芽孢染色法

山东大学实验报告

2014年 10 月 18 日

姓名 班级 13级生命基地班 学号 同组者：

科目 微生物学实验 题目 细菌芽胞染色 组别 3

第 1 页 共 4 页 微生物实验报告

【实验题目】

细菌芽孢染色

【实验目的】

1. 学习并掌握芽孢染色法

2. 了解芽孢的形态特征

【实验器材】

1、 菌种：

枯草芽孢杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物、梭状芽胞杆菌1-2d牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。

2、溶液和试剂：

a) 5％孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液、无菌水

b) 香柏油、二甲苯

3、 仪器及其它用品：

普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、试管夹等

【实验原理】

芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常为圆形或椭圆形。在合适条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌体。是否产生芽孢，以及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特征是细菌分类的重要指标。

与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚而致密，通透性低，不易着色，但是，芽孢一旦着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿）在加热条件下染色，使染料既可进入菌体也可进入芽孢，水洗脱色时，菌体中的染料被洗脱，而芽孢中的染料仍保留。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。

【实验内容及步骤】

2、 具体步骤：

1)洗片、干燥

取一块载玻片，用水浸湿，用手使用去污粉洗净玻片，竖立在一边自然干燥。干燥后在玻片的一面用记号笔做好标记。方便以后水洗染料，避免洗去细菌。

2)涂片

取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多）

1 / 3 姓名：

学号：

班级：12级生物基地4

组别：周三第六大组

时间：2013.10.18

细菌芽孢染色

一．实验目的

1. 学习掌握芽孢染色法，了解芽孢的形态特征。

2. 巩固显微操作技术及无菌操作技术。

二．实验原理

细菌芽孢染色的基本原理：芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢及芽孢的形状，着生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鉴定细菌的重要指标。与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚、透性低而不易着色，但是芽孢一旦着色就很难被脱色。利用这一特点，首先用着色能力较强的染料，如孔雀绿，在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。再用对比度大的复染剂（如番红液）染色后，菌体染上复染剂颜色，而芽孢仍为原来的颜色，这样就可以将两者区别开来。 在不同细菌中，芽孢所处的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在顶端。芽孢一般呈圆形、椭圆形、圆柱形。常见的细菌芽孢形态和着生位置如下图所示：

三．实验器材

1、菌种：枯草芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌，牛肉膏培养基。

2、溶液和试剂：a) 5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液，95%乙醇，蒸馏水等。b) 香柏油、二甲苯。

3、仪器及其它用品：普通光学显微镜、电子天平、擦镜纸、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、锥形瓶等。

四．操作步骤

1. 实验流程图：

涂片→加热干燥固定→孔雀绿覆盖→

微热5min→冷却→水洗→番红复染→

水洗干燥→镜检

2. 详细步骤：

a) 涂片，加热干燥及固定：在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水，分别接种枯草芽孢杆菌及梭状芽孢杆菌。然后按照常规方法加热干燥及固定；

b) 孔雀绿加热染色：用木夹夹住载玻片，向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位，然后在酒精灯上微微加热（孔雀绿着色能力强，加热可使较难染色的芽孢染成绿色，且再难洗脱）至染液冒蒸汽开始计时并维持5min，注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜，过热或加热不足均会影响观察效果，且加热时在载玻片上随时补加染液，切勿让涂片干涸；

实验四细菌的芽孢染色

细菌的芽孢是指在环境恶劣时，细菌会形成内部有严密壳层保护的休眠结构。芽孢可以存活在高温、低温、干旱和化学物质等极端环境中，具有极强的耐受性。因此，了解细菌的芽孢形态和染色技术对于临床医学和微生物学研究具有重要意义。

一、理论知识

芽孢染色是一种特殊的细菌染色方法，该方法是通过将细菌在特定的温度和时间条件下培养，诱导细菌形成芽孢。然后用特殊染剂染色，可以使芽孢呈现出特定的颜色。这种染色方法可以将细菌分为两类：芽孢形成阳性细菌和芽孢形成阴性细菌。

