生化分析实验-圆盘电泳

实验七聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质一实验目的掌握聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质。

二实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰化胺凝胶作支持物的一种区带电泳，由于此种凝胶具有分子筛的性质，所以本法对样品的分离作用，不全决定于样品各组分所带净电荷的多少，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度的作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。

聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构，很少带有离子的侧基，惰性好，电泳时，电渗作用小，几乎无吸附作用，对热稳定，呈透明状，易于观察结果。

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰化胺基侧链的脂肪族大分子化合物。

三实验器材1、血清及其他蛋白质样品。

2、移液器。

3、稳压直流电源（500V）。

4、玻璃管0 .5cm×7-10cm(×10)。

5、灯泡瓶。

6、注射器10ml(×1)。

7、滴管。

8、培养皿10cm(×5)。

9、圆盘电泳槽。

10、量瓶25ml（×1）、10ml（×1）。

四实验试剂1、1mol/LHCL。

2、丙烯酰胺（Acr）：3、N，N，N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED):密封避光保存.可用N-二甲氨基丙腈或三乙醇胺代替,但效果较差.4、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis):5、三羧甲基氨基甲烷(简称Tris).6、过硫酸铵(A.R)(聚合用催化剂)7、0.05％氨基黑10B溶液:称取50mg溶于100ml水中.8、冰醋酸.9、0.05％溴酚蓝溶液:称取50mg溴酚蓝加水溶解并定容到100ml10、40％蔗糖。

11、20％蔗糖-溴酚蓝溶液：100ml20％蔗糖溶液加50mg溴酚蓝12、甘氨酸-Tris 缓冲液：称取甘氨酸28.8mg，Tris 0.6g加水定容至1000ml （pH8.3）13、1％考马斯亮蓝G250。

聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质(核黄素-TEMED聚合系统)-1一、目的：1．学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

2．掌握聚丙烯酰胺园盘电泳的操作技术。

3．比较醋酸纤维薄膜电泳与本法分离血清蛋白质的效果。

二、原理：（一）盘状电泳原理盘状电泳是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2厘米），然后再进行电泳分离。

盘状电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质不连续性（discontinuity），凑巧分离出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”及“圆盘状”的英文字头“disc”。

因此，英文名称为disc electrophoresis，中文直译为盘状电泳。

仪器装置：（见图15-1）。

上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液。

上下槽的缓冲液中分别有正、负电极通入。

上槽底部有很多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃管。

这里仅以Davis和Orstein（1964）用分析血清蛋白的高pH的不连续系统为便说明其基本原理。

此系统是一个高pH的碱性系统，或称阴离子系统，最初用于分析血清蛋白，但也适用于其他的酸性和中性蛋白。

很多细胞蛋白质，或病毒的结构蛋白在此系统中（pH8—9）解离成阴离子，向阳极移动。

系统由下列三种不连续的凝胶组成。

即在每支玻璃管中装有三层不同的凝胶（见图15-2）。

最上层为样品胶，中层为浓缩胶（又称间隔胶或积层胶），下层为分离胶（又称电泳胶）。

在盘状电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。

由于这三种物理效应,使样品分离效果好，分辨率高。

例如人血清用纸电泳(PH8.6)可以分成5—7个成分，而用盘状电泳也可分成20—30个条带清晰的成分（参看图15-3）。

聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质【目的】1 ．掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。

2 ．熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。

在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。

聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂过硫酸铵（ Ap ）和加速剂四甲基乙二胺（ TEMED ）的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。

聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。

根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 ％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。

不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质（见第 2 篇第 1 章），使样品分离效果好，分辨率较高。

一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ～ 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来（图 3-4 ），是目前较好的支持介质，应用十分广泛。

图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原理相同。

本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩（浓缩效应）成厚度为 10 -2 cm 的起始区带，然后再利用分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中进行电泳分离。

【器材】1 ．电泳仪直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 50mA 。

2 ．垂直管型圆盘电泳装置目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。

这类装置均由两个基本的部分组成，一部分为载胶玻璃管，须选用内径均匀（ 5 ～ 6mm ） , 外径 7 ～ 8mm ，长 80 ～ 100mm 的玻璃管作为材料，也可以使用更细的玻璃管。

