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基因治疗中的表达载体构建与优化方法基因治疗是一种新兴的治疗方法，通过将修饰过的基因导入患者体内，以实现对疾病基因的修复或替代。
在基因治疗中，表达载体的构建和优化是关键的一步，它决定了基因在患者体内的表达效率和稳定性。
本文将介绍基因治疗中常用的表达载体构建与优化方法。
表达载体是将目标基因导入细胞内进行表达的工具。
常见的表达载体主要包括质粒和病毒载体。
质粒是一种双链DNA分子，它可以自主复制和表达携带的基因。
病毒载体是一种利用病毒基因表达机制的表达工具，常见的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和腱病毒等。
表达载体的选择应根据具体的治疗目标、基因大小和细胞类型等因素进行考虑。
表达载体的构建是基因治疗中的关键一步。
首先，需要将目标基因克隆到合适的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后利用限制性内切酶进行酶切，并将目标基因与表达载体连接。
常用的连接方法有限制性内切酶切和连接、PCR聚合、Ligase连接等。
连接完成后，需要进行质粒或病毒载体的复制，以获得足够多的表达载体。
表达载体的优化是为了提高基因在患者体内的表达效率和稳定性。
优化的方法有很多种，下面将介绍几种常见的方法。
首先，可以通过调整启动子和增强子的选择来提高基因表达效率。
启动子是调控基因转录的序列，它的选择可以影响基因的表达水平。
常用的启动子有CMV启动子、EF1α启动子和PGK启动子等。
增强子可以增加基因的表达水平，常用的增强子有CMV增强子、SV40增强子和EF1α增强子等。
通过合理选择启动子和增强子的组合，可以提高基因在细胞内的表达水平。
其次，可以通过改变表达载体的拓扑结构来提高基因表达效率。
常用的方法有线性化质粒和环形质粒之间的选择。
线性化质粒在导入细胞内后，可更容易与细胞内的转录因子结合，从而促进基因的表达。
环形质粒则具有更好的稳定性，在不进一步构建的情况下，可以长期保持在细胞内。
此外，还可以通过引入信号序列来优化基因的靶向表达。
信号序列是一段具有特定功能的氨基酸序列，能够促使基因产物在细胞中的定位和分泌。
融合蛋白表达载体的构建一、概述融合蛋白是把一个蛋白与其他物质混合在一起形成新的融合蛋白。
它们可以用于改善药物的药理学性质，广泛用于药物研究，疾病诊断，以及在医学和生物技术领域的应用。
为了有效地进行融合蛋白表达，科学家们需要设计一种质粒，它既能携带融合蛋白的基因信息，又能使表达的融合蛋白具有理想的性质，因此，构建融合蛋白表达载体就成为了研究者们的重要内容。
二、融合蛋白表达载体的构建1.质粒设计质粒设计是融合蛋白表达载体的核心部分，它能够携带融合蛋白的基因信息，并控制融合蛋白的表达。
一般而言，融合蛋白表达质粒包括表达调控基因、融合基因、保守克隆基因等几部分，其中表达调控基因以及保守克隆基因部分主要用于控制融合蛋白的表达，而融合基因部分则用于携带融合蛋白的基因信息，使其能够表达出想要获得的性质。
2.质粒的合成质粒设计完成之后，下一步就是将其合成成一种可用于融合蛋白表达的质粒。
一般而言，此步骤可以通过化学合成或者基因重组技术完成。
化学合成方法可以可靠地合成出想要获得的质粒，而基因重组技术则可以以更快的速度构建出相似的质粒。
3.表达测试表达测试是质粒构建过程中不可或缺的一部分，它能够检测融合蛋白是否能够正确表达，从而确定质粒是否构建成功并具有较好的表达能力。
表达测试通常包括定量PCR法、流式细胞仪法以及免疫印迹法等几种常见技术，这些技术都可以帮助科学家们及时发现融合蛋白表达存在的问题，从而指导科学家改进构建融合蛋白表达载体的工作。
三、结论融合蛋白表达载体的构建是科学家们针对融合蛋白表达问题所付出的努力，它包括质粒设计、质粒合成以及表达测试等几个步骤，有助于融合蛋白表达的安全、稳定和高效，并且可以提供药物及其他生物技术应用的理想基础。
表达载体的构建注意事项构建载体是一项重要的任务，它决定了信息传递的质量和效果。
