生化实验2_电泳共28页文档

实验二Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白一、背景印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。

1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern blotting。

之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授又发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blotting相似，故命名为Northern blotting。

George Stark这位教授在两年后又开发出类似的蛋白质检测方法。

1981年，在Neal Burnette所著的Analytical Biochemistry中，首次将单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western blotting。

此后开发的Eastern blotting是Western blotting的变形，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern blotting。

30多年来，Western blotting 技术已成为蛋白质研究中最常用的工具，用于鉴定目的蛋白是否存在（定性），目的蛋白质的表达量和不同样品之间的表达差异性（定量）。

pET系统是在大肠杆菌（Escherichia coli）中克隆表达目的基因、产生重组蛋白的经典表达系统。

目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。

T7 RNA 聚合酶被充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。

目的蛋白可用于进一步的SDS-PAGE分析、Western blotting检测或亲和层析分离纯化。

二、实验目的利用Western Blotting技术，定性检测苦荞二氢黄酮醇4-还原酶基因（FtDFR）在BL(DE3)中的诱导表达。

双向电泳实验双向电泳实验过程及相关溶液配置（经典）双向电泳实验双向电泳实验过程及相关溶液配置(经典)3.2点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul,按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline DryStrip gels(18cm，pH 3-10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品双向电泳实验过程及相关溶液配置A.实验过程一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息二、实验步骤：1.样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白：100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时其中每隔10~15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，-80oC保存2.Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul,5ul,10ul,15ul,20ul的BSA溶解液，另2管中分别加入2ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul)，然后，各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用)，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值(测量过程要在一个小时内完成)例如：编号蛋白量(ul)Buffer(ul)Bradford(ml)OD595值1 080 40 25 75 40.024 310 70 40.061 415 65 40.091 520 60 40.116 Bt4 278 40.079 Bt4 476 4转Bt4 278 40.075转Bt4 476 4标准曲线方程式：Y=aX b.其中Y为OD值，X为蛋白含量a、b 通过作图输入数据可知相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得OD值测量过程：比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值3.双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1水化液的制备称取2.0mg的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05%的溴酚兰，3.5ul(0.5%v/v)IPG buffer(pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min除杂质，取上清在含300ug蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定(跑胶温度为20oC)S1(30v,12hr,360vhs,step)S2(500v,1hr,500vhs,step)S3(1000v,1hr,1000vhs,step)S4(8000v,0.5hr,2250vhs,Grad)S5(8000v,5hr,40000vhs,step)共计44110vhs,19.5小时其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦3.4平衡用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上吸干(胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去)，再以超纯水冲洗，滤纸吸。

电泳实验报告电泳是一种常见的生物分析技术，通过电场的作用将带电粒子在凝胶或溶液中移动，从而实现分离与检测的目的。

本次实验旨在通过蛋白质电泳分析样本中蛋白质的分布情况和相对含量。

以下将从实验原理、实验过程和结果讨论等方面进行说明。

实验原理电泳的基本原理是带电粒子在电场作用下受力并进行移动。

在本实验中，我们使用了聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，并将电场施加在凝胶上，使得带电的蛋白质在凝胶孔隙中移动。