生化实验报告电泳生化实验报告：电泳引言：生化实验是生物科学领域中重要的研究方法之一，其中电泳是一种常用的技术手段。

电泳通过电场的作用将带电的生物大分子（如DNA、蛋白质等）在凝胶或液体介质中进行分离和分析。

本报告将介绍电泳的原理、分类和应用，并结合实验结果进行讨论。

一、电泳原理电泳是利用电场对带电粒子进行分离的技术。

在电泳过程中，带电粒子会受到电场力的作用，从而在凝胶或液体介质中移动。

电泳的原理可以归纳为两个关键因素：电场力和摩擦力。

1.1 电场力电场力是电泳中最主要的驱动力之一。

当电场施加在带电粒子上时，粒子会受到电场力的作用而移动。

电场力的大小与电荷量和电场强度成正比，与粒子的大小和形状无关。

电泳中通常使用直流电场，以确保粒子在凝胶或液体介质中的移动方向一致。

1.2 摩擦力摩擦力是电泳中的阻力因素，它与带电粒子在介质中的移动速度成正比。

摩擦力的大小与粒子的大小和形状有关，较大的粒子会受到更大的摩擦力。

凝胶或液体介质的性质也会影响摩擦力的大小。

二、电泳分类根据不同的分离目标和实验条件，电泳可以分为几种不同的分类。

2.1 凝胶电泳凝胶电泳是最常见的电泳方法之一，通常用于分离DNA和蛋白质等生物大分子。

凝胶电泳中，凝胶作为介质，通过调节凝胶的浓度和孔隙大小，可以实现不同大小的分子的分离。

常见的凝胶电泳包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2.2 毛细管电泳毛细管电泳是利用毛细管作为分离通道的电泳方法。

毛细管具有极小的内径和高表面积，可以实现高效的分离。

毛细管电泳常用于分离离子和小分子化合物，如氨基酸、核苷酸等。

2.3 聚合物链反应（PCR）电泳PCR电泳是一种结合了聚合物链反应和凝胶电泳的技术。

PCR电泳用于检测和分离DNA片段，广泛应用于基因检测和疾病诊断等领域。

三、电泳应用电泳作为一种重要的生化实验技术，广泛应用于科学研究和生物医学领域。

3.1 DNA分析电泳在DNA分析中起着关键作用。

通过凝胶电泳，可以将DNA片段按照大小进行分离，从而确定DNA的长度和形态。

实验聚丙烯酰胺凝胶圆盘状电泳法分离血清蛋白Poly-acrylamide Gel electrophoresis(PAGE)聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，透明且有弹性，化学性质比较稳定，受PH和温度的变化影响较小，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，几乎不产生吸附和电渗作用。

在制备凝胶时通过改变单体浓度和交联度，可以根据实验目的及样品分子特性,随意控制凝胶孔径大小，且制备的凝胶重复性好。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(Poly-acrylamide Gel electrophoresis, 简称PAGE)常用于蛋白质的分离鉴定，也可用于分离小分子核酸或核酸片段。

此外，由于聚丙烯酰胺凝胶纯度高及不溶性，不致污染样品，该法还适用于少量样品的制备。

本实验通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白,掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和操作技术。

一、[实验原理]聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（acrylamide ,简称Arc）和交联剂甲叉双丙烯酰胺(N,N＇-methylene bisacrylamide,简称Bis)在催化系统的作用下,聚合而成的具有三维网状立体结构的大分子物质。

本实验以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂，过硫酸胺(AP)为引发剂。

O —CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2—CH2=CH—C C=O CONH2NH NHCH2=CH—CONH2+ CH2CH2NH NHCH2=CH—C C=O CONH2O —CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2—丙烯酰胺N,N’-甲叉（亚甲基）双丙烯酰胺聚丙烯酰胺一般情况下，凝胶的浓度大或交联度大，蛋白质迁移的速度慢，电泳时间长，反之迁移速度快，电泳时间短。

