脲酶试验标准操作规程

一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。

2.试剂2.1尿素:GB696，分析纯。

2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红，加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液，在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀备用。

3.操作方法3.1取0.2g粉末样品，置于25mL比色管中。

3.2加0.02g尿素，加酚红指示剂2滴，再加水20mL，充分摇匀15s。

3.3记录粉红色出现时间，并根据时间判断尿酶活性，颜色出现时间应少于15min。

颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验。

样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品)，只有上述空白正常时，即酚红指示剂不改变颜色，试验结果才是可靠的。

一般企业认为7、8分钟变色较为合适。

二、半固态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨，会使酚红指示剂改变颜色。

2.试剂2.1稀硫酸（H2SO4）0.2N。

2.2尿素一酚红试剂2.2.1将1.2克酚红溶解于30ml0.2N的NaOH中；2.2.2用蒸馏水将之稀释至约300mL；2.2.3加入90g尿素（分析纯）并溶解之；2.2.4用蒸馏水稀释至2L；2.2.5加入14mL 1.0N的H2SO4或70mL o.2N的H2SO4；2.2.6用蒸馏水稀释至最后体积3L；2.2.7溶液应具明亮的琥珀色。

3.操作方法3.1在一个150ml的烧杯中倒入少量试剂，注意溶液必须呈明亮的琥珀色。

若溶液已转变为深桔红色，滴人稀硫酸溶液并搅拌之，直至溶液再度呈琥珀色。

3.2量一匙粉末样品，放置于培养皿中。

3.在样品上加入两匙试剂，轻轻搅拌，将样品平铺于培养皿中。

若仍有干样品斑点，则再加入试剂，直至将样品浸湿。

4.放置5分钟后观察：a. 没有任何红点出现：再任其放置25分钟，若仍无红点出现，说明大豆粉过熟。

b. 有少量红点：少量尿素酶活性，可用。

大豆制品中脲酶活性的测定定性法：酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。

二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不产生强烈发热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液；结晶尿素；三、方法：将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。

空白试验：不加尿素，其他同上。

品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。

•0-1min变红，活性非常强（＞1.0）；•1-2min变红，活性大概0.5-1.0；•2-5min变红，活性大概0.3-0.5。

四、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。

尿素-酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。

二、仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）三、方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。

大豆制品中尿素酶活性的测定方法
方法一尿素酶活性快速测定法——酚红法（粗略法）
1. 原理：尿素酶 +
尿素 氨气（用酚红作指示剂） 2.试剂
（1） 0.1N 氧化钠：称0.4g 氢氧化钠溶于100ml 水中。

（2） 0.1N 硫酸：将1.4ml 浓硫酸溶于l000ml 水中（先加水后加入硫酸） 3.尿素—酚红溶液：
0.14g 酚红溶于35ml 水中+7ml0.1N 氢氧化钠
混合 0.1N 硫酸滴定 琥珀色 21g 尿素溶于300ml 水中
方法：将一匙粉碎过的黄豆粕放入小玻皿中，将已调好的尿素——酚红溶液加入小玻皿中的豆粕上，直至完全锦湿，停留5min ，观察豆粕的红色反应。

稀硫酸0.2N
尿素—酚红试剂：将1.2g 酚红溶解于30ml0.2N 的氢氧化钠中，用蒸馏水将之稀释至约300ml,加入90g 尿素（分析纯）并溶解之，用蒸馏水稀释至2L ，加入14ml1.0N 硫酸或70ml0.2N 的硫酸；用蒸馏水稀释至最后体积3L ；溶液应具有明亮的琥珀色。

（过段时间溶液变为深桔红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次成为琥珀色。

方法：将一匙粉碎过的黄豆粕放入小玻皿中，将已调好的尿素——酚红溶液加入小玻皿中的豆粕上，直至完全锦湿，停留5min ，观察豆粕的红色反应。

溶液保质期最好3个月，最好一个月内用完。

实验四 脲酶活力测定（纳氏试剂比色法）一、实验原理脲酶催化尿素水解成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0 。

反应式： (NH 2)2CO+ H 2O 脲酶2NH 3 + CO 2氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比，故可用以测定服酶的活力大小。

反应式：NH 3·H 2O ＋2K 2HgI 4 + 3KOH HgO ·HgNH 2I ＋7KI + 3H 20 （纳氏试剂） （碘化氨氧合汞） 二、实验步骤将待测酶液用磷酸盐缓冲液适当稀释后，按下述顺序操作：取3 支干净干燥试管，编号：1、空白；2、标准；3、样品。

