013 霍乱弧菌检验标准操作规范

霍乱弧菌血清学检测标准操作规程
1．目的
规范霍乱弧菌的血清学检测标准操作规程。

2．原理
用已知的霍乱弧菌诊断血清在载玻片上直接与细菌培养物或菌悬液混合，若出现肉眼可见的特异性凝集块，表示该菌即为霍乱弧菌。

3．试剂
霍乱弧菌诊断血清，生理盐水。

4．质控
霍乱弧菌ATCC14035阳性；大肠埃希菌ATCC25922阴性。

5.操作步骤
5.1 先用接种环取1环生理盐水于玻片上，以接种针挑取少许菌落与盐水混匀，再取稀释血清1环与之混合，立即出现凝集者为阳性。

5.2 若有自凝现象改用生理盐水稀释的血清再做凝集。

与O1群霍乱弧菌血清凝集者即可定为霍乱弧菌，然后再进一步对霍乱弧菌分型。

6.结果判断
阴性：试验一侧及对照一侧均为混浊。

阳性：对照一侧均为混浊，试验一侧明显凝集。

自凝：试验一侧及对照一侧
凝集。

7.注意事项
试验时应同时用生理盐水作对照，以防止出现假阳性。

8.临床意义
主要用于霍乱弧菌的鉴定。

霍乱弧菌实验室检测SOP手册1.标本的采集和送检1.1.标本的采集：采集标本的好坏，对检验工作的质量影响很大。

为尽快获得细检查结果，应在发病早期、在服用抗菌药物之前尽快采集标本和及时送到检验室。

标本以病人大便为主。

采便方法用灭菌的棉拭采集排出的新鲜大便，亦可用直肠棉拭或用采便管由肛门插入3㎝～5㎝采集。

一般要求水样便采集1ml～3ml，固形便采取蚕豆大小粪量。

有时病人的呕吐物、沾染大便的衣物和尸体的肠内容物亦可作为检材。

带菌者的大便可用棉拭或直肠棉拭采取。

1.2.标本的送检：采取的标本应立即接种培养基，典型病人的水样便含有大量病菌（106/ml～109/ml），可直接做分离培养并同时增菌培养。

不需做直接分离的均可接种碱性蛋白胨水增菌。

并立即送检验室。

1.3.标本运送途中较远，也可将标本放入文腊氏保存液或卡里—布莱尔运送培养基。

标本与保存液的比例为8ml～10ml保存液加1ml～3ml水样便或蚕豆大的固形便。

也可用厚吸墨纸条吸饱水样便放入小塑料袋内封好送检。

送检标本时，必须认真填写送检单，标本必须妥善包装，专人送检，并防止污染，注意安全，送检箱用后要严密消毒。

2.检验方法2.1.培养方法2.1.1.增菌培养：所有标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗生素的病人标本，需增菌后再分离。

碱胨水接种后放37℃6～8小时，夏日可将运送时间计算在内。

保存液内的标本取1ml种入碱胨水中。

培养后慢慢地从碱胨水生长的菌膜下，取一接种环表层培养物接种于4号或庆大霉素琼脂平板。

标本含菌少时，可实行二次增菌。

取第一次碱胨水增菌后的表层液0.1～0.2ml，接种于另一碱胨水中，37℃6～8小时再做分离。

2.1.2.分离培养：急性典型病人标本在增菌的同时直接做分离培养，这样既可缩短检出的时间，还可避免标本中如有不凝集弧菌经增菌后大量繁殖，影响霍乱弧菌的分离。

其它标本均应增菌后再做分离培养。

当前的习惯多为碱性蛋白胨水增菌，再用强选择性培养基分离，37℃12～16小时长出的菌落，可供做玻片凝集用。

传染病相关知识培训—————霍乱诊断标准及处理原则主讲人：参会人员：会议地址：会议时间：会议内容：霍乱诊断标准及处理原则霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌引起的急性肠道传染病，是发病急、传播快、波及面广、危害严重的甲类传染病，也是当今三种国际检疫传染病中最严重的一种。

