微生物检验实验室沙门菌属标准操作规程

SMP-QC0028微⽣物鉴定管理规程⼀、⽬的：规范菌种以及控制菌检查中疑似菌的鉴定程序，以减少菌种污染和⽣长特性的改变，确保实验室安全和实验结果可靠。

⼆、范围：适⽤于实验室所⽤标准储备菌株和控制菌检查中疑似菌的鉴定。

三、职责：品质部：确保使⽤的菌株是可靠的，准确鉴别样品中控制菌，保证实验结果可靠。

四、内容：1、试验菌株:⼤肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]⾦黄⾊葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]⽩⾊念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]⿊曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]沙门菌（Salmonella）[CMCC(B)50094]2、菌种确认试验的主要内容：2.1 菌种的纯度确认。

2.1.1 试验内容。

①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同⼀平板上的单菌落的⼤⼩、形状、颜⾊、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。

②镜检特征：对数⽣长期的培养物⾰兰⽒染⾊反应应呈现⼀致性；细胞形状、⼤⼩、荚膜、芽孢等特征应相似。

2.1.2 菌种的特性确认。

⽣化试验：各种微⽣物具有各⾃的独特的酶系统，因⽽在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物⼜具有不同的⽣化特征。

根据此特征，利⽤⽣物化学⽅法来鉴定不同的微⽣物的试验即为微⽣物的⽣化试验。

2.1.3 菌种的确定⽅法。

⽤⽆菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。

培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单⼀纯菌落，进⾏⾰兰⽒染⾊、镜检，观察其染⾊特性及菌形。

范围成品、辅料、内包装袋及纯化水的检验。

责任微生物限度检验人员内容本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。

微生物计数法一、计数方法1、微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。

2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。

3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。

供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。

4、菌种及菌液的制备试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。

计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验。

菌液制备按规定培养各试验菌株。

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含%（ml/ml）聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含%（ml/ml）聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。

阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。

培养基适用性检查按照表规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。

每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。

同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。

1目的P URPOSE规范888物料、产品的沙门氏菌检验操作，确保检验结果的可靠性。

2范围SCOPE适用于888物料、产品的沙门氏菌检验工作。

3责任RESPONSIBILITY微生物检验员严格执行本规程，品质部负责人监督执行。

4程序PROCEDURE定义和原理沙门氏菌广泛存在于动物的肠道和内脏，以及被粪便污染的水和土壤中，是细菌性食物中毒的主要病因。

本方法利用沙门氏菌呈辛酸酯酶阳性，而氧化酶和脂肪酶均呈阴性的特性，对物料、产品进行沙门氏菌检验。

材料和设备紫外灯：波长366nm，功率不小于6W。

放大镜：3至4倍。

毛细滴管。

LX-B35L压力蒸汽灭菌锅。

无菌的培养皿。

无菌的接种环。

培养基和试剂SCDLP液体培养基：按《化妆品卫生规范》（2007版）或使用商品培养基干粉配制。

四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：按—2010附录配制或使用商品试剂。

SS琼脂培养基（含1%蔗糖）：牛肉浸膏(或牛肉粉)，蛋白胨，乳糖，蔗糖，胆盐，柠檬酸钠，硫代硫酸钠，柠檬酸铁，煌绿，中性红，琼脂，蒸馏水1000mL。

HE琼脂培养基：按—2010附录或使用商品培养基干粉配制。

玉米油维多利亚蓝琼脂培养基：灭菌后的基础培养基冷却至50℃左右，边摇边加入玉米油乳化液。

倾注平皿，制成平板。

基础培养基及玉米油乳化液配方如下：a）基础培养基：蛋白胨5g，酵母浸粉3g，氯化钠5g，琼脂13g，水900mL，。

将各成分加入水中，加热溶解。

调节，116℃15min高压灭菌。

b）玉米油乳化液：玉米油100mL，%维多利亚蓝水溶液100mL，%琼脂溶液80mL，吐温801mL。

玉米油加维多利亚蓝水溶液混合，边振动边在沸水中加热溶化。

然后，放入分液漏斗中，弃去蓝色水部分，再将着色的脂肪用水洗1-2次。

将着色脂肪20mL加入810mL琼脂溶液中，再加1mL吐温80，116℃15min高压灭菌。

冷却后用超声波乳化。

MUCAP试剂：取MUCAP 100mg，加纤维溶解剂溶解，再加Triton X-100 ，贮存于4℃冰箱。

微生物限度检查简易操作规程1.1微生物限度检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃，控制菌培养温度为30～35℃。

