碱性磷酸酶-基因实验

常见的报告基因基因是生命的基本单位，它负责传递遗传信息并决定我们的遗传特征。

在基因研究中，科学家经常使用报告基因来研究基因在细胞中的表达和调控。

报告基因是一种易于检测和测量的基因，它可以通过特定的实验技术来标记和定量分析。

本文将介绍一些常见的报告基因及其在生物研究中的应用。

1. 绿色荧光蛋白（GFP）GFP是最著名和最常用的报告基因之一。

它是从水母中发现的一种蛋白质，具有绿色荧光特性。

通过将GFP基因与感兴趣的基因融合，科学家可以实时观察这些基因在细胞或生物体中的表达情况。

GFP的应用十分广泛。

在细胞生物学研究中，科学家可以利用GFP来标记和跟踪细胞的位置、形态变化和运动方式。

在生物医学研究中，GFP可用于追踪病菌在宿主中的定位和扩散情况。

此外，GFP还可以用于标记和追踪蛋白质在细胞中的定位和交互方式。

因其广泛应用和可靠性，GFP已成为许多研究领域的重要工具。

2. 荧光素酶（Luciferase）荧光素酶是一类产生荧光的酶，可以与荧光素底物反应产生可见光。

Luciferase基因被广泛用作报告基因，因其检测灵敏度高、快速和可定量的特点。

Luciferase的应用广泛用于研究基因转录、蛋白质互作和细胞信号传导等生物学过程。

通过将Luciferase基因与感兴趣的基因进行融合，科学家可以测量目标基因在细胞中的表达水平和动态变化。

此外，Luciferase还可以用于检测细胞凋亡、药物筛选和生物传感器等方面的研究。

3. β-半乳糖苷酶（β-Gal）β-半乳糖苷酶是一种常见的酶，它能够催化底物X-Gal的降解产生蓝色产物。

β-Gal基因常被用作报告基因来研究基因的表达和调控。

β-Gal的应用广泛用于研究基因在细胞和生物体中的表达模式。

通过将β-Gal基因与目标基因进行融合，科学家可以观察其在细胞中的表达情况。

此外，β-Gal也可用于检测基因转导效率、病毒感染和细胞分化等方面的研究。

4. 碱性磷酸酶（AP）碱性磷酸酶是一种在生物体中广泛存在的酶，它可以催化底物产生阳性的紫色沉淀物。

内蒙古大学生命科学学院生物系
基因工程实验室
本科基因工程实验论文开题报告
论文题目：碱性磷酸酶基因表达载体的
构建及在大肠杆菌中的表达
学生姓名：
年级：
专业：
指导教师：
二〇一三年八月十二日
二、实验方案
1．实验内容和实验目标，拟解决的关键问题：
实验内容：包括质粒提取、PCR扩增、转化大肠杆菌、凝胶回收、感受态制备、IPTG 诱导、SDS-PAGE鉴定等。

关键问题：IPTG诱导量及诱导时间的优化；
超声破碎的方案优化。

2. 实验思路、方法、技术路线、实验方案及可行性分析：
实验思路：依据技术路线完成试验。

实验方法：实验室常用技术。

技术路线：
实验方案：详细方案已于讲义给出。

可行性分析：实验室相关技术成熟，实验人员熟悉相关的实验内容以及方法，
实验的可行性很高。

注：本报告务必在实验开始前交实验室教师审查，审查合格后方可开始实验。

实验名称-碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验名称碱性磷酸酶的分离纯化、比活性测定与动力学分析实验日期2011年10月25号实验地点生化实验室合作者指导老师总分教师签名批改日期碱性磷酸酶（AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。

AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。

AKP最适ＰＨ范围为８.６－１０，动物中AKP主要存在于小肠粘膜、肾、骨骼、肝脏和胎盘等组织的细胞膜上。

血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。

AKP可从组织中分离纯化，也可以采用基因工程表达的方式获得：将碱性磷酸酶基因克隆到重组载体，转入宿主菌中进行重组表达，并从表达菌提取，并进行酶动力学分析。

一实验原理1、碱性磷酸酶的分离纯化AKP分离纯化的方法与一般蛋白质的分离纯化方法相似，常用中性盐盐析法、电泳法、色谱法、有机溶剂沉淀法等方法分离纯化。

有时需要多种方法配合使用，才能得到高纯度的酶蛋白。

本实验采用有机溶剂沉淀法从兔肝匀浆液中提取分离AKP。

正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有AKP的滤液，AKP能溶于终浓度为33%的丙酮或30%的乙醇中，而不溶于终浓度为50%的丙酮或60%的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的AKP。

