微生物实验(6)

医学检验—微生物基础（六）培养基一、分类1.营养琼脂：标本及各类细菌的增菌培养。

【基础培养基】2.血平板：各类细菌检验标本的分离。

【营养培养基】3.巧克力平板：疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标本。

【营养培养基】4.中国蓝平板或伊红亚甲蓝平板：筛选革兰阴性细菌；鉴别发酵型革兰阴性杆菌菌种。

【弱选择培养基】5.麦康凯平板：筛选革兰阴性杆菌和非发酵菌。

【弱选择培养基】6.SS琼脂：筛选肠道致病菌，如志贺菌和沙门菌。

【强选择培养基】煌绿可以抑制大肠埃希菌7.碱性琼脂或TCBS琼脂：从粪便中分离霍乱弧菌及其他弧菌。

8. 真菌培养基：沙保弱培养基二、血琼脂上的溶血1.α溶血：又叫草绿色溶血，菌落周围血培养基变为绿色环状。

2.β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的环。

3.γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化；红细胞没有溶解或无缺损。

4.双环：双层溶血环，内层为β溶血，外层为α溶血。

如产气荚膜梭菌。

三、气味1.铜绿假单胞菌（生姜气味）2.变形杆菌（巧克力烧焦气味）3.厌氧梭菌（腐败的恶臭味）4.放线菌（泥土味）等。

四、细菌在液体培养基中的生长现象1.浑浊生长：大多数细菌。

2.沉淀生长：少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌。

3.菌膜生长（表面生长）：专性需氧菌如枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌。

五、细菌在半固体培养基中的生长现象1.有鞭毛在穿刺线的两侧均可见羽毛状或云雾状浑浊生长，为动力阳性。

2.无鞭毛的细菌只沿穿刺线呈明显的线状生长，为动力试验阴性。

六、细菌非培养检测方法1.细菌毒素检测内毒素：鲎试验常见于革兰阴性菌感染外毒素：体内及体外毒力实验常见于革兰阳性菌及部分阴性菌。

2.实验动物①无菌动物：就是指不能检出任何活的微生物和寄生虫的动物。

②悉生动物：给无菌动物引入5-17种正常肠道菌群培育而成的动物③无特殊病原动物:无特定的微生物或寄生虫的动物④清洁动物：不带有人畜共患病原或烈性传染病病原及常见传染病病原的动物⑤常规动物：在自然环境中饲养的带菌动物七、细菌的自动化检测1.自动血培养检测系统基本原理：检测细菌和真菌生长时所释放的二氧化碳（C02）来作为血液中有无微生物存在的指标。

实验六化学药剂对微生物生长的影响一、实验目的1、了解化学药剂的杀菌和消毒作用。

2、掌握常用消毒剂的浓度和使用方法。

二、基本原理一些化学药剂对微生物的生长有抑制或杀死作用。

因此，在实验室内和生产上常利用某些化学药剂进行杀菌或消毒。

不同的药剂或同一药剂对不同微生物的杀菌能力不同。

此外，药剂浓度、作用时间及环境条件不同，其效果也不一样。

使用前需进行试验，灵活选择。

三、器材1、菌种：培养24～48h的大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。

2、培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，75%酒精，新洁而灭，50%来苏儿，3、仪器与其他用具：恒温培养箱，无菌平皿，无菌水，无菌吸管(1mL)，镊子，直径0.6cm的无菌圆形滤纸片。

四、实验方法1.制平板：取无菌平皿三套，将已熔化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按无菌操作法倒入平皿中，使冷凝成平板。

2.制备菌悬液：取无菌水3支，用接种环分别取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌1～2环接入无菌水中，充分混匀，制成菌悬液。

3.接种：用无菌吸管分别吸取已制好的菌悬液0.1mL接种于平板上，用无菌玻璃涂布棒涂匀。

注意做好标记。

4.浸药：将灭菌滤纸片分别浸入四种供试药剂中。

5.加药剂：用无菌镊子夹取浸药滤纸片(注意把药液沥干)，分别平铺于同一含菌平板上，注意药剂之间勿互相沾染。

并在平皿背面做好标记。

6.培养：将平皿置于28℃下培养48～72h后观察结果。

五、实验结果取出培养平皿，观察滤纸片周围有无抑菌圈产生，并测量抑菌圈的大小，将测量结果填入表中。

不同化学药剂对细菌的抑制效果（抑菌圈直径cm）化学药剂抑菌圈直径（cm）大肠杆菌金黄色葡萄球菌75%酒精新洁而灭50%来苏儿链霉素空白对照思考：哪种化学药剂对微生物的生长影响较大。