根据《中华人民共和国传染病防治法》和《中华人民共和国传染病防治法实施办法》的规定，制定本病的诊断标准及处理原则。

1 主题内容与适用范围：本标准规定了霍乱的诊断标准，对病人、疫点、疫区的处理原则等，并推荐了对霍乱的病原学检查、血清免疫学检查、霍乱弧菌的鉴定和分型方法以及对病人的补液疗法等。

本标准适用于全国各级卫生防疫、医疗保健机构对由01群和0139群霍乱弧菌引起的霍乱的诊断和处理。

2 诊断原则：根据夏秋季节霍乱流行期间的疫区内，凡有腹泻，伴有呕吐，从粪便或吐泻物检出01群或0139群霍乱弧菌或血清检查对01群或0139群霍乱弧菌的抗体有明显升高者予以诊断。

病人的临床症状可由轻度到重度不等。

3 诊断标准：3.1 疑似霍乱诊断标准：a.凡有典型临床症状，如剧烈腹泻，水样便（黄水样、清水样、米泔样或血水样），伴有呕吐，迅速出现严重脱水，循环衰竭及肌肉痉挛（特别是腓肠肌）的首发病例，在病原学检查尚未肯定前。

b.霍乱流行期间有明确接触史（如同餐、同住或护理者等），并发生泻吐症状，而无其他原因可查者。

具有上述项目之一者诊断为疑似霍乱。

3.2 确定诊断标准：a. 凡有腹泻症状，粪便培养01群或0139群霍乱弧菌阳性；b. 霍乱流行期间的疫区内，凡有霍乱典型症状（见3.1a），粪便培养01群和0139群霍乱弧菌阴性，但无其他原因可查者；c. 在流行期间的疫区内有腹泻症状，作双份血清抗体效价测定，如血清凝集试验呈4倍以上或杀弧菌抗体测定呈8倍以上增长者；d. 在疫源检查中，首次粪便培养检出01群或0139群霍乱弧菌前后各5天内有腹泻症状者。

临床诊断：具备b.确诊病例：具备a或c或d。

霍乱诊断标准及防疫措施霍乱就是由01群与0139群霍乱弧菌引起得急性肠道传染病就是发病急、传播快、波及面广、危害严重得甲类传染病。

１诊断原则根据夏秋季节霍乱流行期间得疫区内凡有腹泻伴有呕吐从粪便或吐泻物检出0１群或０13９群霍乱弧菌或血清检查对0１群或0139群霍乱弧菌得抗体有明显升高者予以诊断。

病人得临床症状可由轻度到重度不等。

2诊断标准2。

1疑似霍乱诊断标准a。

凡有典型临床症状如剧烈腹泻水样便(黄水样、清水样、米泔样或血水样)伴有呕吐迅速出现严重脱水循环衰竭及肌肉痉挛(特别就是腓肠肌)得首发病例在病原学检查尚未肯定前。

b.霍乱流行期间有明确接触史(如同餐、同住或护理者等)并发生泻吐症状而无其她原因可查者。

具有上述项目之一者诊断为疑似霍乱。

2。

2确定诊断标准ａ.凡有腹泻症状粪便培养01群或0１3９群霍乱弧菌阳性b。

霍乱流行期间得疫区内凡有霍乱典型症状(见3。

1a)粪便培养０１群与0139群霍乱弧菌阴性但无其她原因可查者ｃ.在流行期间得疫区内有腹泻症状作双份血清抗体效价测定如血清凝集试验呈4倍以上或杀弧菌抗体测定呈8倍以上增长者d.在疫源检查中首次粪便培养检出01群或0139群霍乱弧菌前后各5天内有腹泻症状者。

临床诊断具备b、确诊病例具备a或ｃ或d。

3临床分型标准３、1轻型仅有腹泻症状极少伴呕吐大便一天少于1０次大便性状为软便、稀便或黄水样便个别患者粪便带粘液或血皮肤弹性正常或略差大多数患者能照常进食及起床活动脉搏、血压、尿量均正常。

３.2中型腹泻次数一日1020次精神表现淡漠有音哑皮肤干而缺乏弹性眼窝下陷有肌肉痉挛,脉搏细速、血压(收缩压)儿童9、33kPa(７0ｍmHg)成人1２—9.33ｋPａ(90-70mmＨg)尿量每日400mL。

