注射用培美曲塞二钠细菌内毒素检查法

注射用美罗培南有关物质测定方法学研究潘丽;李青海;苏健强【摘要】Objective:To establish a method for determining related substance in meropenem for injection.Methods: Using the method of HPLC ,the mobile phase was 0.1% three triethylamine solution∶acetonitrile (93.5∶6.5), the detective wavelength was 220 nm and the column temperature Was 40℃.Results: Meropenem was completely separated from impurity A and impurity B,the purity coefficient is greater than 0.99. Conclution: The method is sensitive,specific,accurate and reliable,it is suitable to the determination of related substance in meropenem for injection.%目的：建立注射用美罗培南有关物质的测定方法。

方法：采用HPLC 法，0.1%三乙胺溶液∶乙腈（93.5∶6.5）为流动相，检测波长为220nm，柱温为40℃。

结果：美罗培南开环物（杂质A）、美罗培南、美罗培南二聚体（杂质B）间的分离度良好，纯度系数均大于0.99。

结论：该方法简便、专属性强、重现性好，可用于注射用美罗培南的杂质检查。

【期刊名称】《北方药学》【年(卷),期】2015(000)006【总页数】2页(P2-2,3)【关键词】注射用美罗培南;有关物质;HPLC法【作者】潘丽;李青海;苏健强【作者单位】海口市制药厂有限公司海口 570311;海口市制药厂有限公司海口570311;海口市制药厂有限公司海口 570311【正文语种】中文【中图分类】R927.2美罗培南为碳青霉素烯类抗生素，对超广谱β-内酰胺酶稳定，对大部分需氧菌、厌氧菌有效。

审批及颁发：会审：分发：一、目的为确保注射用重组人生长激素药品细菌内毒素检测方法在实验条件下不对内毒素和鲎试剂的反应存在干扰作用，以保证检测结果可符合质量标准要求，特对本品细菌内毒素检测方法学进行研究并制定此验证方案。

二、范围注射用重组人生长激素药品细菌内毒素验证方案三、职责验证组织及人员职责四、术语无五、内容1 概述注射用重组人生长激素是我公司的主打产品，其属于注射剂类里面的注射用无菌粉末。

根据《中国药典》2010年版的要求，本产品需对细菌内毒素检查方法学进行验证，为了确定注射用重组人生长激素在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为能否使用细菌内毒素检查法提供依据，特制定本方案。

验证结果应显示在规定浓度下的注射用重组人生长激素对内毒素和鲎试剂的反应无干扰作用。

2 验证项目3 验证时间安排1. 2012年10月01日至 2012 年10月15日制订、审核及批准验证方案；2. 2012年10月16日至 2012 年11月 05日验证确认3. 2012年11月05日至 2012年11月 10日写出验证报告4、验证前提条件确认4.1 相关文件及人员培训确认4.1.1 相关文件确认结论: 检查人/日期：复核人/日期：4.1.2 方法确认人员确认结论: 检查人/日期：复核人/日期：4.2 验证用仪器仪表和物品有效性确认见附录3检查结果：检验人/时间：复核人/日期：4.3 鲎试剂灵敏度复核4.3.1 实验材料及用具4.3.1.1 进行细菌内毒素干扰试验验证前，所有的器具须经250℃干烤30 分钟以上，若使用塑料器械，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。

4.3.1.2 器具：移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮、旋涡混合器。

4.3.1.3 细菌内毒素工作标准品，系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

中国药典细菌内毒素检验方法
中国药典细菌内毒素检验方法中，按以下步骤进行实验。

首先，制备试样溶液。

将待测样品溶解在合适的溶剂中，并通过过滤将溶液过滤至少两次以去除杂质。

然后，制备标准溶液。

将内毒素标准品按照指定浓度配制成溶液。

接下来，准备试管。

将标准溶液和试样溶液分别装入两个试管中，并加入适量的无菌生理盐水作为空白对照。

然后，进行混合。

轻轻旋转试管混合样品，确保溶液均匀混合。

接着，培养细菌。

将特定的细菌株接种在培养基中，分别加入试管中的样品溶液，并在适当条件下进行培养。

培养结束后，观察结果。

通过观察培养基的变化，比较试管中的样品溶液和空白对照的差异，判断样品中是否存在细菌内毒素。

最后，记录结果。

根据观察结果，记录样品的检验结果，并进行数据分析。

******有限公司标准操作规程目的建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。

适用范围所有原料、成品的细菌内毒素检查。

责任人检验员内容1 简述1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。

1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。

供试品检测时可使用其中任何一种方法。

当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

1.3 本规范适用于凝胶法检查。

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。

1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位()表示1.5 细菌内毒素国家标准品()系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。

1.6 细菌内毒素工作标准品()系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(水)系指内毒素含量小于0.015灭菌注射用水。

光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005。

1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素******有限公司标准操作规程的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用表示。