实验六微生物细胞大小的测定一、目的要求1.学会测微尺的使用和计算方法。

2.掌握酵母菌细胞大小测定的方法。

二、基本原理微生物细胞大小, 是微生物的形态特征之一,也是分类鉴定的依据之一。

由于菌体很小, 只能在显微镜下测量。

用来测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片。

一般将1mm等分为100格（或2mm等分为200格）,每格长度等于0．01mm（即106μm）。

是专用于校正目镜测微尺每格长度的。

目镜测微尺是一块可放在接目镜内的隔板上的圆形小玻片, 其中央刻有精确的刻度, 有等分50小格或100小格两种, 每5小格间有一长线相隔。

由于所用接目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不同, 目镜测微尺每小格所代表的实际长度也就不同, 因此,目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小, 在使用前必须用镜台测微尺进行校正, 以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值, 然后才可用来测量微生物的大小。

三、器材枯草芽孢杆菌染色玻片标本, 目镜测微尺, 镜台测微尺, 显微镜, 擦镜纸, 香柏油等。

四、操作步骤1. 目镜测微尺的标定(1)放置目镜测微尺取出接目镜, 旋开接目镜透镜, 将目镜测微尺的刻度朝下放在接目镜筒内的隔板上（图Ⅳ-4, B）, 然后旋上接目透镜, 最后将此接目镜插入镜筒内（图Ⅳ-4, C）。

(2)放置镜台测微尺将镜台测微尺置于显微镜的载物台上, 使刻度面朝上。

(3)校正目镜测微尺先用低倍镜观察, 对准焦距, 当看清镜台测微尺后, 转动接目镜, 使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行, 移动推动器, 使目镜测微尺和镜台测微尺的某一区间的两对刻度线完全重合, 然后计数出两对重合线之间各自所占的格数（图Ⅳ-6）。

根据计数得到的目镜测微尺和镜台测微尺重合线之间各自所占的格数, 通过如下公式换算出目镜测微尺每小格所代表的实际长度。

目镜测微尺每小格长度（μm）=同法校正在高倍镜和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。

环境因素对微生物的影响和紫外诱变效应生05 边晔 2010030026周四班同组成员：徐竞实验时间 2012年11月22日一、实验目的1.了解物理因素、化学因素及生物因素抑制或杀死微生物的作用及其试验方法。

2.了解紫外线诱变原理，并初步掌握紫外线诱变育种的方法。

3.练习单菌落划线分离微生物。

二、实验原理在自然界中，微生物分布极其广泛，几乎无处不在，微生物的生长发育受着环境因素的影响。

而不同的微生物及微生物不同的生理状态受环境因素影响的程度也不同，有的环境因素是微生物生长繁殖所必需的条件，有的表现为抑制作用，有的表现为杀菌作用。

温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细胞结构来影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢。

微生物群体生长、繁殖最快的温度为其最适生长温度，但它并不等于积累某一代谢产物的最适温度。

粘质沙雷氏菌能产生红色或紫红色色素，菌落表面颜色随着色素量的增加呈现出由橙黄到深红色逐渐加深的变化趋势。

常用的化学消毒剂主要包括重金属及其盐类、有机溶剂(酚、醇、醛等)、卤族元素及其化合物和表面活性剂等。

根据是杀死还是抑制微生物，可分为致死剂和抑制剂。

常用的3个指标：最低抑制浓度（MIC）、半致死剂量和最低致死剂量。

许多微生物在其生命活动过程中能产生某种特殊代谢产物如抗生素，具有选择性地抑制或杀死其他微生物的作用。

不同抗生素的抗菌谱是不同的，某些抗生素只对少数细菌有抗菌作用。

产黄青霉分泌青霉素抑制细菌细胞壁的合成。

青霉素主要抗G＋细菌。

链霉素作用于核糖核酸30S亚基，所以链霉素只作用原核生物。

链霉素以抗G－细菌为主。

紫外线具有杀菌作用主要是因为它诱导形成胸腺嘧啶二聚体来破坏DNA的结构，使其不能正常行使功能。

另外，空气在紫外线照射下产生臭氧(O3)，也有一定杀菌作用。

紫外线杀菌力最强的波长是226-256nm部分。

紫外线透过物质能力很差，所以只适用于空气及物体表面的灭菌，它距离照射物以不超过1.2米为宜。

南京大学生物技术系实验报告题目细菌染色法姓名年04 月12 日【一、实验目的】1、学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的染色法。

