过表达CCR3的人胃癌细胞株的建立

过表达质粒的构建及转染质粒及菌液说明过表达质粒为高纯度的DNA 粉末制品，经过真空冷冻干燥的质粒是呈薄膜状或粉末状附在离心管中，请适当离心(10000r/min 10~15s)后小心开启，以免飞扬丢失。

请根据实验需要的质粒浓度和质粒的总量加入适量的ddH2O (通常建议储存液浓度500ng~1μg/μL），合上管盖充分震荡使其溶解后可用于细胞转染及其他分子生物学实验。

粉末制品的DNA 可长期保存（建议最好不要超过6个月），质粒溶解后建议在-20℃的环境中存贮，避免多次冻融处理。

2、甘油菌液为含有重组质粒的菌液的过夜培养物与甘油的混合物，甘油的终浓度为20% 。

客户收到甘油菌液建议即刻活化（例如取50~100µL到5mL 含有相应抗性(根据载体种类可以选择25~50μg/mL 卡那霉素或50~100μg/mL 氨苄霉素）的LB 培养基过夜活化（12~16h），活化后的菌液与适量甘油混匀后于-80℃保存。

）3、重组质粒测序峰值图文件结果请参见附件报告中的.abl 文件。

测序序列文件参见与峰值图文件同名的.seq 文件。

基因过表达实验设计在使用载体法针对某一基因进行过表达研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因表达效率的检测。

1. 实验对照组的确立在一个完善的基因过表达实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。

通常，这些对照组包括阴性对照、转染试剂对照。

阴性对照通常是用基因过表达选择的载体对应的空载体来作为对照。

2. 细胞转染条件的确定使用DNA 载体转染细胞时，为了选择合适的转染方法和确定转染效率，通常采用报告基因来检测DNA 的导入情况。

最常用的报告基因是绿色荧光蛋白。

3. 基因表达效率的检测通常用两大类方法来检测过表达质粒中目的基因表达的效率，一类方法是直接检测目的基因在不同水平如mRNA 和蛋白水平的变化，具体的方法如qPCR 和Western blot 等；另一类方法是通过检测目的基因的生物学效应和细胞效应来间接的反映目的基因的表达变化，这一类方法很多，不同的基因有不同的检测方法。

CXCR3论文：小鼠CXCR3A及人CXCR3B基因转染细胞株的构建、鉴定及生物学功能研究【中文摘要】CXC Chemokine Receptor 3——CXCR3(CD183)是一种七次跨膜的G-蛋白偶联受体,目前已发现三种剪接变体,分别为CXCR3-A(即通常所说的CXCR3)、CXCR3-B及CXCR3-alt。

CXCR3A主要表达于活化/记忆T细胞、NK细胞及巨噬细胞,其配体为CXCL9/Mig、CXCL10/IP-10及CXCL11/I-TAC。

近年研究发现,CXCR3A在一些恶性肿瘤细胞表面高表达,通过受体-配体相互作用介导肿瘤的转移和侵袭。

CXCR3B主要表达于内皮细胞,除了可与CXCL9/Mig、CXCL10/IP-10及CXCL11/I-TAC结合,其还是CXCL4/PF4的功能性受体。

配体与血管内皮细胞表面的CXCR3B结合可诱导细胞凋亡,在维持血管稳定方面具有重要作用。

本研究旨在克隆小鼠CXCR3A基因并将其转入不表达该分子的小鼠黑色素瘤细胞B16中,在体内外研究B16-mCXCR3A细胞的迁移能力和致瘤性。

同时克隆人CXCR3B基因,并建立稳定表达人CXCR3B分子的基因转染细胞株L929-huCXCR3B,为制备相应的单克隆抗体奠定了物质基础。

第一部分小鼠CXCR3A基因的克隆及基因转染细胞株B16-mCXCR3A的构建克隆小鼠CXCR3A基因并构建稳定表达该分子的基因转染细胞株B16-mCXCR3A。

采用PCR方法从pMD19-T/mCXCR3A质粒中扩增小鼠CXCR3A基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染小鼠黑色素瘤细胞B16;G418加压筛选阳性克隆,分别用RT-PCR方法与免疫荧光技术分析阳性克隆中CXCR3A在mRNA和蛋白水平的表达。