3。

3重型腹泻次数一日２0次以上极度烦躁甚至昏迷皮肤弹性消失眼窝深凹明显发绀严重肌肉痉挛脉搏微弱而速甚或无脉血压(收缩压)儿童６.67kPa(５０ｍmHg)成人9.33kＰａ(７0mmＨｇ)或测不到等循环衰竭得表现尿量每日5０mL或无尿,脱水程度儿童相当于体重1０以上成人8以上。

霍乱弧菌的检测霍乱弧菌相关知识：稻叶型（A、C）古典型小川型（A、B、C少量）O1群霍乱弧菌：彦岛型（A、B、C）稻叶型（A、C）艾尔托型小川型（A、B、C少量）彦岛型（A、B、C）实验室准备：1.培养基：碱性蛋白胨水、TCBS、4号或庆大霉素琼脂、营养平板、半固体菌种保存管。

2.试剂：拉丝实验用试剂（0.5%去氧胆酸钠水溶液）、氧化酶试剂（1%盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸对氨基四甲基苯胺水溶液。

3.诊断血清：O1群霍乱诊断血清、稻叶型霍乱血清、小川型霍乱血清、O139群霍乱血清。

4.快诊试剂：O1群霍乱胶体金标记快诊卡、O139群霍乱胶体金标记快诊卡。

霍乱弧菌检验流程图：标本37度6-8小时TCBS、4号或庆大霉素琼脂小时胶体金快诊卡/制动等试验血清学凝集试验氧化酶实验拉丝实验O/129敏感试验初步报告、菌种保存一、采样（一）水样便采取1-2毫升，成形便采取指甲大小的粪量。

病人呕吐物、沾染粪便的衣物、尸体的肠腔和口腔内容物亦可做为检材；（二）外坏境样本可采取病人的污染衣物、剩饭菜、可疑食品、抹布、污水、坑塘水、井水、公厕粪便、苍蝇等；（三）按1：10比例置入碱性蛋白胨水增菌液中，迅速送往实验室。

二、增菌、培养（一）所有粪便标本都应经过增菌，尤其是恢复期病人、带菌者或用过抗菌药物的病人标本含菌量少，单靠直接分离不易检出。

需经碱胨水37度增菌6-8小时后分离(夏日可将运送时间计算在内)；（二）标本含菌量少时，为提高检出率可实行2次增菌，取第一次碱胨水增菌后的培养物表层液0.1-0.2毫升，接种于8-10毫升的碱胨水中，37度培养6-8小时后再做分离。

（三）霍乱弧菌好氧，易形成菌膜，故在取出增菌管时动作要轻，接种环于菌膜下取一满环，划线接种于TCBS或4号琼脂平板37℃10~14h孵育培养。

三、快速诊断（一）、直接镜检：为争取最快速度作出诊断，采取病人“米泔水样”大便或呕吐物，悬滴法镜检（最好用暗视野），可见具有流星状动力的细菌。

霍乱诊断标准及处理原则霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌引起的急性肠道传染病，是发病急、传播快、波及面广、危害严重的甲类传染病，也是当今三种国际检疫传染病中最严重的一种。

根据《中华人民共和国传染病防治法》和《中华人民共和国传染病防治法实施办法》的规定，制定本病的诊断标准及处理原则。

1 主题内容与适用范围本标准规定了霍乱的诊断标准，对病人、疫点、疫区的处理原则等，并推荐了对霍乱的病原学检查、血清免疫学检查、霍乱弧菌的鉴定和分型方法以及对病人的补液疗法等。

本标准适用于全国各级卫生防疫、医疗保健机构对由01群和0139群霍乱弧菌引起的霍乱的诊断和处理。

2 诊断原则根据夏秋季节霍乱流行期间的疫区内，凡有腹泻，伴有呕吐，从粪便或吐泻物检出01群或0139群霍乱弧菌或血清检查对01群或0139群霍乱弧菌的抗体有明显升高者予以诊断。