在芽孢染色实验中，需要用到以下染剂：

1. 碘液：可以使细菌和芽孢的细胞质和内浆颜色变成深蓝色。

2. 芽孢绿：能够将芽孢染成绿色。

二、实验步骤

1. 准备玻璃片。取两块无菌的玻璃片，用酒精灼烧消毒，并晾干备用。

2. 细菌培养。取一株待检测的细菌，接到含有适当营养成分的琼脂平板上。在适当的温度下，通常是30-37℃，使细菌生长至需要形成芽孢的生长阶段。

3. 热处理。将培养好的细菌涂在一块玻璃片上，然后将其放置在巴氏杀菌器中，用高温（通常是80℃）处理大约5分钟。这里的处理过程可以模拟极端环境，诱导细菌形成芽孢。

4. 染色涂片。将热处理后的细菌涂片放置在滴定瓶中，加入碘液，在室温下静置几分钟。不要让碘液干燥，否则会影响后续染色效果。之后，用酒精洗去多余的碘液。

5. 脱色处理。将染色过的细菌涂片放入酸酒精溶液中，脱色1-2秒钟。这一步会去除多余的染料，使芽孢显现出绿色。

6. 水洗和固定。用自来水清洗脱色后的涂片，然后用火焰进行烘干和固定。

三、实验结果与分析

芽孢染色的阴性和阳性结构特点如下：

芽孢阳性：芽孢位置不定，涂片颜色为绿色。

四、注意事项 1. 操作前请认真研究操作步骤并准备好所有必需的实验器材。

芽孢染色法的原理

芽孢染色法，又称核酸染色法，是一种用于细菌和真菌的鉴定、分类和研究的常用技术。芽孢染色法是一种使用有机染料的染色试验，其最大的特点是在无氧的环境中，如直接打开封闭瓶中染料液，或放置在非活性氣氛中，或加入抑制芽孢形成的剂量，就能有效阻抑细菌的芽孢形成，在残存的芽孢附近观察到明亮的染料色彩，而死芽孢则不显色，以此做为鉴定细菌芽孢形态特征的主要依据。

基本原理

芽孢染色法的基本原理是细菌或真菌的芽孢在只要添加一些特定的有机染料，就会显示出特殊的颜色，而这种有机染料可以准确识别出对细菌或真菌的形态和生理特性，从而将不同的菌株区分开来，鉴定出菌体中的特定抗体类型。比如，品尔梅斯染料可以用于染色结构紊乱，不稳定或不典型囊杆菌纲下（如普萤氏菌）等。

使用方法

自从1897年芽孢染色法最初被提出以来，芽孢染色法一直都是最为受推崇的染色技术，它也可以被应用于更多种的菌株，也可以染出更加精确的芽孢形态特征和胞壁结构特征。一般来说，芽孢染色的过程应该包括三个步骤：芽孢形成、染色和观察。

第一步：芽孢形成

芽孢形成是一个关键步骤，用于制备样品，它是染色显色的前提：首先在染色板上用刮刀将所需观察的样品刮成大小末，然后将其加入恒定温度的热水池中温度维持37℃，为细菌的芽孢形成提供了良好的条件，在细菌的芽孢发育到一定的成熟时芽孢就会出现在细菌附近；然后用冻结剂或影响其芽孢形成的所有其他因素冻结细菌的芽孢形态，使其保持原样，以便染色和观察。

第二步：染色

在细菌芽孢形成之后，即可进行染色，将特定的有机染料溶液（如品尔梅斯染料）加入细菌芽孢上，染红色，将芽孢完全包被，涂上一层薄膜，以使芽孢变得显著，而无芽孢的细菌则没有任何色彩变化。

第三步：观察 在染色后，细菌芽孢的形态和特征就会变得十分明显，可以明亮的颜色就可以观察出来，这时就可以观察芽孢的数量、形状、分布和相互间的排列，这些芽孢的特性它可以用来鉴别和识别细菌的种类。