在进行载体构建时，我们需要注意以下几点：1. 独特性：确保文章内容的独一性，避免内容重复出现。
这样可以让读者获得新鲜感，并更好地吸引他们的注意力。
2. 结构合理：为了增强阅读流畅性，我们需要合理安排文章的结构。
可以使用适当的标题来划分段落，使内容更加清晰明了。
3. 避免网络地址：在文章中不得插入任何网络地址，以确保文章的纯文本性质。
这样可以避免读者在阅读过程中被打断或分心。
4. 避免数学公式和计算公式：文章中不应包含数学公式或计算公式。
这些公式对于非专业读者来说可能会造成困扰，降低文章的可读性。
5. 避免使用图片链接：不得使用、插入任何形式的图片链接。
这样可以避免读者在阅读过程中需要打开链接或依赖图像来理解文章的内容。
6. 避免依赖图像的语句：避免使用依赖图像的语句，如“如图所示”等字眼。
这样可以避免读者对文章内容的误解或困惑。
7. 避免重复问题：不得在文章中反复提出同一个问题。
这样可以避免读者产生厌烦或对文章内容产生疑惑。
8. 简洁自然：文章应该尽量简洁自然，避免过多的自我介绍。
这样可以让读者更加专注于文章的主题和内容。
9. 流畅表达：文章应刻画明确，句式流畅，并使用丰富多样的词汇来表达。
这样可以增加文章的可读性和吸引力。
10. 中文描述：请尽可能使用准确的中文进行描述，避免使用拗口或错误的词汇和表达方式。
11. 准确无误：确保文章内容的准确无误，严肃认真。
避免使用歧义或误导的信息，以免给读者带来困惑或误解。
通过以上注意事项，我们可以以人类的视角来构建载体，使文章富有情感，并使读者感到仿佛是真人在叙述。
同时，我们也要确保文章的自然度和流畅度，避免让读者感觉像机器生成的内容。
这样可以提高文章的质量和吸引力，让读者更加愿意阅读和理解。
基因表达载体的构建方法基因表达载体是一种用来携带外源基因并将其表达的工具，它可以被用于基因工程、基因治疗、蛋白质表达等领域。
构建一个高效的基因表达载体对于生物学研究和应用具有重要意义。
下面将介绍基因表达载体的构建方法。
首先，选择合适的表达载体。
常用的表达载体包括质粒、病毒、原核生物和真核生物等。
质粒是最常见的表达载体，它具有稳定性高、易于操作等优点。
而病毒载体则可以实现高效的基因传递和表达。
根据实验需要和研究对象的特点，选择合适的表达载体非常重要。
其次，设计基因的插入序列。
在构建基因表达载体时，需要将目标基因插入到载体中，并确保基因的正确表达。
为了实现这一目标，需要设计合适的引物，并利用PCR技术扩增目标基因。
此外，还需要考虑基因的启动子、终止子、信使RNA等序列的设计，以确保基因在宿主细胞中能够得到正确的表达。
然后，将目标基因插入载体。
一般来说，可以利用限制性内切酶将目标基因和表达载体进行酶切，然后利用DNA连接酶将两者连接起来。
此外，还可以利用基因克隆技术将目标基因插入到表达载体中。
在这一步骤中，需要注意选择合适的酶切位点、连接方式和连接效率，以确保插入的基因能够稳定地存在于载体中。
接着，进行载体的转化和筛选。
将构建好的基因表达载体导入到宿主细胞中，然后利用抗生素筛选、荧光筛选等方法，筛选出带有目标基因的阳性克隆。
这一步骤需要注意转化效率、筛选条件和筛选方法的选择，以确保获得高效的表达载体。
最后，验证基因表达载体的功能。
构建好基因表达载体后，需要进行功能验证，包括基因的表达水平、蛋白质的表达情况、生物学活性等方面。
通过Western blot、荧光显微镜、活性测定等方法，验证基因表达载体的功能和稳定性，为后续的研究和应用奠定基础。
总之，构建基因表达载体是一个复杂而又关键的过程，需要综合考虑载体的选择、基因的设计、插入、转化和验证等多个环节。
只有在每一个环节都做到严谨和细致，才能获得高效、稳定的基因表达载体，为生物学研究和应用提供有力支持。
克隆载体表达载体构建详细版一、稀释引物1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温）2、根据OD值加DD水。
3、静置30min（冰上）4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。