构建了表达小鼠CXCR3A基因的真核表达载体pIRES2-EGFP/mCXCR3A,转染该载体后获得了稳定表达小鼠CXCR3A的B16-mCXCR3A细胞。

胃癌组织中CXCR3表达与微血管形成的关系及其临床意义李凯;刘杰【摘要】目的探讨胃癌组织中CXCR3的表达和微血管形成的关系并分析其临床意义.方法采用免疫组化法检测169例胃癌组织中CXCR3蛋白表达和肿瘤间质微血管密度(microvascular density,MVD),分析其相关性及其与胃癌临床病理参数的关系.结果 CXCR3表达在分化程度高(P =0.025)、浸润程度浅(P=0.005)、TNM 分期低(P =0.002)及无淋巴结转移(P=0.001)的胃癌患者中更高;MVD在胃癌分化程度低者中更高(P =0.001),与浸润深度、TNM分期及淋巴结转移无关(P＞0.05).胃癌组织中CXCR3表达与MVD呈负相关(r=-0.151,P=0.049).Kaplan-Meier分析发现高表达CXCR3的胃癌患者(P=0.015)和低MVD患者(P =0.047)的生存时间延长.结论胃癌中CXCR3的表达与MVD呈负相关,且与胃癌的浸润、转移相关.【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2016(032)010【总页数】4页(P1097-1100)【关键词】胃肿瘤;CXCR3;CD34;微血管密度【作者】李凯;刘杰【作者单位】湖北医药学院附属东风总医院病理科,十堰442000;湖北医药学院附属人民医院重症医学科,十堰442000【正文语种】中文【中图分类】R735.2胃癌是全球范围内常见恶性肿瘤之一[1]。

目前胃癌最主要的治疗方式是外科手术治疗，但对于进展期胃癌患者即使应用了胃癌扩大根治术，5年生存率仍较低[2]。

近年来，手术切除术、新辅助化疗及个体化分子治疗等综合治疗取得很大进步，但术后转移率、复发率和病死率未有明显改善[3,4]。

趋化因子受体CXCR3在肿瘤发生、发展中起着复杂的作用，但CXCR3在不同肿瘤中表现出双向的调节作用，即抗/抑肿瘤作用或促肿瘤作用。

如在乳腺癌[5]、黑色素瘤[6]和结直肠癌[7]中CXCR3高表达者易发生淋巴结转移，预后较差；而在慢性淋巴细胞白血病[8]、前列腺癌[9]和肾透明细胞癌[10]中CXCR3高表达者预后较好。

托珠单抗的生产工艺托珠单抗（英文名：Trastuzumab）是一种单抗药物，用于治疗HER2阳性乳腺癌及胃癌。

以下是托珠单抗的生产工艺简要步骤：1.克隆的细胞线的建立：首先，选择HER2阳性癌细胞株，通过多个世代的传代，筛选出高表达HER2的细胞株，建立托珠单抗生产的克隆细胞线。

