DEAE-纤维素DE-32

DEAE-纤维素1 简介DEAE-纤维素，它采用平均粒径为50μm的颗粒型亲水高分子聚合物，表面又用大分子糖链接枝，使它有更高的比表面积和更好的生物兼容性，保持更高载量，同时又具有更好的分辨率。

由于比表面积大，平衡和洗脱的时间也更短。

它经过接枝即使是纯化病毒，质粒等超大分子的物质，载量基本保持不变。

本产品物理和化学稳定性好，使用寿命长，操作方便。

2 填料特征：3 应用的注意事项：3.1 色谱柱装填（1）所需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

填料可直接称量需要的量用缓冲液溶涨一小时装柱即可。

（2）在柱子下端加入20%乙醇，以除去柱子中的空气，关闭柱子出口，在柱内保留少量的20%乙醇。

20%乙醇容易产生气泡，可以在里面加1%吐温避免气泡产生。

也可以换成纯水装柱子，但是需要把填料中的20%乙醇也换成纯水，具体的方法取需要体积的填料在抽滤漏斗上进行，也可以小心倾去填料上的20%乙醇，再换成5倍体积的纯水，反复沉淀去上清，5次左右就可以用于装柱子。

（3）此填料颗粒比较细，所以一定要注意柱子要选择合适的筛网，不能漏，也可以取点填料加到筛网上试试，如果没有问题再将填料连续倒入柱子时，要用玻璃棒的紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产生，让填料先自然沉降到填料体积不再变化，而填料和上面的液体很好分层，上层溶液完全澄清，就可以开泵用适当的流速压柱子，填料体积不再变化后，再把转换头紧顶在填料上就可以平衡柱子使用。

使用的流速要小于装柱子的流速。

（4）在装柱子前，填料从冰箱中取出至少要室温放置2-3个小时，这样避免装柱子时由于温度变化而使柱子中产生气泡。

3.2 蛋白的结合样品的盐浓度和pH要尽量和平衡柱子的缓冲液一致，盐浓度过高或者pH带低也许挂不上，所以要根据自己的样品做适当调整。

3.3 蛋白的洗脱这个填料如果采用线性梯度洗脱，柱子的直径和高度比最好是大于10，数值越大越有利于分离，而且样品最好别上太多，可以按约10mg/ml上样，如果采用阶段洗脱的方法，装短粗柱子就可以，上样量也没有限制。

动物血中超氧化物歧化酶的提取与纯化动物血中超氧化物歧化酶的提取[原理]l969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。

自然界中SOD分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。

迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。

藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到SOD。

为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。

目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。

从动物血液材料中制备Cu Zn-SOD纯化工艺分为三个主要步骤：（1）原材料的预处理；（2）粗酶液的制备；（3）离子交换柱层析精制。

国内多采用Mccord和Fridovich法，其主要工艺过程为：第一步，乙醇-氯仿除去血红蛋白；第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀；第三步，离子交换柱层析精制。

[试剂和器材]1、试剂（1）3.8%（质量分数）柠檬酸三钠（2）0.9%（质量分数）氯化钠（3）95%（体积分数）乙醇（4）氯仿（5）丙酮（6）pH7.6、2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液（7）DEAE-Sephadex A-502、器材（1）猪血（2）恒温水浴（3）离心机（4）布氏漏斗、抽滤瓶（5）烧杯、量筒、搅棒（6）透析袋[方法和步骤]1、从猪血中提取SOD（1）分离血球取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心20min，收集红血球。

（2）除血红蛋白红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1～1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4000r/min离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。

多糖的提取和纯化目前，真菌多糖的提取可从子实体和采用深层培养发酵液的菌丝中分离获得，但以从子实体中提取多糖为主。

首先是将子实体粉碎，加入甲醇或乙醇乙醚1:1混合液，水浴加热搅拌1一3小时除去表面脂肪。

其次是用残渣提取多糖，常用的方法有不同温度下的水提法、稀酸提法、冷热稀碱提法。

水提法采用的较多，适合于提取水溶性多糖。

稀酸提取法适用于提取酸溶性多糖、时间宜短，温度不超过50℃，以防止糖昔键断裂。

稀碱法适合于提取碱溶性糖。

然后除去小分子杂质，常采用透析法，将多糖提取液置于半透膜透析袋中，逆向流水透析1一3天。

第四步是沉淀多糖。

大部分多糖在有机溶剂中的溶解度极小，所以可用有机溶剂来沉淀。

常用4一5倍低级醇、丙酮，一般在pH=7.0左右沉淀多糖，制得粗多糖。

最后是除去蛋白质。

除去多糖中的蛋白质常用的方法是三氯醋酸法。

得到的溶液基本上是没有蛋白质与小分子杂质的多糖混合物或单一多糖。

多糖的纯化是将多糖混合物分离为单一的多糖。

纯化方法很多，主要纯化方法有:(l)分步沉淀法根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比例由小而大加入这些醇或酮分步沉淀。