5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。
二、跑MIX检测引物（20ul体系）、上引物0.8ul下引物0.8ulMix 10ulDNA（日本晴）1ulDD水7.4ul三跑高保真酶（50ul体系）DNAorCDNA 2ul上引物2ul下引物2ul5*buffer 10uldNTPs 5ulDD水28ulPfu（最后加）1ul四胶回收流程1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。
2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。
3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。
4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。
5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。
7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。
8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。
五、胶回收产物检测（10ul）体系上引物0.4ul下引物0.4ulMix 5ul回收产物1ulDD水 3.2ul六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系）胶回收产物 3.5ulBlunt cloning 0.5ul混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃之后转化1、提前5min从-70℃冰箱中拿出大肠杆菌感受态，冰上解冻5min。
2、将样品（4ul）加入感受态的大肠杆菌中，冰上30min，大约剩5min左右，打开水浴锅预热到42℃，并拿出SDC 培养基解冻（室温解冻）。
3、水浴锅42℃，60-90s迅速转移到冰浴2min，该过程中不要摇动离心管。
构建基因表达载体的步骤
构建基因表达载体的主要步骤包括：
1.目的基因的获得：即使用限制性核酸内切酶切割质粒，露出黏性末端，再用同一种限制性核酸内切酶切割目的基因，使其产生相同的黏性末端。
2.载体和目的基因的限制性酶切：用相同的限制性酶酶切载体和目的基因，使它们产生相同的黏性末端。
3.连接转化：将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，再使碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键。
4.加入适量的DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。
构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程如下：
1. 选择合适的载体：根据需要表达的基因或蛋白质，选择一个合适的表达载体。
常用的载体有质粒、病毒、合成RNA等。
2. 插入目标基因：将需要表达的基因插入到载体的多克隆位点中。
可以通过PCR 扩增目标基因并使用限制性内切酶切割载体和基因，然后进行连接。
3. 连接启动子和终止子：为确保基因在宿主细胞中能够正常表达，需要在基因的上游添加启动子和在基因的下游添加终止子。
这些序列将调控基因的表达方式和水平。
4. 检验构建质量：通过限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法，验证所构建的载体和目标基因的正确性和完整性。
5. 转化宿主细胞：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
常用的转化方法有电穿孔、热激冲击和化学转化等。
