细菌对抗菌药物的敏感试验

近年来，由于抗生素、磺胺等抗菌药物广泛应用，导致了耐药菌株不断出现。

测定细菌对药物的敏感程度，对于临床治疗中选择用药，避免滥用药、及时有效地控制感染以及细菌鉴定，具有重要意义。

细菌敏感度的测定方法很多，世界卫生组织推荐的方法为Kirby-Bauer 纸片法，该方法具有操作简便、易于掌握、且重视性好的优点，本法是将含药纸片贴敷在接种细菌的琼脂平板上，利用含药纸片在琼脂上的扩散作用来测定细菌对药物的敏感性。

K-B纸片法的原理是建立在抗菌药物抑菌环直径大小与细菌的最小抑菌浓度（MIC）之间呈负相关的基础上，即抑菌环直径越大，则MIC越小。

结果判定：按抑菌环直径大小报告敏感、中度敏感或耐药。

敏感：是指被测菌株所引起的感染可以用常用剂量的某种抗菌药物治疗。

中度敏感：是指通过提高种抗菌药物的剂量或在该药浓集的部位，细菌生长可被抑制，感染可被治愈。

这类药物毒性较小，剂量可以加大。

β-内酰胺类药物可出现中度敏感。

耐药：是指被测菌株所引起的感染不能用常规剂量的抗菌药物所治愈。

中介度：这一范围是“缓冲域”是由试验的误差造成的不作为报告形式。

如确需明确的敏感度，应重复实验或做稀释法，抑菌环为中介度的药物不可提高剂量。

最低抑菌浓度（MID）：抗菌药物能够抑制细菌生长所需要的最低浓度。

以针形接种器沾取菌液加至药盒各孔，35℃培养过夜，含抗菌素浓度最低而无细菌生长的（清亮孔），即为MIC。

最低杀菌浓度（MBC）：抗菌药物杀灭细菌所需要的最低浓度。

经48小时35℃培养后，含抗菌素浓度最低而无细菌生长的（清亮孔），即为MBC。

由于纸片法影响因素多，很难控制精度，现大多数医院采用MIC测定盒。

MIC由经典二倍肉汤稀释演化而来，具有终点判断精确，重复性好，操作简便等优点。

此方法采用病美国DYNATECH接种器，更具科学性。

使用国产“华士达微生物自动分析仪”所做的定量药敏（MIC）试验，报告自动由打印机印出，附印出抗菌素对受试菌的MIC外，还可提供各种药物的用量，给药途径（口服、肌注、静滴）及血和尿中可能达到的药物浓度一览表，供临床医师参考。

一般细菌抗菌药物敏感试验稀释法稀释法是用培养基将抗菌药物作不同浓度稀释，再接种待检细菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死细菌的最低药物浓度的体外办法，分为肉汤稀释法和琼脂稀释法。

稀释法所测得的某抗菌药物能抑制待测菌肉眼可见生长的最低药物浓度成为最低抑菌浓度（MIC)。

CLSI的M07文件系列对于MIC法给出了具体的标准。

（一）肉汤稀释法肉汤稀释法包括常量稀释法（macrodilution）和微量稀释法（microdilution)。

两者原理相同，只是反应液的体积不同。

前者采纳试管，每管中菌药混合物体积为2 mL；后者采纳微孔板，每孔菌药混合物的体积为0.1 mL。

1．原理用MH肉汤将抗菌药物对倍稀释，接种一定量的待测菌，以肉眼看不见细菌生长的最低药物浓度为MIC；此办法定量测定抗菌药物杀灭受试菌的最低浓度为最低杀菌浓度（minimal bactericidalconcentration,MBC)。