此法适用于分离各种溶解度相差较大的多糖。

(2)盐析法根据不同多糖在不同浓度盐中具有不同溶解度而分离。

纯度鉴定和分子量测定多糖纯度标准不能用通常化合物纯度标准来衡量，因为我们所说的多糖纯品实质上是一定分子量范围内的均一组成。

因此，测得的分子量一般为平均分子量。

过去常用粘度法、蒸气压渗透计法、沉降法、超速离心法、光散射法等测定高分子化合物分子量的方法测定真菌多糖的分子量，但由于这些方法测定起来比较麻烦，且误差较大，现多数已不采用。

目前实验室常用的方法为凝胶过滤法和高压液相色谱法，对于分子量小于1百万的多糖用高压液相法为最好。

1.2.1发酵、提取取香菇465菌株斜面菌种接人摇瓶培养基中振荡培养，逐级扩大培养至10O0L，25℃下通气培养72h，压滤，得香菇深层培养菌丝体。

实验八血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G （Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。

血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。

分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。

在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。

本实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。

其原理及操作如下：㈠硫酸铵盐析1.试剂饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4760g,加蒸馏水至1000ml，加热至5℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。

（内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4磷酸缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0）溶液30.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4ml，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000ml。

磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。

2.操作①取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH7.0）5ml，混匀，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4ml（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。

静置20min，以3000r/min 离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。

②取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml（方法同前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min 离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。

DEAE-纤维素提取法纯化多克隆抗体该法提取IgG简便，既可小量提取，•也可大量制备。

1．批量提取法称取DEAE-纤维素（DE32或DE52）50g，置于1000ml烧杯中，•先以蒸馏水漂浮除去细颗粒，再经酸碱处理后，用0.01～0.05mol/L，pH8.0•左右的磷酸盐缓冲液（PB）平衡。

将水分抽干，或用布氏滤斗（内放两层滤纸）过滤，收集湿纤维素，•以降低其离子强度。

按1ml血清加湿重5g DEAE纤维素，经过充分搅拌，置4℃吸附1h。

•上清液可再如此处理一次，即获得较纯的IgG。

该法提取IgG简便，既可小量提取，•也可大量制备。

2．Tris-Cl离子交换层析法（Ion-exchange chromatography）【材料和试剂】（1）DE32或DE52纤维素。

（2）HCl；NaOH；0.01～0.05mol/L，pH8.0 PB；0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl；0.5mol/L NaCl。

（3）待纯化标本：杂交瘤腹水或培养上清，免疫血清或饱和硫酸铵粗提品。

（4）1.550cm 层析柱；透析袋；紫外分光光度计及其他透析和层析所需的试剂和器材。

【操作步骤】（1）DE52纤维素的处理：DE52经酸、碱处理，0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡。

（2）装柱：将层析柱固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出口接一细塑料管并关闭出水。

将浸泡于0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl中的DE52沿玻璃棒倒入柱中，待DE52自然沉降3～5cm高时，吸除0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl，或松开出水口螺旋夹•，控制流速1～2ml/min，同时连续加入DE52至所需高度。

待DE52完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片。

（3）平衡：松开出水口螺旋夹，以0.01mol/L，pH8.6 Tris-Cl平衡，控制流速为15•滴/min，待流出液与洗脱液之pH值达到一致时，停止平衡。

动物血中超氧化物歧化酶的提取与纯化一、超氧化物歧化酶的提取［原理］1969年，McCord和Fridovich第一次从牛血中提纯到超氧化物岐化酶。

自然界中SOD 分布极广，其含量随生物体的不同而不同，即使同一种生物的不同组织或同一组织的不同部位，其SOD的种类和含量也有很大差别。

迄今为止人们已从细菌，真菌、原生动物。

藻类、昆虫、鱼类、植物和动物等各种生物体内分离得到吧OD。

为拓宽提取SOD的原料，筛选或基因过程开发产SOD量较高的菌株。

目前，研究开发最多的资源还是从动物血液、动物组织中制备提纯SOD。

从动物血液材料中制备CuZn-SOD纯化工艺分为三个主要步骤：（1）原材料的预处理；（2）粗酶液的制备；（3）离子交换柱层析精制。

国内多采用Mccord和Fridovich法，其主要工艺过程为：第一步，乙醇-氯仿除去血红蛋白；第二步，有机溶剂和硫酸铵分级沉淀；第三步，离子交换柱层析精制。

［试剂和器材］1、试剂3.8%（质量分数）柠檬酸三钠；0.9%（质量分数）氯化钠；95%（体积分数）乙醇；氯仿；丙酮；pH7.6、2.5mmo1/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液；DEAE-SephadexA-502、器材猪血；恒温水浴；离心机；布氏漏斗；抽滤瓶；烧杯、量筒、搅棒等；透析袋［方法和步骤］1、从猪血中提取SOD（1）分离血球取新鲜猪血，加入到3.8%柠檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为3：1，轻轻搅拌均匀，4000r/min离心20min，收集红血球。

