芽孢染色法的原理

1.使学生掌握乘法原理主要内容，掌握乘法原理运用的方法；

2.使学生分清楚什么时候用乘法原理，分清有几个必要的步骤，以及各步之间的关系．

3.培养学生准确分解步骤的解题能力；

乘法原理的数学思想主旨在于分步考虑问题，本讲的目的也是为了培养学生分步考虑问题的习惯．

一、乘法原理概念引入

老师周六要去给同学们上课，首先得从家出发到长宁上8点的课，然后得赶到黄埔去上下午1点半的课．如果说申老师的家到长宁有5种可选择的交通工具（公交、地铁、出租车、自行车、步行），然后再从长宁到黄埔有2种可选择的交通工具（公交、地铁），同学们，你们说老师从家到黄埔一共有多少条路线

我们看上面这个示意图，老师必须先的到长宁，然后再到黄埔．这几个环节是必不可少的，老师是一定要先到长宁上完课，才能去黄埔的．在没学乘法原理之前，我们可以通过一条一条的数，把线路找出来，显而易见一共是10条路线．但是要是老师从家到长宁有25种可选择的交通工具，并且从长宁到黄埔也有30种可选择的交通工具，那一共有多少条线路呢这样数，恐怕是要耗费很多的时间了．这个时候我们的乘法原理就派上上用场了．

二、乘法原理的定义

完成一件事，这个事情可以分成n个必不可少的步骤（比如说老师从家到黄埔，必须要先到长宁，那么一共可以分成两个必不可少的步骤，一是从家到长宁，二是从长宁到黄埔），第1步有A种不同的方法，第二步有B种不同的方法，……，第n步有N种不同的方法．那么完成这件事情一共有A×B×……×N种不同的方法．

结合上个例子，老师要完成从家到黄埔的这么一件事，需要2个步骤，第1步是从家到长宁，一共5种选择；第2步从长宁到黄埔，一共2种选择；那么老师从家到黄埔一共有5×2个可选择的路线了，即10条．

三、乘法原理解题三部曲

1、完成一件事分N个必要步骤；

2、每步找种数（每步的情况都不能单独完成该件事）；

3、步步相乘

四、乘法原理的考题类型

1、路线种类问题——比如说老师举的这个例子就是个路线种类问题；

第 1 页 5.20 芽孢染色法

5.20.1 Schaeffer-Fulton氏染色法

5.20.1.1 试剂：

5.20.1.1.1 5%孔雀绿水溶液：

孔雀绿 5g

蒸馏水 100ml

5.20.1.1.2 番红水溶液：

番红 0.5g

蒸馏水 100ml

5.20.1.2 操作方法：

5.20.1.2.1 制片、染色

将涂片在火焰上固定，滴加孔雀石绿染液，用木夹夹住载玻片一端,在微火上加热至染料冒蒸汽并开始计时,维持5min，（注意:加热过程中要及时补充染液,切勿让涂片干涸）。

5.20.1.2.2水洗:

待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，直至流出的水为无色。（注意：勿用瀑水对着菌膜冲洗，以免细菌被水冲掉。）

5.20.1.2.3 复染:

用番红染液复染2分钟

5.20.1.2.4 水洗： 第 2 页 用缓流水洗后，吸干。

5.20.1.2.5 镜检：

干后用油镜观察。芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。

5.20.2 改良的Schaeffer-Fulton氏染色法

5.20.2.1 制备菌悬液：

加1～2滴水于小试管中，用接种环挑取2～3环菌苔于试管中，搅拌均匀，制成浓的菌悬液。（所用菌种应掌握菌龄，以大部分细菌已形成芽孢囊为宜；取菌不宜太少）

5.20.2.2染色:

加孔雀绿染液2-3滴于小试管中，并使其与菌液混合均匀，然后将试管置于沸水浴的烧杯中，加热染色15-20分钟。

5.20.2.3涂片固定

用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3次温热固定。

5.20.2.4脱色

水洗，直至流出的水无绿色为止

5.20.2.5复染

用番红染液染色2-3分钟，倾去染液并用滤纸洗干残液(不水洗)