2、初步认识细菌的形态特征。

3、巩固显微镜(油镜)的使用方法和无菌操作技术。

【二、实验原理】1、革兰氏染色是广泛使用的细菌鉴别染色法，可将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖层厚，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小、孔径降低、结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈紫色。

革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，而且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解、细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，因而细胞被脱色，再经番红复染后细胞呈红色。

2、芽孢具有不易渗透的厚壁，着色及脱色均较困难，因此在做芽孢染色时先用着色力强的染料使芽孢与菌体都染上颜色，再用脱色液将菌体脱色，并用不同颜色的复染液复染，使芽孢与菌体染成不同的颜色。

3、在某些细菌细胞壁外形成一层较厚且固定的黏性物质称为荚膜(荚膜的厚薄，可因环境的不同而改变)。

荚膜与染料亲和力低，所以观察荚膜时，常使菌体与背景着色，把无色的荚膜衬托出来。

4、苏云金芽孢杆菌的晶体是特殊的细胞内含物，晶体的存在与否，是作为苏云金芽孢杆菌类生物的检验项目之一。

利用区别染色，可以达到区别晶体、芽孢和菌体细胞三者的目的。

【三、实验材料、主要仪器和试剂】1、材料：枯草芽孢杆菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E. coli)、苏云金芽孢杆菌2、试剂：蒸馏水、草酸铵结晶紫染液、鲁古氏碘液、95%乙醇、0.5%蕃红水溶液、5%孔雀绿水溶液、黑墨素液、甲醇、苏丹黑、二甲苯3、仪器：接种环(×1)、酒精灯(×1)、载玻片(×5)、光学显微镜(×1)【四、操作步骤】1、革兰氏染色：涂片→固定→结晶紫→水洗→碘液→水洗→95%酒精→水洗→蕃红→水洗→干燥→镜检2、芽孢染色：涂片→固定→孔雀绿染色5min→水洗→蕃红→水洗→干燥→镜检3、荚膜染色法(选做)：涂片→干燥→石炭酸复红→水红→吸干→黑墨素→镜检4、伴胞晶体染色(选做)：涂片→固定→10%石炭酸复红→水洗→风干→镜检5、类脂染色(选做)：涂片→固定→苏丹黑染色10min→水洗→吸干→二甲苯冲洗→蕃红→水洗→晾干→镜检6、清理器皿、实验桌面。

微生物实验报告霉菌的培养及观察实验刘欣怡201100140057生物科学基地班组别：周一下午三组同组者：曹平平，周楠，刘艺，刘希伟实验完成时间：2012年11月12号一、实验原理1. 观察霉菌的菌落特征，学会霉菌的一般制作方法。

2. 观察并理解多种霉菌的个体形态及生长繁殖方式。

3. 进一步巩固无菌操作以及显微镜的使用二、实验器材1. 菌种：黑曲霉，毛霉，青霉，根霉的培养 7d 的马铃薯琼脂平板培养物（小室培养）。

2. 仪器：无菌操作台，分析天平，玻璃棒，三角瓶，小烧杯，加热炉，漏斗，纱布，培养皿，载玻片，盖玻片，U 型玻璃棒，解剖刀，镊子，接种环，移液管，酒精灯，火柴，显微镜等。

3. 试剂及培养基：马铃薯培养基（其配方见附录），蔗糖，琼脂，去离子水100，现配的20%甘油，酒精溶液等。

三、实验原理及方法1、霉菌霉菌的营养体是分枝的丝状体。

其个体比细菌和放线菌大得多，分为基内菌丝和气生菌丝。

气生菌丝生长到一定阶段又可分化出繁殖菌丝。

不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。

霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。

霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约为3-10μm）,常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。

霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液，用此染液做霉菌制片的特点是细胞不变形，具有杀菌、防腐作用，不易干燥，能保持较长时间，能防止孢子四处飞散，棉兰具有一定的染色作用，染液的蓝色能增大反差。

（如果用水封片，常因渗透作用而膨胀，水也易使菌丝、孢子和气泡混为一团，影响观察。

）霉菌菌落特征：A。

因霉菌的菌丝较粗且长，故形成的菌落较疏松，常成绒毛状、絮状、蜘蛛网状或毡毯状，一般比细菌和放线菌菌落大几倍到几十倍。

B。

在固体培养基上菌落最初往往是浅色或白色，当菌落上长出各种颜色的孢子后，由于孢子具有不同形状、构造和颜色，使菌落表面呈现肉眼可见的不同结构和色泽，如黄、绿、青、黑、橙等。