（2）除血红蛋白红血球用3倍体积生理盐水洗涤，4000r/min离心20min，重复三次，然后向洗净的红血球加入1〜1.1倍体积去离子水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，静置1h，然后4000r/min 离心20min除去变性血红蛋白沉淀，取清液，过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。

D E A E纤维素使用说明集团文件版本号：（M928-T898-M248-WU2669-I2896-DQ586-M1988）DEAE-纤维素1 简介DEAE-纤维素，它采用平均粒径为50μm的颗粒型亲水高分子聚合物，表面又用大分子糖链接枝，使它有更高的比表面积和更好的生物兼容性，保持更高载量，同时又具有更好的分辨率。

由于比表面积大，平衡和洗脱的时间也更短。

它经过接枝即使是纯化病毒，质粒等超大分子的物质，载量基本保持不变。

本产品物理和化学稳定性好，使用寿命长，操作方便。

2 填料特征：3 应用的注意事项：3.1 色谱柱装填（1）所需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

填料可直接称量需要的量用缓冲液溶涨一小时装柱即可。

（2）在柱子下端加入20%乙醇，以除去柱子中的空气，关闭柱子出口，在柱内保留少量的20%乙醇。

20%乙醇容易产生气泡，可以在里面加1%吐温避免气泡产生。

也可以换成纯水装柱子，但是需要把填料中的20%乙醇也换成纯水，具体的方法取需要体积的填料在抽滤漏斗上进行，也可以小心倾去填料上的20%乙醇，再换成5倍体积的纯水，反复沉淀去上清，5次左右就可以用于装柱子。

（3）此填料颗粒比较细，所以一定要注意柱子要选择合适的筛网，不能漏，也可以取点填料加到筛网上试试，如果没有问题再将填料连续倒入柱子时，要用玻璃棒的紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产生，让填料先自然沉降到填料体积不再变化，而填料和上面的液体很好分层，上层溶液完全澄清，就可以开泵用适当的流速压柱子，填料体积不再变化后，再把转换头紧顶在填料上就可以平衡柱子使用。

使用的流速要小于装柱子的流速。

（4）在装柱子前，填料从冰箱中取出至少要室温放置2-3个小时，这样避免装柱子时由于温度变化而使柱子中产生气泡。

3.2 蛋白的结合样品的盐浓度和pH要尽量和平衡柱子的缓冲液一致，盐浓度过高或者pH带低也许挂不上，所以要根据自己的样品做适当调整。

DEAE-纤维素DE-52/DE-32货号:C8930/D8900产品简介:DEAE-纤维素，它采用平均粒径为50µm的颗粒型亲水高分子聚合物，表面又用大分子糖链接枝，使它有更高的比表面积和更好的生物兼容性，保持更高载量，同时又具有更好的分辨率。

它经过接枝即使是纯化病毒，质粒等超大分子的物质，载量基本保持不变。

填料特征：特点载量大，分辨率好，使用方便。

性状白色或淡黄色纤维结块状基质高度交联纤维素配基二乙基氨基乙基配基密度40μmol/ml吸附载量110mg HSA/ml填料的颗粒大小50μm最大流速100cm/hpH范围3-10，在位清洗时pH范围可到2-11化学稳定性各种缓冲液及盐，0.1M NaOH及醋酸等物理稳定性0.1M中性缓冲液中，120℃30min保存温度4℃注意事项：1、色谱柱装填(1)所需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

填料可直接称量需要的量用纯净水溶涨一小时装柱即可，如果不好溶胀，可适当用热水溶胀。

溶胀好把凝胶中的酒精洗掉(2)在柱子下端加入纯水装柱子，以排除气泡。

(3)此填料颗粒比较细，所以一定要注意柱子要选择合适的筛网，不能漏，也可以取点填料加到筛网上试试，如果没有问题再将填料连续倒入柱子时，要用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产生，让填料先自然沉降到填料体积第1页，共2页不再变化，而填料和上面的液体很好分层，上层溶液完全澄清，就可以开泵用适当的流速压柱子，填料体积不再变化后，再把转换头紧顶在填料上就可以平衡柱子使用。