蛋白质根据其大小和电荷性质，在电场作用下移动的距离和速率不同，从而实现分离。

实验过程首先，我们制备了聚丙烯酰胺凝胶。

将聚丙烯酰胺粉末溶解在缓冲液中，然后加入过氧化铵等试剂混合均匀，在模具中固化。

接着，将样本与电泳缓冲液混合，并加载到凝胶孔洞中。

将电泳仪连接到电源上，并设置所需的电压和电流参数。

开启电源后，等待一段时间，直到电泳进行结束。

最后，取出凝胶，进行染色以观察分离效果。

实验结果与讨论经过电泳分离后，观察到凝胶上出现了一系列不同距离的蛋白质带。

这些带的位置和宽度表明了蛋白质的分子量和电荷性质。

分析不同带的迁移距离和相对含量可以得出蛋白质样本的组成和纯度信息。

首先，我们通过与已知分子量的标准品进行比对，确定了不同蛋白质的分子量。

根据标准品带的位置和已知分子量的对应关系，我们能够推断出样本中蛋白质的大致分子量范围。

这对于进一步研究蛋白质的结构与功能有着重要意义。

其次，观察带的宽度可以得知蛋白质的电荷性质。

在电泳过程中，蛋白质分子受到缓冲液中离子的影响，会发生电荷遮盖现象，使得蛋白质的分离效果减弱。

当蛋白质具有多种电荷状态时，其带的宽度可能会增加，提示样本中存在多种同种蛋白质的变异形式。

最后，通过比较不同带的相对含量，可以推断出蛋白质样本的组成情况。

通过定量分析电泳带的强度或使用显色剂染色，我们可以得出不同蛋白质在样本中的相对丰度，从而评估样本的纯度和组分分布。

总结与展望通过电泳实验，我们成功地分析了样本中不同蛋白质的分子量、电荷性质和相对含量。

生化实验报告电泳生化实验报告：电泳引言：生化实验是生物科学领域中重要的研究方法之一，其中电泳是一种常用的技术手段。

电泳通过电场的作用将带电的生物大分子（如DNA、蛋白质等）在凝胶或液体介质中进行分离和分析。

本报告将介绍电泳的原理、分类和应用，并结合实验结果进行讨论。

一、电泳原理电泳是利用电场对带电粒子进行分离的技术。

在电泳过程中，带电粒子会受到电场力的作用，从而在凝胶或液体介质中移动。

电泳的原理可以归纳为两个关键因素：电场力和摩擦力。

1.1 电场力电场力是电泳中最主要的驱动力之一。

当电场施加在带电粒子上时，粒子会受到电场力的作用而移动。

电场力的大小与电荷量和电场强度成正比，与粒子的大小和形状无关。

电泳中通常使用直流电场，以确保粒子在凝胶或液体介质中的移动方向一致。

1.2 摩擦力摩擦力是电泳中的阻力因素，它与带电粒子在介质中的移动速度成正比。

摩擦力的大小与粒子的大小和形状有关，较大的粒子会受到更大的摩擦力。

凝胶或液体介质的性质也会影响摩擦力的大小。

二、电泳分类根据不同的分离目标和实验条件，电泳可以分为几种不同的分类。

2.1 凝胶电泳凝胶电泳是最常见的电泳方法之一，通常用于分离DNA和蛋白质等生物大分子。

凝胶电泳中，凝胶作为介质，通过调节凝胶的浓度和孔隙大小，可以实现不同大小的分子的分离。

常见的凝胶电泳包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2.2 毛细管电泳毛细管电泳是利用毛细管作为分离通道的电泳方法。

毛细管具有极小的内径和高表面积，可以实现高效的分离。

毛细管电泳常用于分离离子和小分子化合物，如氨基酸、核苷酸等。

2.3 聚合物链反应（PCR）电泳PCR电泳是一种结合了聚合物链反应和凝胶电泳的技术。

PCR电泳用于检测和分离DNA片段，广泛应用于基因检测和疾病诊断等领域。

三、电泳应用电泳作为一种重要的生化实验技术，广泛应用于科学研究和生物医学领域。

3.1 DNA分析电泳在DNA分析中起着关键作用。

通过凝胶电泳，可以将DNA片段按照大小进行分离，从而确定DNA的长度和形态。

一、实验目的1. 了解电泳的基本原理和操作方法；2. 掌握电泳在生物化学研究中的应用；3. 通过实验，加深对电泳技术的理解。

二、实验原理电泳是一种利用电场作用使带电粒子在介质中移动的技术。

根据带电粒子在电场中的移动速度和方向，可以将它们分离。

电泳技术广泛应用于蛋白质、核酸、氨基酸等生物大分子的分离和鉴定。

三、实验材料与仪器1. 试剂：- 丙烯酰胺：10 g；- 甲叉双丙烯酰胺：0.5 g；- 尿素：8 g；- Tris（三羟甲基氨基甲烷）：0.75 g；- 10% SDS（十二烷基硫酸钠）溶液；- 5×上样缓冲液；- 水合氯醛（HCl）溶液；- 0.5% 溴酚蓝溶液；- 1×电泳缓冲液。

2. 仪器：- 电泳仪；- 紫外分光光度计；- 移液器；- 恒温水浴锅；- 凝胶成像仪；- 0.8% 聚丙烯酰胺凝胶板；- 点样梳子；- 电泳槽；- 直流电源。

四、实验步骤1. 准备聚丙烯酰胺凝胶：将丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、尿素、Tris和1×电泳缓冲液按比例混合，加入适量的水，搅拌均匀后，用紫外分光光度计检测溶液的浓度，确保溶液浓度为10 g/L。

2. 制备凝胶板：将制备好的聚丙烯酰胺凝胶溶液倒入凝胶板模具中，插入点样梳子，在室温下静置2小时，使凝胶凝固。

3. 制备样品：取适量蛋白质样品，加入10% SDS溶液和5×上样缓冲液，混匀后煮沸5分钟，使蛋白质变性。

4. 加样：将样品加入凝胶板上的孔中，用移液器小心滴加，避免样品溢出。

5. 电泳：将凝胶板放入电泳槽中，加入1×电泳缓冲液，连接电源，设置电流为100 mA，电压为100 V，电泳时间为2小时。

6. 染色：电泳结束后，取出凝胶板，用0.5% 溴酚蓝溶液染色30分钟。

7. 成像：将染色后的凝胶板放入凝胶成像仪中，拍照记录电泳结果。

五、实验结果与分析通过电泳实验，成功分离了蛋白质样品。

根据电泳结果，可以分析蛋白质的分子量、纯度等信息。

实验报告 2 SDS聚- 丙烯酰胺凝胶电泳法实验二SDS聚- 丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAG）E测定蛋白质的分子量1 原理1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理1.1.1 性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH 和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。

通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。

由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。

1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。

聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。

本实验是用化学聚合。

化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有效的加速剂是N,N,N',N' -四甲基乙二胺（TEMED）。

在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。

叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH 时，常会延长聚合时间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可以使聚合速度变慢。

通常控制这些因素使聚合在 1 小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。

1.1.3 凝胶浓度和交联度与孔径的关系凝胶浓度根据被分离的物质的分子量大小确定。

当分析一个未知样品时，常先用7.5%的标准凝胶或用4~10%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶浓度。

凝胶的机械性能、弹性是否适中很重要，胶太软易断裂，；太硬则脆，也易折断。

1.2 SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于所带净电荷及分子的大小和形状等因素。

如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS和巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。

在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。