当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。

1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。

阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。

2实验材料及用具2.1 天平供试品称量用，感量为0.1以下。

2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。

2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37土1℃保持一小时。

注射用美罗培南(俄罗斯）检验标准操作程序【性状】本品为白色至微黄色结晶性粉末。

【鉴别】（1）在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。

(2)取铂丝，用盐酸湿润后，蘸取供试品，在无色火焰中燃烧，火焰应呈鲜黄色。

(3)当用1mol/L的盐酸溶液溶解样品时会产生无色的气体,将此气体通入氢氧化钙溶液中会产生白色沉淀。

【检查】碱度取本品，加水制成每1ml中约含50mg的溶液，依法测定（EP2。

2。

3)二次,取平均值，pH值应为7.3～8。

3。

干燥失重取本品约0。

5g,精密称定,在65℃减压干燥6小时，减失重量应为9.0％～12。

0％（USP<731〉）。

溶液的澄清度与颜色取本品5瓶，分别加水制成每1ml中含美罗培南0.1g的溶液,溶液应澄清无色。

如显色，与黄色3号（见EP2。

2。

2)标准比色液比较，均不得更深。

可见异物取本品5瓶，加适量的澄明水使药粉全部溶解，轻轻旋转和翻转容器（注意不使药液产生气泡），置供试品于遮光板边缘处，分别在黑色和白色背景下，手持供试品颈部使药液轻轻翻转，用目检视，应符合规定。

不溶性微粒取3瓶供试品，在净化台上用水将容器外壁洗净，小心开启瓶盖,分别精密加入适量微粒检查用水,缓缓振摇使内容物溶解，小心合并瓶中的溶液,用检查用水清洗瓶内壁，全部转移至100ml量瓶中，超声处理30秒脱气后，用微粒检查水稀释至刻度，摇匀。

按不溶性微粒检查法(EP)，依法测定3次，第一次数据不计，取后续两次测定结果的平均值，计算供试品中所含的微粒数。

含10μm以上的微粒应≤4000粒/瓶,25μm以上的微粒应≤400粒/瓶。

细菌内毒素取本品适量,依法检查（USP<85>），每1mg美罗培南中含内毒素的量应小于0.125EU。

无菌取本品,加适量溶剂溶解后,转移至不少于500ml的0。

9％无菌氯化钠溶液中，用薄膜过滤法处理后,依法检查（USP〈71〉），应符合规定。

一、验证目的确保氯化钠注射液细菌内毒素检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求，特制定此方案。

二、适用范围适用于本公司氯化钠注射液的细菌内毒素检测方法。

四、内容1 实验材料及用具1.1电子天平1.2电热恒温干燥箱1.3试管恒温仪1.4水银温度计1.5旋涡混合器1.6鲎试剂供应商:批号：灵敏度：规格：1.7细菌内毒素国家标准品供应商:中国药品生物制品检定所提供批号：效价：1.8细菌内毒素检查用水供应商:批号：规格：1.9实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。

2 实验准备2.1玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用生活饮用水将残留洗液彻底洗净，再用注射用水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中，然后放置入电热恒温干燥箱。

2.2除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素玻璃器皿置电热恒温干燥箱后，将电热恒温干燥箱调至250℃，待电热恒温干燥箱温度升至设定的温度后开始计时，干烤至少1 小时。

达到规定时间后，关断电源，待电热恒温干燥箱温度自然降至室温。

在不打开金属容器的情况下，可在两天内使用,否则须再次干烤。

3 具体验证步骤3.1鲎试剂灵敏度复核3.1.1目的考察鲎试剂的灵敏度是否准确，并考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。

3.1.2操作方法3.1.2.1细菌内毒素标准溶液的制备将1支细菌内毒素标准品（140EU/支）完全溶解于1ml细菌内毒素检查用水中(置漩涡混合器上混合15分钟)，其浓度为140EU/ml，用这个浓度连续稀释制备1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml (每步稀释过程均应在旋涡混合器上混合30秒钟)四个浓度的细菌内毒素标准浓度。

3.1.2.2鲎试剂灵敏度复核操作取18支（0.1ml/支）待验证灵敏度的鲎试剂，加入适量的细菌内毒素检查用水，复溶备用。

干细胞内毒素检测标准操作规程S O P Z KThis manuscript was revised by the office on December 22, 2012干细胞内毒素检测标准操作规程（SOP）北京赛托森生物科技发展有限公司质量管理干细胞内毒素检测标准操作规程本操作程序主要参照BP2003AppendixXIVC.Testforbacterialendotoxins中MethodA.Gel-clotmethod:limittest和MethodB.Gel-clotmethod:semi-quantitativetest以及《中国药典2010版附录ⅹⅡE细菌内毒素检查法》中凝胶法，结合实验室自身条件编写而成。