病人的临床症状可由轻度到重度不等。

3 诊断标淮3.1 疑似霍乱诊断标准a．凡有典型临床症状，如剧烈腹泻，水样便(黄水样、清水样、米洲样或血水样，，伴有呕吐，迅速出现严重脱水，循环衰竭及肌肉痉挛(特别是排肠肌)的首发病例，在病原学检查尚未肯定前。

b．霍乱流行期间有明确接触史(如同餐、同住或护理者等)，并发生泻吐症状，而无其他原因可查者。

具有上述项目之一者诊断为疑似霍乱。

3.2 确定诊断标准a. 凡有腹泻症状，粪便培养01群或0139群霍乱弧菌阳性;b. 霍乱流行期间的疫区内，凡有霍乱典型症状(见)，粪便培养01群和0139群霍乱弧菌阴性，但无其他原因可查者;c. 在流行期间的疫区内有腹泻症状，作双份血清抗体效价测定，如血清凝集试验呈4倍以上或杀弧菌抗体测定呈8倍以上增长者;d. 在疫源检查中，首次粪便培养检出01群或0139群霍乱弧菌前后各5天内有腹泻症状者。

临床诊断:具备b。

确诊病例:具备a或c或d。

4 临床分型标准4.1 轻型仅有腹泻症状，极少伴呕吐。

大便一天少于10次，大便性状为软便、稀便或黄水样便，个别患者粪便带粘液或血，皮肤弹性正常或略差，大多数患者能照常进食及起床活动，脉搏、血压、尿量均正常。

霍乱弧菌检测的快速方法霍乱是由霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病, 发病急、来势凶猛、传播快是该病的特点, 因而及早培养鉴定出霍乱弧菌对控制该病的流行和治疗有极其重要的意义。

本文作者在1995年9 月～ 2000 年9 月期间, 对我科1 256 例急性腹泻患者粪便和呕吐物培养霍乱弧菌的方法进行改进, 大大缩短了阳性结果的报出时间, 现总结如下。

1 材料与方法1.1材料1.1.1 标本来源1995 年9 月～ 2000 年9 月本院门诊及住院急性腹泻患者新鲜粪便样本1 042 份, 呕吐物214 份。

1.1.2 试剂所用培养基均购自杭州天和微生物制品厂, 霍乱弧菌单克隆抗体购自卫生部兰州生物制品研究所。

1.2 方法用灭菌毛细吸管吸取1m l 患者米汤样粪便或直接将采便管棉拭子接种于10m l 1% 硷性蛋白胨水中, 置37℃培养箱作增菌培养。

快速方法为增菌2 小时后取表面生长物或菌膜转种普通琼脂平板, 6 小时后即可挑取可疑菌落进行鉴定。

另一方法为按常规方法增菌6～ 9 小时后转种于庆大霉素琼脂平板,均按《全国临床检验操作规程》进行鉴定。

2 结果应用快速方法在10 小时内可报出阳性结果, 常规方法则20 小时报出阳性结果。

1 256 份标本中, 共检出15 例霍乱弧菌,均为小川型, 两种方法的阳性率均为1119% (15ö1 256) , 符合率100%。

3 讨论霍乱是我国法定的甲类传染病, 国家要求在接诊24 小时内报出检验结果。

本文在急性腹泻患者粪便霍乱弧菌培养方面采用缩短增菌时间和转种普通琼脂平板的方法, 从传统的增菌6～ 9 小时再转种选择性培养基改为增菌2 小时后开始转种普通琼脂平板, 能使阳性结果在10 小时内发出报告, 比常规方法快10 小时, 对霍乱的诊断治疗均有重要的意义。

增菌2 小时即可转种是由于: (1) 霍乱患者急性期粪便和呕吐物中含有大量的堆乱弧菌, 增菌 2 小时后霍乱弧菌已被增殖数十倍, 此菌数已足以转种。

霍乱诊断标准及处理原则公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]霍乱诊断标准及防疫措施霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌引起的急性肠道传染病是发病急、传播快、波及面广、危害严重的甲类传染病。

1诊断原则根据夏秋季节霍乱流行期间的疫区内凡有腹泻伴有呕吐从粪便或吐泻物检出01群或0139群霍乱弧菌或血清检查对01群或0139群霍乱弧菌的抗体有明显升高者予以诊断。