6. 筛选和鉴定：通过特定的筛选方法或选择标记，在转化的宿主细胞中筛选和鉴定表达目标基因的阳性克隆。
7. 表达优化：根据需要，可以通过调节培养条件、添加诱导剂或使用特定的宿主菌株等方法，优化目标基因的表达水平和质量。
8. 收获表达产物：经过一段时间的培养后，收获表达的基因产物，如蛋白质，进行后续的纯化、鉴定和应用等。
需要注意的是，具体的构建流程和方法可能会因实验的目的和要求而有所不同。
在实施过程中，需要对不同步骤和条件进行优化和调整，以确保表达载体的构建和表达目标基因的成功。
表达载体构建1. 背景介绍表达载体是在分子生物学领域中广泛使用的工具，用于将目标基因导入宿主细胞中并使其表达。
构建高效的表达载体对于基因功能研究和基因工程应用具有重要意义。
本文将介绍表达载体的构建方法及其在基因表达中的应用。
2. 表达载体的构建方法构建表达载体的一般步骤包括选择合适的载体骨架、选择适当的启动子和终止子、插入目标基因序列以及进行转染或转化等操作。
下面将详细介绍表达载体的构建方法。
2.1 选择合适的载体骨架常用的载体骨架包括质粒和病毒载体。
质粒是可以在细菌中复制的DNA分子，通常由起始位点、选择标记和多个限制酶切位点组成。
病毒载体包括腺病毒、慢病毒等，具有高效转染特性。
选择适合自己研究的载体骨架是表达载体构建的第一步。
2.2 选择适当的启动子和终止子启动子是基因表达的起始信号，终止子是基因表达的终止信号。
启动子的选择应根据目标基因的表达需求和宿主细胞的特性进行。
常用的启动子包括强启动子（如CMV启动子）、组织特异性启动子等。
终止子则可以选择常规的转录终止信号。
2.3 插入目标基因序列选择合适的酶切位点，在载体DNA上进行限制性内切酶切割，并将目标基因序列与载体连接。
连接的方法可以是经典的限制性酶切连接、PCR扩增连接、Ligase连接等。
连接完成后，应进行酶切鉴定和测序验证，确保目标基因序列插入准确。
2.4 进行转染或转化将构建好的表达载体导入宿主细胞中，实现基因表达。
转染方法包括化学转染、电穿孔转染、病毒介导转染等，转化方法包括细菌的电转化、植物的农杆菌介导转化等。
3. 表达载体的应用表达载体广泛应用于基因功能研究和基因工程应用，具有重要的实验意义和应用前景。
3.1 基因功能研究通过表达载体，可以实现外源基因的高效表达，进而研究基因的功能、调控机制等。
比如可以通过表达载体将目标基因在细胞中过度表达或进行基因敲除等，来研究该基因在细胞或生物体中的功能。
3.2 基因治疗表达载体在基因治疗中具有重要的应用价值。
基因表达载体的构建流程基因表达载体的构建呀，那可真是个超有趣的事儿呢。
咱先来说说啥是基因表达载体。
简单来讲呢，它就像是一个小快递车，专门负责把咱们感兴趣的基因运到细胞这个大“城市”里的指定地方，然后让这个基因在那儿发挥作用。
这个小快递车得有一些特殊的构造，这样才能把基因稳稳地送到，还能让基因在目的地好好工作。
那构建这个基因表达载体的流程到底是咋样的呢？一是要有目的基因。
这目的基因就像是快递车上要送的宝贝。
我们得想办法从生物的基因组里把这个我们想要的基因找出来。
这就好比在一个超级大的仓库里找一个特定的小物件，有时候可不容易呢。
可能要用到一些特殊的方法，像从DNA里把这个基因切出来。
这就像用一把超级精准的小剪刀，只把我们要的那部分基因剪下来，可不能剪错了哦。
接着就是选择合适的载体。
载体的种类还不少呢，就像快递车有不同的型号。
有的载体适合在细菌里跑运输，有的呢就适合在植物细胞或者动物细胞里工作。
我们得根据自己的需求，挑选那种和目的基因最配的载体。
这个载体得有一些特殊的地方，比如说有一些特定的位点，就像快递车上有专门放东西的小格子，这样目的基因才能安安稳稳地待在上面。
然后就是把目的基因和载体连接起来。
这就像是把宝贝小心翼翼地放到快递车上的小格子里。
这得用到一些特殊的“胶水”，在基因这个世界里，这些“胶水”就是一些酶啦。
这些酶能够把目的基因和载体紧紧地粘在一起，让它们成为一个整体。
这个过程可不能马虎，如果没粘好，在运输的过程中基因可能就掉出来了，那可就糟糕了。
再之后呢，就是要把这个构建好的基因表达载体导入到细胞里面。