2.安全注意事项由于细菌内毒素对人体有毒害作用，且鲎试剂对人的危害作用尚不明确。

因此实验过程中一定要做好防护措施。

3.检验目的检验供试品中的的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。

4.检验原理本操作程序通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量检测内毒素。

5.供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。

一般要求供试品溶液的pH值在6.0～8.0的范围内。

对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。

酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。

缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

6.供试品细菌内毒素的限值(L)药典有明确规定的按照药典规定值，如无规定需经计算得出，具体计算方法见各药典。

7.供试品最大有效稀释倍数(MVD)和最小有效稀释浓度的确定(MVC)最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数(1→MVD)，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。

用以下公式来确定MVD，MVD=cL/λ。

式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c为1ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。

85-细菌内毒素检查法u s p37(总4页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--<85>细菌内毒素试验USP37装置将用于验证过程的所有玻璃器皿和热稳定性材料置于干热灭菌箱中以除去热原。

最小灭菌时间和温度一般为30min,250°。

若需使用塑料器皿，例如微孔板或自动加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素且对试验无干扰的器械。

【注：在本章中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微量滴定管】试剂及试液阿米巴溶解产物（鲎试剂）——鲎试剂是一种由寄生于鲎（中国鲎或美洲鲎）中的阿米巴虫的溶解产物（白血细胞）获得的冻干产品。

该试剂符合有关法规要求。

【注：鲎试剂会对一些除内毒素外的β-葡葡聚糖起反应。

可利用鲎试剂不与葡聚糖反应，通过移除阿米巴溶解产物中会与葡聚糖反应的G因子或抑制阿米巴溶解产物的G因子反应系统和用于存在葡聚糖的内毒素试验。

】细菌内毒素检查用水（BET）——用注射用水或其他不与鲎试剂反应的在灵敏限度内的水。

溶菌液供试液——在缓慢搅拌下，阿米巴溶解产物（鲎试剂）溶于BET检查用水或鲎试剂生产商建议的缓冲液中，根据生产需要贮存重组的鲎试剂，冷藏或冷冻。

溶液的制备：标准内毒素储备液——标准内毒素储备液是根据包装上的说明书，制剂标签上标准内毒素储备液的储存和制备，用现行的WHO国际标准校准过的USP内毒素标准品制备的。

内毒素用EU表示。

【注：1EU=1IU】内毒素标准液——将内毒素储备液混合均匀，再用细菌内毒素检查用水对其作适当的系列稀释。

尽快使用稀释液，以避免因吸附而失去活性。

供试液——供试溶液是通过用细菌内毒素检查用水溶解、稀释药物制备。

某些物质或制剂可能在其他水溶液中被更适当地溶解、稀释。

如有必要，调节待测溶液的pH值，使鲎试剂和样品的混合物pH在由鲎试剂生产者定的pH范围内。

通常使用于pH范围在的产品。

pH的调节可以用鲎试剂生产者推荐的酸、碱或适当的缓冲液。

注射用培美曲塞二钠说明书成份本品主要成分是培美曲塞二钠，其化学名称为：N-[4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1H-吡咯[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰]-L-谷氨酸二钠二倍半水合物。

化学构造式为：分子式：C20H19N5Na2O6·2.5H2O分子量：516.41辅料名称：甘露醇。

性状本品为类白色或淡黄色疏松块状物或粉末。

适应症适用于与顺铂联合治疗无法手术的恶性胸膜间皮瘤。

规格0.2g〔按C20H19N5Na2O6计〕。

用法用量培美曲塞应该在有抗肿瘤化疗应用经历的合格医师的指导下使用。

培美曲塞只能用于静脉滴注，其溶液的配制必须按照“静脉滴注溶液配制〞的说明进展。

[u]恶性胸膜间皮瘤：[/u]培美曲塞联合顺铂用于治疗恶性胸膜间皮瘤的推荐剂量为每21天500mg/m[sup]2[/sup]，滴注10分钟，顺铂的推荐剂量为75mg/m[sup]2[/sup]滴注超过2小时，应在培美曲塞给药完毕30分钟后再给予顺铂滴注。

承受顺铂治疗要有水化方案。

具体可参见顺铂说明书。

[u]预服药物：[/u]皮质类固醇——未预服皮质类固醇药物的患者，应用培美曲塞皮疹发生率较高。

预服地塞米松〔或相似药物〕可以降低皮肤反响的发生率及其严重程度。

给药方法：地塞米松4mg，口服，每日2次，培美曲塞给药前1天、给药当天和给药后1天连服3天。

维生素补充——为了减少毒性反响，培美曲塞治疗必须同时服用低剂量叶酸或其他含有叶酸的复合维生素制剂。

服用时间：第一次给予培美曲塞治疗开场前7天至少服用5次日剂量的叶酸，一直服用整个治疗周期，在最后1次培美曲塞给药后21天可停服。

患者还需在第一次培美曲塞给药前7天肌肉注射维生素B12一次，以后每3个周期肌注一次，以后的维生素B12给药可与培美曲塞用药在同一天进展。

叶酸给药剂量：350～1000μg，常用剂量400μg；维生素B12剂量1000μg。

〔参见【考前须知】项下的“警告〞局部〕。