2．培养基MH肉汤为基础培养基，用于常规需氧菌和兼性厌氧菌检测。

而相对苛养的细菌，如和流感检测则需要添加养分成分。

虽然不是苛养菌，但也需要添加2％（质量浓度）的NaCI 以提高耐葡萄球菌的检出率。

3．药物稀释 (1)抗菌药物储存液的配制。

抗菌药物干粉不能挺直用于AST，普通保存在-20℃以下的干燥容器中。

用法前先配制抗菌药物储存液，其浓度起码为1000 ug/mL（如1280ug/ML）或最高实验浓度的10倍。

取少量体积的抗菌药物储存液于无菌玻璃、、或小瓶中，密封置于-60℃或更低温度，需要时解冻并且当天用法，用过的储存液应在24 h后丢弃。

大多数的抗菌药物储存液可在-60℃或更低温度保存6个月或以上，其活性无显著变幻。

(2)抗菌药物稀释液的配制。

药物稀释液的浓度参考CLSI M100文件表格2的说明折点，试验室可按照实际调节。

建议挑选的浓度范围起码包括一种质控菌的折点。

对药物储存液举行对倍稀释，其终浓度可为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 ug/mL（图10-3)。

四、抗菌药物敏感性试验（一）药敏试验的目的测定病原微生物对化学治疗药物敏感性的试验称为化疗药物敏感性试验（Drug sensitivity test），简称药敏试验。

药敏试验的主要目的是：①用于测定新的抗菌药物或制剂的抗菌谱；②对病灶分离菌进行流行病学调查，主要应用于测定细菌经过多年后敏感性的变化情况和地区特异性；③在临床治疗感染性疾病时，针对病原菌选择合适的首选药物品种。

（二）药敏试验的原理及种类药敏试验是通过培养基培养的细菌确定细菌对药物的敏感性方法。

将被检菌接种在适当的培养基上，然后加上不同种类或不同浓度的抗菌药物（或制剂），观察细菌生长发育的速度和程度。

用药后，细菌在培养基上停止生长并且死亡，抑菌圈清晰，说明细菌对药物敏感，药物表现有较强的杀菌作用；用药后，细菌停止生长，但液体培养基经过一定时间后还可能出现浑浊或固体培养基上的抑菌圈不清晰，说明细菌对药物比较敏感，预示药物对被检细菌只是起抑菌作用。

通常判定一种药物对细菌的杀菌或抑菌作用的强度指标是固体培养基中抑菌圈的大小，但这也不是绝对的，因为抑菌圈的大小与药物对培养基的渗透性是密切相关的。

药敏试验方法较多，但在原理上不外乎是稀释法和扩散法两大类。

而扩散法（包括纸片法、管碟法）通常适用于临床治疗选择药物。

（三）常用培养基制作法1．普通肉汤培养基牛肉浸膏 3.0克蛋白胨 10.0克氯化钠 5.0克蒸馏水 1000毫升放在三角烧瓶中，微温溶解后，调节pH值至7.4~7.6，煮沸10分钟，冷却后的pH值为7.2±0.2。

15磅压力下灭菌15分钟（115℃灭菌30分钟）即得。

本培养基可用作为固体、鉴别、选择等培养基制造的基础原料，大部分细菌都能在其中生长。

1．普通肉汤琼脂培养基照上述普通肉汤培养基的配方及制法，加入15~20克琼脂，加热溶解后，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟，即得。

3．0.5%葡萄糖肉汤培养基蛋白胨 10克氯化钠 5克葡萄糖 5克牛肉浸膏 3克蒸馏水 1000毫升微温溶解后，调节pH值至弱碱性，煮沸后，加葡萄糖溶解，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟，即得。

第4章抗菌药物敏感试验一、需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验1.扩散法（K-B法）（1）原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在接种有待检菌的琼脂平板上，该点称为抗菌药源。

药物向周围扩散，形成了随着药源距离增加，琼脂中药物浓度递减的浓度梯度。

在药源周围可抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，形成无菌生长的透明圈即抑菌圈，其大小可以反映待检菌对测定药物的敏感性，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。

（2）实验材料①培养基：采用水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH为7.2，琼脂厚度4mm。

对生长条件要求高的细菌，如链球菌属细菌需加入5%脱纤维羊血，嗜血杆菌属细菌需加入1%血红蛋白（含Ⅴ因子）和1%Ⅹ因子复合物。

②抗菌药物纸片：选用直径为6.35mm，吸水量20μl的专用药敏纸片。

制备时取灭菌药敏纸片，经加样或浸泡药物溶液后冷冻干燥，置4℃保存备用，在有效期内使用。

③接种菌液挑取平板上形态相同的菌落4～5个，接种于3～5ml M-H肉汤中，于35℃中培养2～8h。

嗜血杆菌属和链球菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。

用生理盐水或肉汤校正菌液至0.5麦氏比浊标准（相当于1.5×109/ml的含菌量）后在15min内接种。

（3）试验方法以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液（其浊度为0.5麦氏比浊标准），在M-H琼脂表面均匀涂布接种3次，每次平板旋转60°，最后沿平板内缘涂抹１周。