2.克隆的细胞培养：将克隆细胞线培养在适当的细胞培养基中，提供适当的营养和生长条件，以增殖和扩大细胞数量。

3.生物反应器培养：将克隆细胞线转移到大规模生物反应器中，继续培养细胞以达到更高的细胞密度。

4.生物反应器过程优化：针对不同阶段的细胞生长状态进行调整，如增加氧气供应和调节营养成分浓度，以提高细胞生长和抗体产量。

5.细胞培养上清液收集：在培养过程中，通过适当的时间点，收集细胞培养上清液（包含细胞所释放的托珠单抗）。

6.细胞培养上清液的初步纯化：通过离心和滤过等方法，将其初步纯化，去除细胞残渣和杂质。

7.亲和层析纯化：将初步纯化的上清液通过亲和层析柱，利用托珠单抗与柱内特定亲和树脂之间的特异性结合，实现托珠单抗的纯化。

8.超滤与浓缩：将纯化后的溶液通过超滤膜，去除小分子杂质，并将托珠单抗溶液浓缩，以得到更高浓度的托珠单抗。

9.配制和灭菌：将浓缩的托珠单抗溶液与适当的缓冲溶液和稳定剂配制，然后进行灭菌处理以确保制剂的无菌性。

10.产品填充和包装：将药物制剂填充到合适的容器中，如玻璃瓶或预分装的注射器，然后进行密封和包装。

以上为托珠单抗的一般生产工艺步骤。

实际的生产工艺可能会因制药公司和厂家而有所不同，但整体流程相对类似。

需要注意的是，生产工艺中的每个步骤都需要遵守相应的质量管理和监管规定，以确保最终产品的质量和安全性。

人胃癌裸鼠原位种植转移模型的建立实验具体方法及步骤以反复接种传代于裸鼠皮下的SGC-7901 人胃癌细胞株建立的移植瘤组织块为材料，将其用生物吻合OB胶原位粘贴于裸鼠胃壁，并与传统"胃囊法"、”皮下移植法“比较观察移植肿瘤的生长情况、移植成功率和自发转移的发生率。

一、实验材料准备6周龄BALB/c 无胸腺裸鼠24只，雌雄兼用，体重18-20 g。

传代于裸鼠皮下的SGC-7901人胃癌细胞株，本实验肿瘤组织为第6代。

二、人胃癌SGC-7901组织块制备1. 无菌条件下取人胃腺癌SGC-7901J标本中的组织数块，直径约0.5-1.0 cm，去除坏死组织，漂洗，滤纸吸干后置RPMI-1640液中剪成1-2 mm 的小块，制备成单细胞悬液（5×108-2.5×1011 /L）。

2. 置于18号套管针针口，碘棉消毒裸鼠右腋背部皮下，局部接种，逐日观察，待肿瘤长至1.0-1.5 cm时处死裸鼠，取出肿瘤组织按上述方法传代，传代瘤鼠与实验用鼠同为BALB/c无胸腺裸鼠，本组瘤源为第6代。

三、模型的建立1. 将24只健康裸鼠随机分为3 组，即皮下移植组、胃囊法组和OB胶粘贴组，每组8只。

2. 将传代瘤鼠拉颈处死，无菌操作，从腋部皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，切开选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织，切成1 mm ×1 mm×1 mm小块，置于生理盐水中备用。

3. 皮下移植组：将切好的瘤块置于18号套管针针口，碘棉消毒裸鼠右腋背部皮下，局部接种。

4. 胃囊法组：腹腔注射50 mg/kg氯胺酮麻醉裸鼠，无菌条件下沿左侧正中旁线切开，刀口约1.5 cm，小心暴露腹膜、胃壁，在胃壁缝制粘膜小囊，将肿瘤组织块包埋于其中，缝合关腹。

5. OB胶粘贴组：腹腔注射50 mg/kg氯胺酮麻醉裸鼠，常规消毒皮肤，沿左侧正中旁线切开，刀口约1.5 cm处小心暴露腹膜、胃壁，用一次性注射针头轻微损伤胃大弯中部浆肌层，以出血为度，将肿瘤组织用医用吻合OB胶粘合在破损处，用0号线缝合腹膜腹壁，关腹。

过表达Pitx3基因慢病毒表达载体的构建及稳定细胞株的建立目的构建并包装大鼠Pitx3基因过表达慢病毒并建立稳定过表达Pitx3基因的MES23.5 多巴胺能神经细胞株。

方法采用RT-PCR方法扩增Pitx3基因片段并将其连接于含有嘌呤霉素抗性的Plv-cs2.0-N-FLAG载体质粒，采用慢病毒包装四质粒系统（pRRE/pVSVS/pREV/pLV），用转染试剂Lipofectamine 2000将四质粒按一定比例转染293T细胞；收集慢病毒上清并感染MES23.5细胞株，嘌呤霉素稳定表达Pitx3的MES23.5细胞株，Western blotting检测Pitx3蛋白的表达。

结果限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳结果表明在900bp处有一明显条带；Pitx3测序结果显示序列与gene bank上的序列完全一致；嘌呤霉素筛选病毒感染的MES23.5细胞，传代筛选第5代后细胞几乎无死亡现象；Western blotting结果显示，在分子量为43kDa处有相应条带。

结论成功构建过表达Pitx3基因的慢病毒表达载体并建立了稳定表达Pitx3基因的MES23.5细胞株，此研究为进一步探讨Pitx3基因的功能提供了良好的研究工具。