按下表步骤加入实（7）从样品管加尿素开始计时，准确反应5min ，立即向样品管（3号管）加1 mol ·L -1H 2SO 4 1.00mL ，终止反应。

（8）另取3支干净试管，分别对应于上面各反应液进行显色。

三、结果计算脲酶活力（U · mL -1) = ( A 3 - A 1 ）* 标准管中的NH 3微摩尔数 ( A 2 - A 1 ) * min * 酶样品毫升数 式中：n 为酶样品的稀释倍数 四、仪器和试剂1 、分光光度计、恒温水浴器、试管等。

2 、“有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶”实验中制备的脲酶提取液和粗酶液，用磷酸盐缓冲液适当稀释。

3 、3 ％尿素底物溶液：3g 高纯尿素用磷酸盐缓冲液溶解，并定容至100mL 。

4 、磷酸盐缓冲液（pH7.0）：6.70 g Na2HPO4 ·2 H2O , 3.25 g KH2PO4 ，溶于蒸馏水并定容至100 mL 。

5 、1 mol·L -1 H2SO4溶液：56mL 浓硫酸，缓慢加入盛有约600 mL 蒸馏水的容量瓶中，冷却后加水定容至1000mL。

6 、硫酸铵标准溶液：称取在60°C干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322g，蒸馏水溶解，并定容至100mL 。

土壤脲酶的测定方法（改良靛酚蓝比色法）一、原理以尿素为底物，经培养后根据脲酶酶促产物--氨（忽略硝化过程造成的氨氮损失）在碱性介质中与苯酚、次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚。

该生成物数量与氨浓度成正比。

后即称为靛酚蓝比色法，其结果精确性较高，重现性较好，在脲酶活性测定中的应用最为广泛。

二、试剂1）甲苯1ml/ps注：甲苯易挥发，要在通风条件好的地方操作。

2）5%尿素：称取5g尿素，用水溶至100ml。

10ml/ps3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。

将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。

20ml/ps注：柠檬酸和氢氧化钾混合时大量放热，需小心缓慢混合，冷却后定容。

4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。

将A、B溶液保存在冰箱中。

使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。

4ml/ps注：实际配比为：125g苯酚+4ml甲醇+37ml丙酮+25ml乙醇，混合溶解为A液。

54g氢氧化钠溶解为B液，冷却后备用。

A+B,定容至1000ml即得苯酚钠溶液。

苯酚有毒，常温下凝固，不宜称取，需小心。

5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。

3ml/ps注:一般次氯酸钠溶液瓶上标注为活性≥5.5%，163.64ml次氯酸钠定容至1000ml。

6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至500ml，得到1ml含有0.2mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取5ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。

二、器材50ml三角瓶，50ml容量瓶，漏斗，25ml试管，定量滤纸，振荡器，分光光度器四、操作步骤1）称取5g过1mm筛的风干土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，盖好；注：实际称取2g土。

脲酶试验标准操作规程
1．目的
规范脲酶试验标准操作规程。

2．原理
某些细菌具有脲酶，能分解尿素生成氨，使培养基变碱，酚红指示剂随之变红色。

3．试剂
3.1 尿素氮培养基成分
蛋白胨 1.0g 氯化钠2.0g
葡萄糖 1.0g 磷酸二氢钾2.0g
0.4％酚红溶液 3.0ml 琼脂18～20g
20％尿素溶液100 ml 蒸馏水1000ml
PH 7.0
3.2 制备将上述成分(除酚红、尿素外)混合于蒸馏水中，加热溶解，校正PH，加入酚红溶液，分装每瓶100ml，置120℃灭菌15分钟备用。