平板置室温干燥3～5min，后用无菌镊子或专用纸片分配器将含药纸片贴于琼脂表面。

纸片应贴得均匀，各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm。

直径为90mm的平板可贴6张纸片。

纸片贴牢后应避免再移动。

平板室温放置15min后倒置于35℃培养箱中培养16～18h后读取结果。

（4）结果解释平板置黑色背景上，从背面量取包括纸片直径在内的抑菌圈直径，单位为mm。

培养基中如果加有血液须打开皿盖从正面测量抑圈菌。

(2022年版)1范围 (2)2 术语和定义 (2)3 常规药敏试验的药物选择和报告 (4)4 药敏试验方法 (7)5 各种属细菌药敏试验 (12)6 质量控制(Quality control, QC) (17)7 商品化药敏试验检测系统的性能验证 (19)附录 A (资料性附录) 临床各种属细菌的药敏试验方法和试验条件 (23)附录 B (资料性附录) 不常见苛养菌和非苛养菌药敏试验折点 (27)1 范围本标准规定了临床抗菌药物敏感性试验的技术要求，包括常规药敏试验的药物选择和报告、药敏试验方法、各种属细菌药敏试验、常见菌特殊耐药表型检测、药敏试验的质量控制、商品化药敏试验检测系统的性能验证。

本标准合用于开展临床微生物学检验的各级临床实验室。

2 术语和定义下列术语和定义合用于本文件。

2.1抗微生物药物敏感性试验 Antimicrobial susceptibility testing指检测微生物(本行业标准特指细菌)对抗微生物药物(本行业标准特指抗菌药物)的体外敏感性，以指导临床合理选用药物的微生物学试验，简称药敏试验。

2.2最低抑菌浓度 Minimal inhibitory concentration；MIC指在琼脂或者肉汤稀释法药物敏感性检测试验中能抑制肉眼可见的微生物生长的最低抗菌药物浓度。

2.3折点 Breakpoint能预测临床治疗效果，用以判断敏感、中介、剂量依赖型敏感、耐药、非敏感的最低抑菌浓度(MIC)或者抑菌圈直径(mm)的数值。

2.3.1敏感 Susceptible；S当抗菌药物对分离株的MIC值或者抑菌圈直径处于敏感范围时，使用推荐剂量进行治疗，该药在感染部位通常达到的浓度可抑制被测菌的生长，临床治疗可能有效。

2.3.2中介 Intermediate； I当菌株的MIC值或者抑菌圈直径处于中介时，该数值接近药物在血液和组织中达到的浓度，从而治疗反应率低于敏感菌群。

该分类意味着采用高于常规剂量治疗时或者在药物生理浓集的部位，临床治疗可能有效。

细菌药敏试验实训细菌的药物敏感性试验教学⽬标使学⽣掌握细菌药物敏感性试验的操作⽅法，能够利⽤本试验⽅法选择敏感药物治疗兽医临床常见的细菌性传染病。

材料准备1．器材：温箱、天平、打孔机、滤纸、⽆菌试管及吸管、镊⼦、接种环、酒精灯等。

2．试剂：蒸馏⽔。

3．培养基：普通琼脂平板。

4．菌种：⾦黄⾊葡萄球菌及⼤肠杆菌的固体培养物。

5．药品：链霉素、⾦霉素、新霉素、红霉素等抗菌药物。

6．硫酸钡标准管：取1%~1.5%氯化钡0.5ml加1%硫酸溶液99.5ml，充分混匀即成，⽤前充分振荡。

⽅法步骤将抗菌药物置于接种待检菌的固体培养基上，抗菌药物通过向培养基内的扩散，抑制敏感细菌的⽣长，从⽽出现抑菌环。

由于药物扩散的距离越远，达到该距离的药物浓度越低，由此可根据抑菌环的⼤⼩，判定细菌对药物的敏感度。

（⼀）含药纸⽚的制备1．滤纸⽚最好选⽤新华1号定性滤纸，⽤打孔机打成直径6mm的滤纸⽚，放在⼩瓶中或平⽫中，在121.3℃灭菌15min，再置100℃⼲燥箱内烘⼲备⽤。