1.2 称取供试品10g，置PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml中，用匀浆仪或其它适宜方法混匀后，作为供试液。

在制备过程中，必要时可加吐温80，并适当加温，但不宜超过45℃。

1.2.1细菌计数用营养琼脂培养基，霉菌、酵母菌计数用虎红琼脂培养基。

取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板、培养、检查，不得长菌。

取均匀供试液，进一步稀释成1：102、1：103等适宜的稀释度。

分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml，置直径约90mm 的平皿中，再注入约45℃的培养基约15～20ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释度应作2～3个平皿。

1.2.2大肠埃希菌（Escherichia Coli）[CMCC (B)44 102] 取供试品10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）,直接或处理后接种至适量（不少于100 ml）的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时，必要可延长至48小时。

取上述培养物0.2ml, 接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm 紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。

若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。

观察后沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈现本色，为靛基质阴性。

本底对照应为MUG阴性。

1.2.3大肠菌群（Coliform）取含适量（不少于10ml）的胆盐乳糖培养基管3支，分别加入1：10的供试品1ml（含供试品0.1g或0.1ml）、1:100的供试品1ml（含供试品0.01g或0.01 ml）1：1000的供试品1ml（含供试品0.001g 或0.001m l）另取1支胆盐乳糖发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管。

微生物限度检查标准操作规程1.目的：建立一个微生物限度检验标准操作规程。

2.范围：本公司的药品、原辅料、器具设备、工艺流程、生产环境和操作人员。

3.职责：微生物限度检验人员对实施本程序负责。

4.规程：4.1取样：按各《取样标准操作程序》，应随机抽取不少于检验用量（两个以上最少包装单位）的3倍量供试品。

每份供试品最低应取2个以上最少包装单位，膜剂不得少于4片。

4.2 培养基的制备：按“培养基制备标准操作规程”。

4.3 稀释剂的制备：称取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液14.63g，置1000ml三角瓶中，加纯化水1000ml，摇匀，加热溶解,于121℃高压蒸汽灭菌20min，备用。

4.4检验量：除另有规定外，每份供试品最低应取2个以上最小包装单位，膜剂不得少于4片。

一般供试品的检验量为10g或10ml；中药膜剂为100cm2。

要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml（其中10g或10ml 用于阳性对照试验）。

4.5 试验前的准备：4.5.1将所有已灭菌的平皿，三角瓶、吸管、量杯、研钵、稀释剂及供试品等移至无菌室的传递窗内，打开紫外灯消毒15min，风淋10s。

4.5.2开启无菌室紫外线灭菌灯20分钟。

4.5.3关闭紫外线灭菌灯，进入缓冲一室，用肥皂洗手，换工作鞋，除外衣；进入缓冲二室，穿戴无菌衣、帽、口罩，用消毒剂消毒双手，戴上手套，进入操作间。

4.5.4开启工作台，用乙醇棉球擦手及供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌剪刀将供试品启封。

4.6操作:4.6.1供试液的制备:4.6.1.1固体、半固体或黏稠性供试品: 取供试品10g,置灭菌研钵中,以100ml稀释剂分次加入研磨,混匀使成1:10供试液。

4.6.1.2液体供试品：取供试品10ml，置灭菌锥形瓶中，加入90ml稀释剂，充分摇匀，即为1:10供试液，也可取原液作为供试液。

4.6.1.3胶囊剂和空心胶囊供试品：取供试品10g，分离囊帽与囊身，同置灭菌锥形瓶中，加100ml稀释剂。

微生物限度检查法标准操作规程一、目的：建立一个微生物限度检查标准操作规程，规范质检员的操作，保证实验的安全性、准确性。

二、范围：适用于微生物限度检查的产品。

三、责任：QC部质检员对本规程实施负责。

四、内容1.检验依据：《中国药典》2010年版二部。

2. 简述2.1.微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。

检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌数检查。

2.2.微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。

2.3.供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。

2.4.除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃2.5.检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。