2、碱性磷酸酶的比活性测定根据国际酶学委员会规定，酶的比活性用每毫克蛋白质具有的酶活性来表示，单位（U/mg •pr）来表示。

因此，测定样品的比活性必须测定：a每毫升样品中的蛋白质毫克数；b每毫升样品中的酶活性单位数。

酶的纯浓度越高酶的比活性也就越高。

本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。

酚在碱性条件下与4-氨基安替比作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比。

于510nm处比色，即可求出反应过程中产生的酚含量，而碱性磷酸酶的活性单位可定义为：在37摄氏度保温15min每产生1mg的酚为一个酶活性单位。

中国水产科学 2011年1月, 18(1): 208–213 Journal of Fishery Sciences of China研究简报收稿日期: 2010−01−28; 修订日期: 2010−03−15.基金项目: 国家自然科学基金项目(30271017); 国家教育部博士项目基金(20040264001). 作者简介: 田娟(1984–), 硕士, 研究方向为鱼类发育生物学. E-mail: tian_hjuan@ 通讯作者: 施志仪(1954–), 教授. Tel: 021-********; E-mail: zyshi@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2011.00208碱性磷酸酶在大菱鲆不同组织的表达及其与甲状腺激素的关系田娟, 施志仪上海海洋大学 生物技术研究中心,上海 201306摘要: 为了探讨碱性磷酸酶(ALP)基因在大菱鲆(Scophthatmus maximus )体内的表达情况及在细胞水平上三碘甲状腺原氨酸(T3)对碱性磷酸酶(ALP)基因表达量的影响, 利用荧光定量PCR 法检测了大菱鲆肠、肌肉、脾脏、心脏、鳃、肝脏、肾脏及脑8个不同组织中ALP mRNA 的表达情况, 并且用0 nmol/L 、50 nmol/L 、75 nmol/L 、100 nmol/L 、200 nmol/L 5个不同浓度的T3处理大菱鲆肾细胞(SMKC), 采用实时荧光定量PCR 法测定T3处理后细胞中ALP mRNA 的表达情况。

结果表明, ALP mRNA 在大菱鲆不同组织中的表达量各不相同, 具有组织特异性。

心脏组织中ALP mRNA 的表达量最高, 其次是肝脏组织中和鳃组织中, 肌肉组织中ALP mRNA 的表达量最少。

不同浓度T3处理后大菱鲆肾细胞后, 细胞中碱性磷酸酶基因的表达量存在明显的差异, ALP mRNA 的表达量随着T3浓度的增加有递增趋势。

结论认为, ALP 基因在大菱鲆成鱼8个不同组织中均有表达, 但其表达量却有明显的差异, 具有组织特异性。

小鼠alp的pcr序列PCR（聚合酶链反应）是一种用于扩增DNA片段的常用技术，在分子生物学研究中有广泛应用。

在这个任务中，我将介绍小鼠碱性磷酸酶（ALP）的PCR序列。

小鼠ALP是一种重要的酶，在细胞内起着关键的生物学功能。

为了研究ALP基因的表达或变异，我们可以使用PCR技术扩增与ALP基因相关的DNA片段。

首先，确定我们感兴趣的PCR目标片段是小鼠ALP的一部分。

我们需要根据ALP的基因序列设计一对引物，这对引物应该能特异性地结合于ALP的目标区域，并产生一个合适长度的PCR产物。

对于小鼠ALP，我们可以选择以下引物序列：引物1：5'-AGTCAGCTGAAGTCTGGGAG-3'引物2：5'-CTGCTTCCGAGACAGAGAGG-3'这对引物的序列是根据小鼠ALP基因的编码序列设计的，并且在目标区域上具有高度特异性。

接下来，我们可以使用PCR反应体系来扩增小鼠ALP的DNA片段。

一个典型的PCR反应体系包含以下组分：1. 模板DNA：从小鼠细胞提取的基因组DNA作为PCR的模板。

2. 引物：ALP特异性的引物1和引物2。

3. dNTPs：包含各种四个核苷酸的混合物。

4. 缓冲液：提供理想的pH条件和离子强度。

5. 酶：通常使用热稳定DNA聚合酶（如Taq聚合酶）。

6. 去离子水：作为反应体系的溶剂。

根据PCR仪器的建议和优化实验条件，我们可以进行PCR反应。

典型的PCR温度梯度如下：1. 反应前的预热：95°C，5分钟。

2. PCR循环：a. 95°C，30秒（变性，使模板DNA解链）。

b. 引物结合温度，例如60°C，30秒（引物与模板DNA结合）。

c. 延伸温度：72°C，30秒-1分钟（酶的最佳活性温度）。

3. 延伸结束后，进行最终延伸：72°C，5分钟（确保所有PCR产物完全延伸）。

4. 最后，将反应体系储存于4°C，或进行后续实验。

1.如何区分重组DNA和空载体自连：（一）检测方法（1）双抗性筛选：具有四环素和氨苄青霉素两种抗生素抗性基因作为选择标记，一种抗性标记用来正选择转化子，另一种通过插入失活而可以鉴定重组子。

Ori位于Amp+和tet+这两个基因之间，在四环素平板上出现的菌落一定是获得了质粒的转化子，在此基础上，如果四环素抗性转化子对氨苄青霉素敏感，则说明在载体中有外源片段的插入而使氨苄青霉素抗性失活，即重组子；若对氨苄青霉素有抗性，则此转化子的质粒是空载体。

（2)抗生素插入失活法：如BamHI可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，但仍能表达氨苄抗性基因，对四环素是敏感的。

筛选重组pBR322 按照以下方法进行，将转化细胞培养于氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是目的克隆。

（3）限制性内切酶法：外源片段通过特定的酶切位点插入到载体上，因此，可以通过这些限制性酶酶切重组质粒，电泳分析插入片段长度是否正确。

（抗生素+酶切检测+测序）（4）蓝白斑筛选：多克隆位点存在于编码β-半乳糖苷酶的N端的DNA序列中，与pUC载体一起使用的宿主菌携带编码β-半乳糖苷酶的C端序列的基因片段。

通过α互补机制，两个片段在体内相互弥补，产生一个有活性的β-半乳糖苷酶。

以X-gal作为指示剂。

若通过插入外源DNA到多克隆位点中而打断了β-半乳糖苷酶的部分基因，不能产生有活性的β-半乳糖苷酶，X-gal不会反应，重组子菌落为白色，而自连空载体转化的菌落则是蓝色的。

（5）PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通过PCR的方法进行鉴定（6）菌落原位杂交：把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，然后溶菌，变性并固定DNA，最后用标记的DNA或RNA探针进行杂交来检测这些被转移的菌落或噬菌斑。

（7）测序法：若通过前面这些方法鉴定之后还是有疑虑，不知道是否阳性者确为真阳性而不是空载体自连，可以将其送到生物公司进行测序以最终确定之。