2．药液的配制⽤⽆菌蒸馏⽔将各药稀释成以下浓度：磺胺100mg/ml、青霉素100IU/ml、链霉素、⾦霉素、新霉素、红霉素、多粘菌素1000µg/ml。

3．含药纸⽚的制备将灭菌的滤纸⽚⽤⽆菌的镊⼦摊布于灭菌平⽫中，按每张滤纸⽚饱和吸⽔量为0.01ml计算，50张滤纸⽚加⼊药液0.5ml。

要不时翻动，使纸⽚充分吸收药液，浸泡1~2h后于37℃温箱中烘⼲备⽤。

对青霉素、⾦霉素纸⽚的⼲燥宜采⽤低温真空⼲燥法，⼲燥后⽴即放⼊瓶中加塞，放⼲燥器内或置-20℃冰箱中保存。

纸⽚的有效期⼀般为4~6个⽉。

（⼆）测验⽅法1．钩取⾦黄⾊葡萄球菌和⼤肠杆菌菌落各4~5个，分别接种于⾁汤培养基中，37℃培养4~6h。

2．⽤灭菌⽣理盐⽔稀释培养菌液，使其浊度相当于硫酸钡标准管。

装有以上两种成分的试管须相同，硫酸钡应⽤前需充分振动。

3．⽤⽆菌棉拭⼦蘸取上述⾁汤培养液，在试管壁上挤压除去多余的液体，在琼脂培养基表⾯均匀涂抹。

细菌对药物的敏感试验●考点临床常用抗菌药物◇ 需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验◇ 厌氧菌体外药敏试验方法◇ 结核分枝杆菌体外药敏试验方法◇ 真菌体外药敏试验方法◇ 耐药菌株的监测临床常用抗菌药物简介一、抗菌药物的种类及作用机制1.青霉素类青霉素与青霉素结合蛋白（PBP）结合，抑制细菌细胞壁合成（1）天然青霉素种类：青霉素G、青霉素V作用于不产青霉素酶G+球菌、G-球菌、厌氧菌（2）耐青霉素酶青霉素种类：甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林作用于产青霉素酶的葡萄球菌（3）广谱青霉素1）氨基组青霉素：氨苄西林、阿莫西林作用于青霉素敏感的细菌、大部分大肠埃希菌、奇异变形杆菌、流感嗜血杆菌等G-杆菌2）羧基组青霉素：羧苄西林、替卡西林作用于产β-内酰胺酶肠杆菌科细菌和假单胞菌3）脲基组青霉素：美洛西林、阿洛西林、哌拉西林作用于产β-内酰胺酶肠杆菌科细菌和假单胞菌2.头孢菌素类头孢菌素与青霉素结合蛋白结合，发挥抑菌和杀菌效果G+球菌：一代＞二代＞三代G-杆菌：三代＞二代＞一代第四代头孢菌素作用几乎相同，具有抗假单胞菌的作用（1）第一代头孢菌素：有头孢噻啶、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢唑林、头孢拉定、头孢吡硫、头孢羟氨苄。

（2）第二代头孢菌素：有头孢孟多、头孢呋辛、头孢尼西、头孢雷特、头孢克洛、头孢丙烯、氯碳头孢。

（3）第三代头孢菌素：有头孢噻肟、头孢曲松、头孢唑肟、头孢哌酮、头孢克肟、头孢布烯、头孢地尼、头孢泊肟酯。

（4）第四代头孢菌素：有头孢匹罗、头孢噻利、头孢吡肟和头孢吡普。

3.其他β-内酰胺类单环类氨曲南和卡芦莫南对G-作用强，如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌对G+和厌氧菌无作用拉氧头孢类抗菌谱广，杀菌作用强，对产β-内酰胺的G-有很强的抗菌作用，对产酶的金黄色葡萄球菌也具有一定的抗菌活性。

头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑。

对G+有较好的抗菌活性，对厌氧菌有高度抗菌活性，但对非发酵菌无效。