通常凝胶的筛孔透明度和弹性是随着凝胶浓度的增加而降低的，而机械强度却随着凝胶浓度的增加而增加。

聚丙烯胺凝胶电泳所以能把一个蛋白质混合物分离开来 , 除决定于被分离分子的大小和形状外 , 还决定于分子所带的电荷等因素本实验采用电泳基质的不连续体系，这种不连续的PAGE在电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应；②凝胶的分子筛效应；③一般电泳分离的电荷效应。

圆盘电泳操作步骤1、制胶: ①将0.2ml 50％甘油加入橡皮帽中，再将橡皮帽套在小玻璃管下端。

②8%聚丙酰胺凝胶（PH 8.9, 分离胶）2013年下半年配方（成功）混匀后将此胶液加到各个小玻璃管中，使胶高6~7cm 。

用注射器加上一薄层水（0.3~0.5cm 高，约0.2ml ）覆盖，勿搅动胶面，放置20~30min, 观察现象（刚加水时看出有界面，后逐渐消失，等一定时间后又再出现界面，表明凝胶已聚合），记录聚合时间（TEMED 加量大，则聚合快，控制聚合时间在25~40min ，注意不能漏胶，否则重做）③浓缩胶（PH6.7）的配制混匀，从分离胶胶面上移去覆盖水后，速将浓缩胶加到分离胶上面，使胶高约0.5~1cm, 再小心加一层覆盖水（与上同），在阳光或日光灯下放置20~40min, 使聚胶作用完成，最后移去覆盖水。

２、安装凝胶玻璃管: 将小玻璃管一一安装在电泳仪上，注意垂直并应紧密，防止上槽的缓冲液漏下，向上下槽倒入电极缓冲液，缓冲液应淹没玻管上下端。

3、加样: 血清样品配制：取20ul 血清，加5ul 5x buffer ，混匀，点样时每管加入混合液25ul 。

4、电泳: 上槽连接负极，下槽连接正极，然后通电。

调完电流，前一分钟以每管1~2mA （为了平衡），以后以每管3~5mA 条件下电泳，直到溴酚蓝指示剂接近凝胶底部为止，断电（此过程约需２小时）。

5、剥胶: 将凝胶玻璃管从电泳槽上取下，用一支长针头注射器灌满水，将针头从浓缩胶一端小心地插入到管壁与凝胶之间，转动玻璃管，同时推动注射器，使针头在管壁与凝胶之间前进并注入蒸馏水，使胶条脱出（可用注射器吹）６、固定: 将剥出的胶条用7%乙酸固定20min.７、染色: 将固定后的胶条用染色液染色5~10min(10~20min)。

８、脱色: 将染色后的凝胶用水冲去表面的染料，然后放在洗脱液中冲洗，每30min 换一次洗脱液，直到近无色为止，约需１天。

实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理一聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE），由称盘状电泳。

这种电泳是在区带电泳的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2cm），然后再进行电泳分离。

圆盘电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质的不连续性（discontinuity），凑巧在垂直柱形凝胶上分散出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”和“圆盘状”的英文字头“disc”。

因此英文名称为“disc electrophoresis”，中文直译为盘状电泳。

仪器装置：如图A所示，上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液（图中曲线表示缓冲液面）。

上下槽的缓冲液分别有正负电极通入。

下槽外壳在必要时可通入冷水促使降温，水流方向用箭头表示。

上槽底部有许多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺的玻璃管。

图A在圆盘电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。

由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。

下面就圆盘电泳过程中的三种物理效应的原理加以说明：1. 样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。

（1）凝胶层的不连续性：浓缩胶：为大孔凝胶，有防止对流的作用。

分离胶：为小孔凝胶，也有防止对流的作用。

样品在其中进行电泳和分子筛分离。

蛋白质在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。

进入小孔凝胶时遇到的阻力大，速度就减慢了。

由于凝胶的不连续性，在大孔胶与小孔胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。

（2）缓冲离子成分的不连续性。

(3)电位梯度的不连续性。

(4)pH的不连续性：在浓缩胶和分离胶之间有pH的不连续性，浓缩胶应有的pH应为8.3，分离胶应有的pH为8.9。