3.设备、仪器3.1.设备：3.1.1.洁净实验室：微生物限度检查应有单独的洁净实验室，每个洁净实验室应有独立的净化空气系统。

结构和要求：洁净室应采光良好，避免潮湿、远离厕所及污染区。

操作间与缓冲间应有样品传递窗，出入操作间和缓冲间的门不应直对。

洁净实验室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。

墙壁与地面、天花板连接处无缝隙，不留死角。

操作间不应安装下水道。

洁净实验室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300LX。

●温度、湿度：洁净实验室内温度应控制在18～26℃，相对湿度最好在40％～60％。

●操作间：操作间应安装空气除菌过滤层流装置。

洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。

．检验沙门氏菌的原因和意义：据统计我国细菌性食物中毒中70%～80%是由沙门氏菌引起的，人一旦摄入含有大量沙门氏菌(105～(106个/g)的动物性产品，就会引起细菌性感染，进而在毒素作用下发生食物中毒导致胃肠炎、伤寒和副伤寒且沙门氏菌的传播媒介众多，肉、蛋以及食品从加工到出售的过程中都十分容易发生污染。

因此对沙门氏菌的检验事关重大。

二、检测及鉴定：沙门氏菌的检测要在二级生物安全实验室及二级生物安全柜(在负压情况下防止致病微生物气溶胶飘离实验室对实验人员及环境造成污染)中进行。

沙门氏菌典型菌落形态：生化鉴定显示：API20E 生化鉴定是根据快速酶促反应及代谢产物的检测技术发展的一种细菌编码鉴定法，广泛应用于临床、食品中革兰氏阴性杆菌的快速鉴定。

限值要求：参考CAC、ICMSF、欧盟、澳大利亚和新西兰、美国、加拿大、香港、台湾等国际组织、国家和地区的即食食品中沙门氏菌限量标准及规定，《GB29921-2013食品中致病菌限量》按照二级采样方案对所有11类食品设置沙门氏菌限量规定，具体为n=5，c=0，m=0（即在被检的5份样品中，不允许任一样品检出沙门氏菌）。

三、沙门氏菌传统检测方法的关键控制点1、样品处理尽可能缩短解冻时间，使竟争菌群生长最少，并减小对沙门氏菌的损伤致病菌取样一定要均匀并具有代表性（蛋黄蛋清混匀取样）。

2、培养基及培养方面（1）没有一种培养基可疑准确无误的筛选出沙门氏菌，必须选择多种选择性培养基同时筛选，只能说显色培养基综合选择性更强。

（2）试剂和培养基的配置一定要严格按照说明书配置，是否需要高压灭菌，添加剂用量及培养基保存条件。

（3）有1%沙门氏菌乳糖发酵阳性，为了避免漏检乳糖阳性菌必须选择不依赖乳糖的培养基，目前BS 培养基认为是最适合的。

（4）BS培养基是分离沙门氏菌的高效培养基，特别适用于伤寒类的沙门氏菌，不是所有的选择性培养基都能有效分离出伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌，BS是分离伤寒类沙门氏菌的首选培养基。

肠道沙门氏菌检测标准涉及多个方面，包括样本采集、处理、培养、鉴定以及确认等步骤。

以下是一些关键的检测标准和指南：
1. 样本采集：应按照适当的程序采集肠道样本，比如粪便样本，以避免污染。

采集的样本应当妥善保存，并尽快送至实验室进行分析。

2. 预处理：样本到达实验室后通常需要进行预处理，如稀释、富集等，以便于后续的培养和检测。

3. 培养：使用选择性培养基进行培养，以分离和增殖沙门氏菌。

培养条件需要严格控制，以确保沙门氏菌的生长。

4. 筛选与初步鉴定：通过观察菌落的形态、颜色以及生化试验对分离出的菌株进行初步筛选和鉴定。

5. 血清学鉴定：利用血清学方法对疑似沙门氏菌进行进一步鉴定，确定其血清型。

6. 分子生物学鉴定：在必要时，可以通过PCR等分子生物学技术对沙门氏菌的特定基因进行检测，以提高鉴定的准确性。

7. 抗生素敏感性测试：为了指导临床治疗，需要对分离出的沙门氏菌进行抗生素敏感性测试，以确定其对抗生素的敏感性。

8. 确认：最终的鉴定结果需要由具备资质的实验室确认，并出具相应的检测报告。

沙门氏菌检测的具体标准和操作流程可能因国家和地区的法规、实验室的技术能力以及检测目的的不同而有所差异。

因此，执行检测时应遵循当地的法规和指南，并使用经过验证的检测方法和试剂。

在食品安全和公共卫生领域，沙门氏菌检测尤为重要，以确保食品的安全性并防止疾病的传播。