这就像是把装满宝贝的快递车送到目的地城市里。
导入的方法也有很多种，不同的细胞可能适合不同的导入方式。
比如说，对于细菌细胞，可能有一种简单的方法，就像把快递车直接开到城门那里就可以进去了。
但是对于一些比较复杂的细胞，像动物细胞，可能就需要一些更复杂的手段，就像要偷偷地找个小道才能把快递车开进去。
大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是常用的表达宿主。
利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而产生大量目标蛋白。
本文将介绍大肠杆菌表达载体的构建方法及其应用。
一、大肠杆菌表达载体的构建方法1. 选择适合的表达载体：常见的大肠杆菌表达载体包括pET系列、pBAD系列和pGEX系列等。
选择适合的表达载体主要考虑载体的复制起源、选择标记、表达调控元件和蛋白纯化标记等因素。
2. 克隆目标基因：将目标基因通过PCR扩增得到目标基因片段，然后利用限制性内切酶切割载体和目标基因片段，将目标基因片段插入载体中。
3. 进行质粒转化：将构建好的重组质粒导入大肠杆菌中。
可以通过化学法、电穿孔法或热冲击法等方法将质粒导入大肠杆菌中。
4. 筛选与鉴定：经过转化后，利用选择性培养基筛选出含有目标基因的重组大肠杆菌。
通过PCR、限制性酶切和测序等方法对重组菌株进行鉴定，确认目标基因已经成功插入载体。
二、大肠杆菌表达载体的应用1. 蛋白表达：利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而大量产生目标蛋白。
这对于研究蛋白的结构、功能及其在生物学过程中的作用具有重要意义。
2. 蛋白纯化：大肠杆菌表达载体常含有蛋白纯化标记，如His标签、GST标签等。
通过这些标记，可以方便地对目标蛋白进行纯化和检测，为后续研究提供了便利。
3. 蛋白互作研究：大肠杆菌表达载体可以用于蛋白互作研究。
通过将目标蛋白与其他蛋白共同表达，可以研究它们之间的相互作用关系，揭示生物学过程中的分子机制。
4. 疫苗研究：大肠杆菌表达载体可以用于疫苗研究。
将目标抗原基因导入大肠杆菌中进行表达，可以获得大量的抗原蛋白，从而用于疫苗的开发和研究。
5. 酶工程：大肠杆菌表达载体可以用于酶工程研究。
通过将目标酶基因导入大肠杆菌中表达，可以进行酶的产量优化、酶的工艺改造等研究，提高酶的生产效率和稳定性。
关于表达载体的构建
1.表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。
这类
载体既有复制子，更要有强启动子；
2.大肠杆菌中的表达载体应含有
（1）强启动子
（2）在启动子下游区和A TG上游区有一个好的SD序列。
（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。
我们实验室常用的就是PBI121的表达型载体，该载体具有35S强启动子，下游有MCS，并且具有T-DNA插入片段和Tet和Kan的抗性位点，有利于作为农杆菌浸染植物的表达载体。
3.载体构建的步骤
（1）.设计引物
1.引物的长度用于PCR扩增的寡核苷酸引物至少应在16个碱基以上，一般以20—30个碱基为宜，引物过短会使PCR特异性降低，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。
2. 引物自身序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。
引物中碱基分布应尽可能避免嘌呤、嘧啶的连续排列，引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR
反应失败。
3. Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G)
4. 引物的GC含量引物中GC含量应占到45％一60％左右。
在引物设计时应尽量避免引物二聚体和发卡结构，尤其是在引物3，端不应有互补结构。
