、改造作为载体DNA------------切3.目基因与载体DNA在体外重组--------接4.重组DNA引入受体细胞----------------转5.阳性重组子筛选、判定、扩增-------筛【注意事项】目基因取得:1.从染色体DNA中直接分离2.人工合成3.由mRNA逆转录合成cDNA4.从基因组文库中筛选目基因5.PCR取得载体选择:1.能在宿主细胞中独立复制, 并能携带重组DNA片段一同扩增;2.有适宜限制性酶切位点便于进行克隆;3.有一定筛选标识, 易于识别和筛选;4.载体分子应尽可能小, 可插入较大外源DNA而不影响复制;5.表示型载体应配置与宿主细胞相适应开启子、前导序列、增强子等调控元件;6.生物安全性好。
质粒DNA提取【试验原理】质粒是细胞质中独立于染色体之外能自主复制遗传单位。
基因工程中质粒通常是指细菌质粒, 它能够伴随细菌细胞分裂将自己遗传特征稳定遗传给后代细胞。
质粒中除了复制、转录等相关必需序列外, 有部分DNA区段对于细菌来说并非必需序列, 经过体外操作以目基因替换这些非必需区段, 这种改造质粒就成为外源基因载体。
根据质粒载体用途和其外源DNA遗传信息能否表示可分为中间克隆载体（如pMD18-T）和表示载体（如pET-X、 pBI121等）。
克隆载体所连接DNA片段通常没有开启子, 所以不能转录, 关键用于目片段大量制备。
表示载体根据宿主不一样有多种多样原核表示载体（如大肠杆菌）和真核表示载体（如酵母、动物和植物）, 目基因在载体上有完整开启子和终止子调控, 能够在宿主细胞中转录并翻译成蛋白。
质粒DNA的提取纯化及验证一、实验目的掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的使用并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理和方法。
二、实验原理1、碱变性提取法提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。
提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。
细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。
在pH值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。
当用pH值4．6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质一SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
2、琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。
此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(EB)或SYBR Gold染色直接观察到，甚至含量少至20 Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。
需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。
分子生物学实验中，常用的两种凝胶为琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。
这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。
琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。
在溶液中，由于核酸有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。
DNA 在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6个因素：(1)样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与相对分子质量(所含碱基)的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。
(2)DNA分子的构象：相对分子质量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。
在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)的一条链断裂，变成开环DNA(open circle DNA，oeDNA)分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA(1iner DNA，L DNA)分子。
这三种构型的分子有不同的迁移率。
一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。
(3)琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。
通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。
(4)电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比，电压越高，带电颗粒泳动越快，但随着电场强度的增加，不同长度DNA泳动的增加程度不同，因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减少。
为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5 V／cm。
(5)缓冲液：缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。
当电泳液为去离子水(如不慎误用去离子水配制凝胶)，溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下(如错用10×电泳缓冲液)，导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。