病人的临床症状可由轻度到重度不等。

2诊断标准疑似霍乱诊断标准a.凡有典型临床症状如剧烈腹泻水样便(黄水样、清水样、米泔样或血水样)伴有呕吐迅速出现严重脱水循环衰竭及肌肉痉挛(特别是腓肠肌)的首发病例在病原学检查尚未肯定前。

b.霍乱流行期间有明确接触史(如同餐、同住或护理者等)并发生泻吐症状而无其他原因可查者。

具有上述项目之一者诊断为疑似霍乱。

确定诊断标准a.凡有腹泻症状粪便培养01群或0139群霍乱弧菌阳性b.霍乱流行期间的疫区内凡有霍乱典型症状(见粪便培养01群和0139群霍乱弧菌阴性但无其他原因可查者c.在流行期间的疫区内有腹泻症状作双份血清抗体效价测定如血清凝集试验呈4倍以上或杀弧菌抗体测定呈8倍以上增长者d.在疫源检查中首次粪便培养检出01群或0139群霍乱弧菌前后各5天内有腹泻症状者。

临床诊断具备b。

确诊病例具备a或c或d。

3临床分型标准轻型仅有腹泻症状极少伴呕吐大便一天少于10次大便性状为软便、稀便或黄水样便个别患者粪便带粘液或血皮肤弹性正常或略差大多数患者能照常进食及起床活动脉搏、血压、尿量均正常。

中型腹泻次数一日1020次精神表现淡漠有音哑皮肤干而缺乏弹性眼窝下陷有肌肉痉挛,脉搏细速、血压(收缩压)儿童(70mmHg)成人(90-70mmHg)尿量每日400mL。

重型腹泻次数一日20次以上极度烦躁甚至昏迷皮肤弹性消失眼窝深凹明显发绀严重肌肉痉挛脉搏微弱而速甚或无脉血压(收缩压)儿童(50mmHg)成人(70mmHg)或测不到等循环衰竭的表现尿量每日50mL或无尿，脱水程度儿童相当于体重10以上成人8以上。

附件2：水系霍乱弧菌监测点监测技术规范一、采样与送检技术规范1、水体：水体的采样一般要求用灭菌的500ml水样瓶采集相对静止的表层水（30cm以内）500ml，加盖密封后在室温（20—25℃）下送实验室检测。

取水点的选择应结合流行病学调查等资料确定，同时，采样时应选择在水流平稳或静止处吸取。

非疫情状态下的监测采样时间一般在清晨时，此时水体未受人群活动等因素影响。

每个采样点中采样位置应相距数米、采集不少于2瓶作为平行检测。

采样时立即测定采集样品的温度、PH，并记录当天的最高温度和最低温度，数据始终随每份样品的检测报告逐级上报。

2、水产品：水生动物的采样通常选取活的新鲜的水生动物为采集对象，有时也应考虑冰冻的水生动物，以无菌操作采集合适的部位，如腮部和/或肠内容物等，置采样瓶（管）或食品采样袋密封，在常温下送检。

有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室在进行相关处置。

同时，要求以无菌棉签涂抹五只（条）以上的某类水生动物体表、腮及/或肛门，置碱性蛋白胨水送检，每管碱性蛋白胨水作一份样品看待。

3、样品的送检：统一要求在样品采集后，按生物安全规范，在室温条件下3小时内送递实验室开展霍乱弧菌的分离培养。

在北方地区冬季采样时，应注意样品的保温，防治结冰。

二、水体和水产品样本霍乱弧菌分离培养技术规范（一）培养基要求：以碱性蛋白胨水（ph8.6）作为增菌液；强选择性分离培养基使用庆大霉素培养基或TCBS培养基；弱选择性培养基统一使用碱性琼脂。

每批培养基在使用前必须进行质量检测。

（二）水体样本的增菌：增菌培养方法规定采样一下两种之一。

1、十倍浓缩碱胨水增菌培养法:详见《霍乱防治手册》（第五版）第75页。

2、滤膜富集增菌培养法：以0.45微米滤膜，使用Millipore真空过滤系统进行细菌富集，富集后的滤膜置含有终浓度为1/20万亚硒酸钾的10ml碱性蛋白胨三角瓶内增菌。

3、水产品样品增菌：使用无菌棉签涂抹的样品，直接接种到碱性蛋白胨水作为增菌液处理。