一、实验目的

1. 掌握芽孢染色法的原理和操作步骤。

2. 观察芽孢和菌体的形态结构，了解芽孢的染色特点。

3. 提高实验操作技能和显微镜观察能力。

二、实验原理

芽孢是细菌在不良环境中形成的一种休眠体，具有厚而致密的壁，对高温、冷冻、射线、干燥、化学药品和染料等具有很强的抵抗力。因此，在常规染色方法中，芽孢不易着色或仅显很淡的颜色。芽孢染色法是利用芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，通过特殊染色方法使芽孢和菌体呈现不同的颜色，便于区分。

三、实验材料

1. 菌种：枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌等。

2. 染料：孔雀绿染液、番红染液、酒精、蒸馏水等。

3. 仪器：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯等。

四、实验步骤

1. 涂片：将菌种接种于营养琼脂平板，37℃培养24小时后，用接种环挑取少量菌体，滴加无菌水于载玻片中央，混匀后涂成薄膜，室温干燥。

2. 固定：将涂片菌面朝上，通过火焰2-3次固定，使菌膜牢固地贴在玻片上。

3. 初染：在涂片上滴加孔雀绿染液，染色5分钟。

4. 水洗：倾去染液，用蒸馏水冲洗玻片，直至水流无色。

5. 复染：在涂片上滴加番红染液，染色1分钟。

6. 水洗：倾去染液，用蒸馏水冲洗玻片，直至水流无色。

7. 镜检：在显微镜下观察，观察芽孢和菌体的形态结构，记录实验结果。

五、实验结果与分析

1. 观察到枯草芽孢杆菌的芽孢呈绿色，菌体呈红色，芽孢形态为椭圆形，大小约为菌体的1/3-1/2。 2. 观察到炭疽芽孢杆菌的芽孢呈绿色，菌体呈红色，芽孢形态为椭圆形，大小约为菌体的1/2-2/3。

3. 通过芽孢染色法，成功地将芽孢和菌体区分开来，观察到了芽孢的形态结构。

六、实验讨论

1. 芽孢染色法是细菌学中常用的染色方法，通过特殊染色方法使芽孢和菌体呈现不同的颜色，便于区分。

2. 在实验过程中，应注意染液的浓度、染色时间、水洗次数等因素，以保证实验结果的准确性。

3. 通过芽孢染色法，可以观察芽孢的形态结构，为细菌分类、鉴定和研究提供依据。

实验四.细菌芽孢染色

一. 目的要求：

目的：掌握细菌芽孢染色方法

内容：１．学习并掌握芽孢染色法

２．初步了解芽孢杆菌的形态特征

二. 基本原理：

芽孢壁厚，透性低，着色脱色较困难。因此先用着色力较强的孔雀绿，在加热的条件下染色，使染料不仅进入菌体也可以进入芽孢内，进入菌体内的染料经水洗脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂（如沙黄、番红、碱性复红）染色后，芽孢仍保留初染色剂的颜色，此时菌体被染成红色，芽孢呈绿色。

三. 器材

1.菌种：培养了16-20小时左右的枯草杆菌（37℃）

2.染色剂：5%的孔雀绿水溶液.0.5%番红水溶液 石炭酸复红染液

0.05%碱性复红 蒸馏水

3.仪器或其他用品：小试管.滴管.烧杯.试管架.载玻片.木夹子.显微镜等

二甲苯.香柏油

四. 操作步骤：

一）方法1：

1.取37℃培养了18-24小时的枯草杆菌作涂片，并干燥固定。

2.于载玻片上滴入3-5滴5%孔雀绿水溶液

3.用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计时约5min ,加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料

4.倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。

5.用0.5%的番红溶液（或0.5%沙黄水溶液或0.05%碱性复红）复染2分钟，水洗.

6.制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体呈红色。

二）方法2：

1.加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环培养16—20小时的枯草杆菌于试管中，充分混匀打散，制成弄的菌悬液。

2.加5%的孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合。

3.将此试管浸于沸水浴中，加热20-30min .

4.用接种环从试管底部挑取数环欲洁净的载玻片上，并涂布均匀，将玻片通过微火3次固定。

5.水洗至流出的水中无孔雀绿颜色为止。