石蜡切片免疫荧光实验步骤
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石蜡切片免疫荧光实验步骤
1、脱蜡至水:将组织切片室温放置10min后,依次将石蜡切片放
入二甲苯3min→无水乙醇5min—85%酒精5min—75%酒精5min—ddH2O洗5min。
2、抗原修复:组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液(50X稀释至
1X使用)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复(中火8min—停火8min—中低火7min)。此过程中应防止缓冲液过度蒸发,切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每次5min(具体修复液和修复条件根据组织来确定)。
3、画阻水圈:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈,防止液体
流失。
4、BSA封闭:在圈内滴加3%-5%浓度BSA孵育30min(或二抗
同源血清封闭)。
5、一抗孵育:轻轻甩干封闭液,在切片上滴加按一定比例配好的
一抗(溶于血清:PBS=1:19的抗体稀释液体系中),切片平放于湿盒(内加少量水防止抗体蒸发),4°C过夜。
6、二抗孵育:玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每
次5min。切片稍甩干后在圈内滴加相应的荧光二抗,覆盖组织,避光RT孵育50min。
7、DAPI染核:玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每
次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液,避光RT孵育3-5min。
8、树脂封片:玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次,每
次5min。切片稍甩干后用树脂封片剂封片(其间可滴加少量抗荧光淬灭剂)。
9、镜检拍照:切片于荧光显微镜/confocal/活细胞工作站中观察并
采集图像(DAPI紫外激发波长330-380nm,发射波长420nm,发蓝光;FITC激发波长465-495nm,发射波长515-555 nm,发绿光;
CY3激发波长510-560,发射波长590nm,发橙光;CY5发红光)。
10、结果判读:DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色,阳
性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光,图片处理需使用Image J 软件。