临用时，加热溶解，冷却至55℃左右，加入无菌的尿素溶液10ml，摇匀，无菌分装于灭菌试管，每支2ml，并置成斜面备用。

4．质控
大肠埃希菌ACTT 25922为阴性，奇异变形杆菌ACTT 49005为阳性。

5.操作步骤
将待检菌接种至含尿素培养基中，35℃孵育1～4日。

6.结果判断
红色者为阳性。

7.注意事项
所有尿素培养基均依靠出现碱性来证实，故对脲酶不是特异性的。

某些细菌如铜绿假单胞菌利用培养基的蛋白胨可分解为多量氨基酸，使PH升高呈碱性，造成假阳性。

因此必须用无尿素的相同培养基作为对照。

8.临床意义
主要应用于肠杆菌科中的变形杆菌属细菌的鉴别。

奇异变形杆菌和普通变形杆菌脲酶阳性。

一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。

1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。

（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。

称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。

使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。

（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。

（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。

（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。

2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。

在37℃恒温箱中培养24ｈ。

然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。

取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。

脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。

标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。

1h内再分光光度计上于578nm处比色。

一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。

1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。

（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。

称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。

使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。

（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。

（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。

（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。

2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。

在37℃恒温箱中培养24ｈ。

然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。

取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。

脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。

标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。

1h内再分光光度计上于578nm处比色。

脲酶Km值的测定一、[背景与目的]K m值一般可看作是酶促反应中间产物的解离常数。

测定K m在研究酶的作用机制、观察酶与底物间的亲和力大小、鉴定酶的种类及纯度、区分竞争性抑制与非竞争性抑制作用等中均具有重要意义。

当环境温度、pH值和酶的浓度等条件相对恒定时，酶促反应的初速度v随底物浓度[S]增大而增大，直至酶全部被底物所饱和达到最大速度V。

反应初速度与底物浓度之间的关系经推导可用下式来表示，即米氏方程式：对于K m值的测定，我们通常采用Lineweaver-Burk作图法，即双倒数作图法。

具体做法为：取米氏方程式倒数形式。

若以1/v对1/[S]作图，即可得下图中的曲线，通过计算横轴截距的负倒数，就可以很方便地求得K m值。

本实验从大豆中提取脲酶，脲酶催化尿素分解产生碳酸铵，碳酸铵在碱性溶液中与纳氏试剂作用，产生橙黄色的碘化双汞铵。

在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵的产量成正比。

通过分光光度计所得到的光吸收值可代表酶促反应的初速度（单位时间所产生的碳酸铵含量与光吸收值成正比）。

具体反应如下:(1)酶促反应(2）呈色反应通过本实验学习大豆脲酶的提取方法；掌握脲酶米氏常数Km的测定方法。

二、[仪器与试剂]1. 仪器(1) 721型分光光度计 (2) 恒温水浴锅2.试剂(1) 0.05mol/L尿素溶液(2) 0.1mol/LpH=7.0Tris-HCl缓冲液(3) 10%ZnSO4溶液(4) 0.5mol/LNaOH溶液(5) 10%酒石酸钾钠溶液(6) 奈氏试剂三 [实验方法]1. 脲酶提取液的制备（由老师准备）2. 取5支试管编号,按下表加入试剂和操作,加入试剂量单位为mL25℃恒温水浴，预温5min25℃恒温水浴，准确作用10min充分混匀，过滤另取5支试管，与上述离心管对应编号，如下操作混合均匀，以对照管调零，在480nm处，读取各管的A480nm值以酶促反应初速度的倒数为纵坐标（以1/ A480nm代替），以保温混合液中脲酶提取液浓度，以mol数计的倒数为横坐标，按双倒数作图法，求得K m值*[S]=每管中尿素的mol数/4.1mL×10-3（4.1mL为酶促反应总体积）五、[注意事项]（1）米氏方程系线性方程，酶促反应初速度v与光吸收值A成正比，所以用1/A代表1/v 作图求K m值，方法简便，且结果不受影响。

实验十脲酶Km值测定一、目的脲酶是氮素循环的一种关键性酶，它催化尿素与水作用生成碳酸铵，在促进土壤和植物体内尿素的利用上起有重要作用。

对其进行多方面研究，早已引起人们重视。

通过本实验，学习脲酶Km值的测定方法。

二、原理脲酶催化下列反应：在碱性条件下，碳酸铵与奈氏试剂作用产生橙黄色的碘化双汞铵。

在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵量成正比。

故可用比色法测定单位时间内酶促反应所产生的碳酸铵量，从而求得酶促反应速度。

在保持恒定的最适条件下，用相同浓度的脲酶催化不同浓度的尿素发生水合反应。

在一定限度内，酶促反应速度与脲浓度成正比。

用双倒数作图法可求得脲酶的Km值。

三、仪器、试剂和材料1．仪器（1）试管16 ×160mm 21支（2）吸管0.5ml×15，lml×1，Zml×1，10ml×1（3）漏斗5个（4）721型分光光度计（5）电热恒温水浴（6）离心机（7）康氏振荡机2．试剂（1）1／10 mol／L脲15.015g，水溶后定容至250ml。

（2）不同浓度脲液用1／10 mol／L 脲稀释成1／20、1／30、1／40、l／50 mol／L的脲液。

（3）1 ／15 mo／L pH7．0磷酸盐缓冲液Na2HPO4 5.969g，水溶后定容至250ml。

NaH2PO4 2.268g，水溶后定容至250ml。

取Na2HPO4溶液60ml，NaH2PO4溶液40ml混匀，即为1／15 mol／L pH7.0磷酸盐缓冲液。

（4）10％硫酸锌20g ZnSO4溶于200ml蒸馏水中。

（5）0.5 mol／L氢氧化钠5g NaOH，水溶后定容至250ml。

（6）10％酒石酸钾钠20g酒石酸钾钠溶于200ml蒸馏水中。

（7）0.005 mol／L硫酸铵标准液准确称取0.6610g硫酸铵，水溶后定客至1000ml。

（8）30％乙醇60ml 95％乙醇，加水130ml，摇匀。