标签：Pitx3；慢病毒；载体构建；过表达帕金森病（Parkinson Disease，PD）是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，主要临床症状为静止性震颤、肌强直、动作减少和自主活动障碍等，主要的病理特征是中脑黑质多巴胺（Dopamine，DA）能神经细胞的慢性进行性变性死亡。

胶质细胞系源性神经营养因子GDNF对受损的黑质DA能神经细胞具有很好的保护作用，如何促进内源性GDNF表达的增加是当前PD治疗的研究热点[1，2]。

转录因子Pitx3属于垂体同源盒家族成员，最初发现在发育中的骨骼肌和眼晶状体中有表达，随着研究的进展，发现其在中脑黑质致密部和腹侧被盖区高表达[3，4]。

Pitx3是维持黑质致密部DA能神经细胞存活必需的因子，在DA能神经细胞的生长和分化过程中发挥着重要的作用。

人胃癌组织块裸鼠胃癌原位移植模型的建立实验具体方法及步骤一、实验材料准备BALB /C nu /nu裸鼠12只，雌雄兼用，4～6周龄，体质量18～20 g，SPF级条件下饲养。

传代于裸鼠皮下的SGC-7901人胃癌细胞株。

二、裸鼠皮下移植瘤的建立和传代1. 收集体外培养的SGC-7901细胞，使细胞含量为5 x107 /ml，制成细胞悬液然后取0.2 ml注入裸鼠颈背部皮下。

2. 当皮下移植瘤长至直径为1 cm左右时无菌操作取出移植瘤，去除坏死组织，漂洗后，将瘤组织切成约1～2 mm的小块，研磨过滤制备成单细胞悬液局部注入另一只裸鼠颈背部皮下，如此成瘤后鼠间反复传5代。

三、原位移植模型的建立1. 将第5代致瘤的裸鼠脱颈处死后无菌操作取出第5代皮下移植瘤，剔除纤维包膜和坏死组织，选取生长良好呈淡红色鱼肉状的瘤组织用眼科剪切成1 mmx1 mm x2 mm的小块，浸泡于已配好的纤维蛋白原溶液中置于冰袋上备用。

2. 实验裸鼠术前禁食，以1 ml氯胺酮( 5 g/ml)腹腔注射麻醉后，固定四肢并进行常规皮肤消毒，选腹左侧正中切开皮肤1. 5 cm，逐步进腹，显露胃壁后将胃拉出，在胃大弯处近胃窦旁用1 ml无菌空针头划破胃壁浆肌层，植入3～4块瘤组织块，并在瘤表面滴上约10 μl凝血酶，使其覆盖瘤组织表面，约10 s左右待凝血酶与纤维蛋白原发生反应形成胶状物后，瘤组织块黏合在胃壁破损处，然后将胃壁口纳入腹腔。

3. 分别采用6-0缝合线缝合腹膜(含肌层) ，3-0缝合线缝合腹壁，关腹结束手术，以上操作均在超净台内进行，共建6例模型。

四、原位移植致瘤率及移植瘤侵袭和转移情况观察1. 移植术后精心饲养，定时观察所有裸鼠全身状况、进食情况、运动情况和腹部体征。

2. 当荷瘤鼠出现消瘦、精神萎靡及弓背等全身衰竭体征时，脱颈处死，探查腹腔中瘤体生长状况、有无腹腔积液形成及周围脏器受累情况。

3. 然后留取原位瘤组织，胸腹腔重要脏器胃、肺、肝、腹膜等组织，用10%甲醛固定后，石蜡包埋、切片、HE染色，进行组织病理学检查。

、概念、概念1、细胞系（Cell Line）：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。

2、细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。

细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。

如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecell strain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuous cell strain）。

对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。

二、建立细胞系（或株）的要求什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。

对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做如下说明：1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物；个体性别、年龄；取材的器官或组织。

如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。

2、细胞生物学检测：了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。

如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。

3、培养条件和方法；应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。

三、若干细胞建株的要点及基本过程（一）肿瘤细胞培养技术要点1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。

取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。

其培养方法及冻存方法同前述正常组织。

2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。