引物3，端应与目的片段完全配匹，而其5’端碱基可不与模板配匹，故在引物设计时可在其5，端加上限制酶位点或其他短的序列，这些与原初模板并不配对的非互补序列在后续的循环中将被带到双链DNA中去，这样反应产物不仅含有目的序列，同时在目的基因的两侧又有了新的限制酶位点，用相应
的限制酶切割后即可将PCR产物定向克隆到载体中。
以基因GhAGP31为例说明，以下是GhAGP31的ORF序列：ATGGGGTTTGCTGTAATAGTACTAGTAGTTAAAGCTGCTTTGCTTGTGCAGCTTTCACT GTTGTTACTGAGCACCTTCACTGTCTCTGCTCCCATTTGGCCTCAGGCTTCTCCTCCTC ATTACCATGCTGTTTCACCTGTAGTCCCGCCTACTCACCCACCAACCCACCACCATCAC CACCACCCTCACCCTCACCCTCACCCCCATCCTCATCCACCCACTAAGCCCCCAACCC CCACTCCTCCTCCAGTTCA TCCACCACCCAAGGCGCCAGTGCAACCACCAACCAAGC CACCAGTTCACCCACCACCCAAGCCACCAGTTCAACCTCCAACTAAGCCACCAACCA AACCTCCAACTCAACCCCCGACTAAGCCACCAACTCAGCCCCCGACTAAGCCACCAA CCAAGCCTCCAACTCAGCCCCCGACGAAGCCACCAACACACCCACCATCTCATCCTC CGGCCAAGCCACCTAAA TCGAGCCAGGTGGCAGTGCAGGGCGTTGTTTATTGCAAGT CA TGCAAGTACGCCGGAGTCGACACCCTTTTGGGAGCTAAACCAATTCTTAGTGCCAC CGTAAGGCTGACA TGCAAAGACGCTAAAAACGAATTAACGGTCCAGTTCAAGACTGA CAAGAATGGTTA TTTCTTCCTGCAAGCACCAATTACCATCTACAATTTTGATCTCCACA ATTGCAGCGTCTCCCTCGTATCTTCACCATTGAAAGCATGCAGCAAGCCA TCTAATCTA AACGGTGGATTGAAGGGCGCCCCCTTGAAGCCTGAGAAACCATCTACTTCAAAGAAG CTCCCATATGTTCTCTACAGCGTTGGGCCCTTCGCTTTCGAACCCACATGTCACAAGAA CTAG
GhAGP31Up1: 5’>CTTGGA TCCATGGGGTTTGCTGTAATAGTAC<3’BamHI GhAGP31Dn1: 5’>CTTTCTAGAGTTCTTGTGACA TGTGGGTTCG<3’XbaI 两条引物都有CTT作为保护碱基，同时平衡引物中的G+C含量。
CTT后面6个碱基为酶切位点，分别为BamHI（GGATCC）、XbaI（TCTAGA）酶切位点，接下来Up1为ORF 内一段以ATG开头的上游序列，共22个碱基，Dn1为终止密码TAG结尾的22个碱基。
Tm=66.8，（G+C）%=45.2%。
实际上，设计引物时应根据实际情况而定，尽量满足引物设计原则，但与理想情况会有偏差。
（2）.目的基因的克隆PCR扩增目的基因，根据Tm （Tm=66.8）值和ORF（800bp 左右）的长度决定退火温度和延伸时间。
（3）.酶切目的基因和载体连接利用相同的限制性内切酶酶切克隆的目的基因和PBI121（BamHI和XbaI），以除去保护碱基和切出相同的粘性末端。
在T4DNA连接酶的作用下连接载体和目的片段。
（4）.连接产物转化感受态细胞16℃连接过夜后，42℃热激90秒，转化到0.1MCaCl2制作的DH5a大肠杆菌感受态中，在加有Kan的固体LB培养基上筛选阳性单菌落.
（5）.阳性克隆的筛选和检测可以接种摇菌后用菌液PCR检测或碱裂解法提取质粒后PCR检测若能扩增出ORF大小的片段后；再用相同的限制性内切酶（BamHI和XbaI）酶切质粒若能切出ORF大小的片段，则载体构建成功！。