(6)温度：琼脂糖凝胶电泳时，不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在4～30℃内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于0．5％时，凝胶很脆弱，最好在4℃下电泳以增加凝胶强度。
三、实验步骤及现象1、质粒的提取EcoliDH5α（PUC19）→LB+AP平板划线→37℃，16-18hr→单菌落→LB+AP(80ml)→37℃,O/N→LB+AP(80ml)→37℃，4-6hr→称管重W1,约30ml菌液→10000rpm,1min→去上清，加5mlⅠ,涡旋→10000rpm,1min→去上清，吸干净→称重W2→1mlⅠ,涡旋，冰浴5min→2mlⅡ,颠倒摇匀，冰浴5min→1.5mlⅢ,缓慢摇匀，冰浴5min→12000rpm,10min →转上清至新管→2V冰乙醇，匀，-20℃，>30min→12000rpm,15min→去上清→2ml70%乙醇清洗→10000rpm,1min →去上清→2ml70%乙醇清洗→10000rpm,1min→去上清→37℃,5-10min→1mlTE溶液→10μl RNase(10μg/μl),37℃,1hr2、纯化两份完全一样的500μl粗提物→加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）→12000rpm,5min→转上清至新管（V1）→加等体积（V1）酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）→12000rpm,5min→转上清至新管（V2）→加等体积（V2）酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）→12000rpm,5min→转上清至新管（V3）→加1/10V33MNaAc+2V冰乙醇→取沉淀→-20℃,30-60min→12000rpm,15min→弃上清→500μl70%乙醇→12000rpm,5min→弃上清→500μl70%乙醇→12000rpm,5min→吸净上清→37℃,5-10min→两管25μl TE溶液→50μl/组→得纯化质粒DNA3、检测40ml×TAE→300ml锥形瓶→称0.4g琼脂糖→微波炉沸腾3次→50-60℃→倒板成型取3μl DNA+1-2μl 6×loading Buffer→混匀→点样→100V，电泳，40min→EB染色10min→水洗10min→紫外成像→分析备注：1、操作时，注意无菌操作，物品应在酒精灯火焰上方无菌区域内。
2、在接菌时，将挑有菌体的接种环在三角瓶壁上轻轻接触，然后轻轻摇动三角瓶，让液体的LB培养基轻轻冲刷菌体，当观察到附近的LB培养基有轻微浑浊现象时，接菌成功，再轻轻震荡三角瓶，使全部菌体进入培养基中。
3、注意离心机的使用，离心管要配平，以防错误操作损坏离心机。
离心结束后，将离心管从离心机中取出时应保持其倾斜状态，防止沉淀重新进入上清液中。
4、加入溶液Ⅰ后，将离心管盖好后放于旋涡振荡器上振荡，无白色菌体块状物悬浮在液体中，即已振荡均匀。
5、溶液Ⅱ为强碱性溶液，目的是使细胞破裂，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂。
在加溶液Ⅱ时，要逐滴缓慢加入，边加边轻轻摇动离心管，此时，可观察到离心管中液体呈粘稠的蛋清状。
6、溶液Ⅲ为高盐溶液，调节碱性溶液至中性，使变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
7、将离心管置于冰上，使细胞破裂，细胞内的各种酶释放出来。
冰浴的目的即为降低酶的活性，防止酶将质粒DNA降解。
8、室温下，将离心管干燥至管壁上没有肉眼可见的液珠，沉淀边缘2mm干燥至透明为止。
将沉淀位置做好标记，以便下一步的溶解。
9、无水乙醇和盐溶液可使溶于上清液中的质粒DNA凝聚而形成沉淀。
10、在质粒DNA沉淀的同时，由于RNA与DNA性质类似，RNA会同时沉淀。
混在质粒DNA中的RNA会用RNase 除去。
14、苯酚具有强氧化性，在此步骤中是使蛋白质变性，从而使蛋白质沉淀下来，将其从质粒DNA中除去。
操作时，注意安全。
氯仿可以克服酚的缺点加速有机相与水相分层，并且抽提去除质粒DNA溶液中的残留酚。
异戊醇起到消泡的作用，并且有助于分层。
15、离心后，溶液分层，下层氯仿：异戊醇中已经基本不含蛋白质沉淀，上层水相中，质粒DNA中混杂的蛋16、无水乙醇的作用是沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。
乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。
17、由于DNA带负电荷，加入NaAc的作用就是是中和DNA所带的负电荷，使DNA之间的排斥力减小，有助于DNA的沉淀。
18、70％乙醇的作用一方面是继续沉淀DNA，另一方面可以除去上一步骤中溶解在溶液中的盐离子。
四、实验结果本组电泳条带图1 质粒DNA 电泳条带DNA marker RNA图2 λDNA/ HindⅢMarke r左起：⑴DNA marker:λ/HⅢ⑵PUC19 ⑶PUC19/HⅢ⑷-⒁各组结果⒂未加RNase ⒃λDNA ⒄⒅DL-5000第十一条电泳条带为我们第八组的电泳条带，即箭头所标识。
上图直线所标示的条带从上到下依次是①蛋白质、②染色体DNA、③开环质粒DNA、④线性质粒DNA、⑤超螺旋质粒DNA、⑥RNA从图中可以发现我们组的条带：1、点样孔处有白色条带，说明含杂蛋白，纯度不高。
原因是在纯化的过程中我们并未用平衡酚去除蛋白质。
2、染色体DNA区带，亮度较高，说明样品中含有的染色体DNA较高。
可能是由于在质粒提取过程中，分离染色体DNA与质粒DNA的时候，吸取上清液（质粒DNA）的同时不小心吸取到了下面的沉淀（染色体DNA），造成样品中混杂部分染色体DNA。
3、我们提取出的质粒DNA中开环质粒DNA和线性质粒DNA的电泳条带不清晰，由亮度可知含量也较少。
4、超螺旋状态的pUC19质粒，书上查得其质粒大小2.69Kbp，纯度较高。
5、15组的条带下方的宽、亮条带为RNA的条带，比较可知，我们经过RNase处理过的基本没有RNA的条带，说明RNA酶对RNA的分解进行的比较彻底。
五、注意事项(1)在大量提取质粒DNA之前，应先利用小量提取法检测质粒DNA是否为目的质粒。
若为目的质粒，将新鲜菌液以1％～2％比例接种到50 mL液体培养基中，37℃振荡培养过夜或培养至对数生长晚期。