使用的流速要小于装柱子的流速。

(4)在装柱子前，填料从冰箱中取出至少要室温放置2-3个小时，这样避免装柱子时由于温度变化而使柱子中产生气泡。

2.蛋白的结合样品的盐浓度和pH要尽量和平衡柱子的缓冲液一致，盐浓度过高或者pH过低也许挂不上，所以要根据自己的样品做适当调整。

3.蛋白的洗脱如果采用阶段洗脱的方法，装短粗柱子就可以，阶段洗脱容易放大，重复性好。

DEAE-纤维素DEAE-纤维素DEAE celluloseDEAE-纤维素DEAE cellulose 为二乙氨乙基纤维素。

是阴离子交换纤维素之一。

DEAE—纤维素的活化：称取IgDEAE32或52，放入5ml量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE的体积。

根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE的用量，称取所需DEAE用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。

抽干，用过的离子交换剂可以反复使用，使其恢复原状的方法俗称“再生”。

再生并非每次用酸、碱反复处理，通常只要“转型”处理即可。

所谓转型就是使交换剂带上所希望的某种离子，如希望阳离子交换剂带上NH+4则可用NH4OH浸泡，如希望阴离子交换剂带上Cl—则用NaCl溶液处理。

本实验中DEAE—纤维素在酸碱处理后，用0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲溶液浸泡即可转型，以HPO4取代DEAE中的OH—。

一般由于DEAE—纤维素使用后因带有大量杂蛋白，所以再生时，先用0.5ml/L NaOH 浸洗，用无离子洗至pH8左右，再转型，即可再使用。

我们公司生产石花菜琼脂糖，在中科院多位教授的指导下研出优质的琼脂糖，超于进口的，并且在中科院实验室使用，效果非常好。

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Deae纤维素是一种阴离子交换剂，呈纤维状或颗粒状，为柱层析分离材料，交换基团为-O-CH2-CH2-N(C2H5)2是离子交换纤维素中使用最为广泛的一种，主要用于分离中性和酸性蛋白、多糖、核酸等物质。

使用参考指标：水分<15% 、交换容量 1mmol 床体积约为8ml/g（视溶液的PH值填充的压力不同而不同）PK值为9.1-9.5 适用PH值<8.6 。

/html/201109/3567688.html1.DE23（纤维状DEAE-纤维素）在去除细末后流速加快，适合用于负极生物聚合物DE32（干燥细颗粒DEAE-纤维素）功能如同DE52，但需预处理DE51（预溶胀细颗粒DEAE-纤维素）世上用是最广泛的DEAE纤维素填料，用于带低到高负极电荷生物聚合物，呈现优异的分辨率和良好的流速。

DE53（预溶胀细颗粒DEAE-纤维素）部分季铵化DEAE阴离子交换剂，具有比DE52更高取代和载量，能与DE51和DE52同时使用。

2.等电点7.2算是中性的，对于阴离子交换层析来说，你选用TRIS-HCL就行了，可以用8.5或者9.0的pH体系。

你最好别用7.8，这与你的等电点只差0.6，不一定能吸附得好，最好是差别有1个单位，就是8.2以上的。

蛋白质带的表面比净电荷越多，吸附得越强，要使用氯化钠的浓度越高才能洗脱，你如果选用7.8，那么不单只吸附不好，还比较容易洗脱下来，可能有点难与其它蛋白质分开。

缓冲系统所用的盐也是有离子强度的，所以不能选用浓度太大。

20mM TRIS-HCL 的电导率大概为1.5%，你别用太高了。

样品里的盐也最好去除得比较干净，因为如果盐浓度太高，会使得离子强度高，蛋白质没有被吸附就已经被洗脱了，吸附不上的。

3. 离子交换层析吸附蛋白质是依靠配基与蛋白质结合的，如果填料装填紧密，那么蛋白质会立即与空位的配基结合而被吸附，如果上柱洗脱得不集中，可能是填料装填得不紧密，蛋白质在填料的空隙走空，未能与配基接触。

层析柱能吸附的蛋白质量与蛋白质样品的体积无关，只与蛋白质含量有关，理论上只要蛋白质不超过配基量即可，所以蛋白质样品体积与层析柱体积没有必然关系。

我用柱床体积为20毫升的预装柱吸附过体积为350毫升的蛋白质样品，而淀粉酶不在穿透液中，全部在洗脱液中，原因就是层析柱的配基能全部吸附淀粉酶，无视样品体积。

PEG是线性分子，会在层析柱中残留，引起堵塞。