实验六微生物的生理生化反应1、实验目的探究菌株在碳源同化、氮源利用、乙醇发酵和抗生素效价分析等方面不同的生长特性，观察并简要分析不同微生物的生理生化特征及其形成机理。

2、实验过程简述2.1 培养基与试剂准备2.1.1碳源同化培养基准备碳源为葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、棉籽糖、蜜二糖、纤维二糖、海藻糖、松三糖、可溶性淀粉、α-甲基葡萄糖苷的YNB 培养基，放入一根杜氏管。

2.1.2氮源同化培养基准备氮源为硫酸铵，尿素，蛋白胨，硝酸钾，无氮源YNB 的固体、液体培养基。

2.1.3 乙醇发酵用种子培养基：YPD 培养基2.1.4乙醇发酵用发酵培养基葡萄糖，酵母粉，蛋白胨，尿素，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钙。

2.1.5抗生素效价测定用培养基：LB 培养基2.1.6青霉素：用pH 6.0 磷酸缓冲液配制，浓度为100 mg/ml，0.22μm 孔径过滤灭菌。

2.2 微生物的碳源同化和发酵1、从菌体斜面接一环菌于1 ml 无菌水中，室温静置2 h。

2、取200 μl 菌悬液，分别转接于含杜氏管的小试管中，静置培养48 h。

3、每24 h 观察记录生长和产气情况。

4、根据实验结果判断不同菌株对不同碳源的同化或发酵。

2.3 微生物的氮源利用1、从菌体斜面接一环菌于1 ml 无菌水中，室温静置2 h。

2、取200μl 菌悬液，分别转接于上述培养基小试管中，30℃或37℃静置培养48 h。

3、各取20μl 菌悬液，分别划线于不同氮源的固体平板上，待菌液被吸收后，培养皿倒置，静置培养48 h。

4、每24 h 观察记录生长情况，48 h 测定液体培养物的OD 600。

5、根据实验结果判断不同菌株对不同氮源的利用能力或偏好性。

2.4 酵母菌的乙醇发酵1、种子液培养：将酿酒酵母从菌种斜面上接一接种环至YPD 种子培养基中，30℃，200rpm，培养18 h。

2、乙醇发酵：按照10%（v/v）的比例将培养好的种子液接入100 ml 发酵培养基中，用无菌塑料布将封口密封，30℃，静置培养，每24 h 手摇1 次，发酵3-4 d。

实验六微生物的简单染色及革兰氏染色利用显微镜对微生物细胞形态、结构、大小和排列进行观察前，首先要将微生物样品置于载玻片上、染色，为观察到真实、完整的生物形态结构，根据不同微生物的特点采取不同的制片及染色方法。

微生物细胞个体微小且较透明，在光学显微镜下难以将其与背景区分开而看清。

所以，在利用光学显微镜对微生物进行观察前，需要利用染料对微生物进行染色，使着色细胞或结构与背景形成鲜明对比，以便更清晰地观察微生物细胞形态及结构特征。

微生物的另一个特点是种类繁多，不同微生物细胞结构各异，对各类细胞染料的结合能力不同，研究者必须根据所要观察的微生物特点及观察目标，选用适宜的染色技术。

（一）细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的制片和简单染色一、目的要求1.学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术。

2.初步了解细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态特征和相互区别。

3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。

二、基本原理对个体较小的细菌进行制片时采取涂片法，通过涂抹细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态。

利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。

用于染色的染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。

发色基团赋予染料颜色特征，而助色基团使染料能够形成盐。

不含有助色基团而仅具有发色基团的苯化合物（色原）即使具有颜色也不能用作染料，因为它不能电离，不能与酸或碱性成盐，难以与微生物细胞结合使其着色。

常用的微生物细胞颜料都是盐，分碱性染料和酸性染料，前者包括美蓝（亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）及孔雀绿等，后者包括碱性复红、伊红及刚果红等。

通常采用碱性染料进行染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中常带负电荷，而染料电力红染色部分带正电荷，很容与细胞结合使其着色；当细胞处于弱酸条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。

