石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
1、组织的采集、固定和保存：
采取组织后，
方法一： 4%多聚甲醛〔 4%PFA 〕 4 C 固定 1 小时〔根据组织大小和致密程度调整固定时间〕或过夜
方法二：采用
bouin’ s 固定RT 2h〔 6-8d tesis〕 or RT过夜〔成年tesis〕
PBS 缓冲液洗三次，每次5min ， 4 C 保存于
70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：
固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54 C 石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10 m，贴于处理过的干净载玻片上，37 C 烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT 密封保存。
石蜡包埋：
保存于 4 C 70%乙醇中的组织样品
80%乙醇
15 min
95% 乙醇 15 min
100%乙醇 15min 2
1/2 乙醇 1/2 二甲苯15 min
二甲苯透明5-10 min
1/2 二甲苯 1/2 石蜡 30 min
石蜡〔 1〕1.5hr
石蜡〔 2〕1.5-2.5hr
石蜡〔 3〕包埋
RT 保存
3、石蜡组织切片的免疫组化方法：
密封保存于RT 的组织切片
二甲苯 (1)20 min
二甲苯 (2)20 min
100%乙醇20min
95%乙醇10 min
80%乙醇10 min
通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
切片在 PBS 中浸泡 5 min*2
0.4%Tritonx RT 10 min
切片在 PBS 中浸泡 5 min*3
3%H2O2 RT 10min
切片在 PBS 中浸泡 5 min*3
0.25%胰酶 RT 10min
切片在 PBS 中浸泡 5 min*3
Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS)RT 60min
倾去 blocking buffer，勿洗
一抗 4 C overnight in blocking buffer
取出切片复温1h，切片在PBS 中浸泡5 min*3
二抗 in blocking buffer GAR1：200〔GAM1：100〕，RT 1h
切片在 PBS 中浸泡 5 min*3
DAB 显色 5-10min〔 50 微升 A+50 微升 B+900 微升 PBS+5 微升 3%H2O2 〕
如果是增强型DAB 只要 1min 即可。
切片浸入PBS 终止显色， HE 衬染 1s，
玻片架放入泡沫盒，流水冲洗15min，肉眼看到淡淡的紫色即可停顿。
假设颜色太深，可用0.1-0.5% 盐酸乙醇分色1～ 2 秒钟〔或更久〕
脱水 85% 乙醇 5 min
95%乙醇 5 min
无水乙醇5 min
无水乙醇5min
二甲苯 (1) 10min
二甲苯 (2) 10min
中性树胶封片，室温枯燥保存
4、石蜡组织切片的免疫荧光方法：
密封保存于RT 的组织切片
二甲苯 (1)20 min
二甲苯 (2)20 min
100%乙醇20min
95%乙醇10 min
80%乙醇10 min
通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈
切片在 PBS 中浸泡5 min*2
0.4%Tritonx RT10 min
切片在 PBS 中浸泡5 min*3
切片在PBS 中浸泡
5 min*3
0.25%
胰酶RT 10min
切片在
PBS 中浸泡
5 min*3
Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS)
倾去 blocking buffer，勿洗
RT 60min
一抗 4 C overnight in blocking buffer
取出切片复温1h，切片在PBS 中浸泡5 min*3
荧光二抗in blocking buffer GAR-cy3 1： 1000， GAM-4881：
1000RT 1h
DAPI 〔 1：1000 请根据二抗说明稀释二抗〕
切片在
PBS 中浸泡
5 min*3
moil
封片，避光
4C保存