河流水样中微生物的梯度稀释涂布及培养1、实验目的1.1河流水样中微生物的梯度稀释涂布1.1.1掌握使用无菌操作技术1.1.2用稀释涂布平板法分离培养水样中的微生物1.2微生物细胞的显微计数1.2.1了解血细胞计数板的构造及原理1.2.2掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法2、实验原理2.1河流水样中微生物的梯度稀释培养2.1.1平板菌落计数法平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释，使其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落代表原样品中一个单细胞。

统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品含菌数。

3、实验仪器、试剂与菌种3.1河流水样中微生物的梯度稀释涂布3.1.1实验仪器10~100ul移液器及配套的移液枪头、1ml无菌EP管、250ml三角瓶、试管架即用于稀释的试管、培养皿、涂布器、酒精灯3.1.2试剂和菌种河流水样1瓶3.2微生物细胞的显微计数3.1.1实验仪器血细胞计数板、显微镜、1ml无菌EP管、100~1000ul移液器及配套的移液枪头、吸水滤纸3.1.2试剂和菌种Jurket细胞4、实验步骤4.1河流水样中微生物的梯度稀释涂布4.1．1把事先已经准备好的固体培养基在微波炉中中火加热溶解3min，待其冷却至60~70摄氏度，来超净工作台上无菌操作将培养基等量、均匀倒入已灭菌并干燥的4个培养皿中，轻轻摇动培养皿，使其布满平皿底，每个平皿装量25ml，厚度达3~4mm。

4.1.2在实验台上用1ml移液器移取已摇匀的河流水样0.5ml放入无菌EP管中，随后带入超净工作台。

4.1.3在超净工作台里用1ml移液器移取EP管中河流水样0.5ml注入无菌试管中（内含4.5ml无菌水），充分混合均匀（10-1浓度）。

4.1.4用1ml移液器移取0.5ml10-1浓度的水样稀释液，注入无菌试管中（内含4.5ml 无菌水），充分混合均匀，进行10-2梯度稀释；再用换了新的无菌吸头的移液器移取0.5ml10-2浓度的水样稀释液，注入无菌试管中（内含4.5ml无菌水），充分混合均匀，进行10-3梯度稀释；同样步骤重复，分别进行浓度梯度为10-4和10-5稀释。

实验六水中大肠菌群(Coliform group)细菌的检测一、实验目的1.采用多管发酵法，以最近似数的方式测定水中大肠菌群数。

2. 掌握微生物实验中无菌操作技术方法。

二、实验原理如果水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原苗污染而引起肠道传染病。

由于肠道病原菌在水中数量较少，故从水中特别是自来水中分离病原菌常常非常困难。

大肠菌群细菌是肠道好氧菌中最普遍和数量最多的一类细菌，所以常常将其作为粪便污染的指示菌。

即根据水中大肠菌群细菌的数目来判断水源是否受粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。

一般规定每1000ml自来水中大肠菌群细菌不得超过3个．大肠菌群细菌是指一类好氧或兼性厌氧，革兰氏阴性，无芽孢的杆菌，包括四种细菌：大肠埃希氏杆菌、枸椽酸盐杆菌、产气杆菌及副大肠杆菌。

它们有相似的生化反应，能发酵葡萄糖，产酸产气，但发酵乳糖的能力不同。

当将它们接种到含乳糖的远滕氏培养基上生长时，四种菌的反应不一样，大肠埃希氏杆菌的菌落呈紫红色带金属光泽；枸椽酸盐杆菌的菌落呈紫红或深红色；产气杆菌的菌落呈淡红色，中心色深；副大肠杆菌的菌落无色透明(因不利用乳糖所致)。

本试验采用多管发酵法，以最近似数的方式来记载，这一数字是根据概率公式来估算，有大于实际数字的倾向，在增加每种稀释度的试管重复数后，可减少偏差。

本法除了用于检测水样(淡水或海水)外，尚可用于泥浆、沉积物、污泥等的检测。

测定时先将这类固体或半固体样品预先称重，再加水稀释，可取50g 样品，置于盛有450ml灭菌磷酸盐缓冲液并装有玻璃珠、石英砂的锥形瓶中，振荡l~2min，便成10-1稀释，以用于检验。

三、实验材料1.培养基；1.1乳糖胆汁液体培养基：蛋白胨：20.0g， 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液：l ml，乳糖：5.0g，胆酸钠：5.0g将蛋白胨、乳糖、胆盐加热溶解于1000m1蒸馏水中，调pH值至7.2～7.4，加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液l ml，充分混匀，分装于有倒置杜汉氏小管的试管中，注意小管中不得有气泡，115ºC灭菌20min。