实用ELISA教程

ELISA试验方法ELISA试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），也称酶联免疫吸附试验，是一种常用于检测抗原或抗体的敏感且特异性的实验方法。

ELISA试验既可以用于研究基础科学，也可以应用于诊断医学、生物制药、科研开发等领域。

第一步：固相吸附首先，将特异性抗原或抗体加入固相载体，如微孔板或磁珠，通过吸附作用将其固定在载体上，形成固相。

然后，将未被吸附的地方进行阻断，例如使用牛血清蛋白（BSA）或胸腺素等阻断剂来封闭非特异性结合位点，减少非特异性结合。

第二步：样品加入将待检样品加入固相，并充分与特异性抗原或抗体反应。

如果待检物是抗原，则待检样品中存在的特异性抗体会与固相上的抗原结合。

如果待检物是抗体，则待检样品中存在的抗原会与固相上的抗体结合。

第三步：洗涤通过反复洗涤固相，去除非特异性结合的物质，确保只有特异性结合物留在固相上。

典型的洗涤液包括缓冲盐水或洗涤缓冲液。

第四步：二抗加入将经过酶标记的二抗加入固相，使其与特异性结合的抗原或抗体结合。

酶标记的二抗可以与特异性结合物形成二抗-抗原或二抗-抗体复合物。

第五步：洗涤再次进行洗涤步骤，去除非特异性结合的酶标记的二抗，确保只有特异性结合的复合物留在固相上。

第六步：底物加入将含有底物的反应物加入固相，使其与酶标记的二抗发生反应。

底物与酶标记的二抗之间的反应产生颜色变化，即可定性或定量检测待检物质的存在和浓度。

第七步：反应停止通过加入反应停止剂，停止酶反应，阻止进一步的底物转化为产物。

产物的生成量与待检物质的浓度成正比。

最后，通过光度计或酶标仪等检测设备，测量产生的颜色变化的光密度，可以定性或定量计算待检物质的存在和浓度。

ELISA试验具有高度的敏感性和特异性，能够检测低浓度的抗原或抗体。

它的操作简单、重复性好，广泛应用于生物医学研究、临床检测、植物检测、食品检测等领域。

不过需要注意的是，ELISA试验的结果受到很多因素的影响，如抗体的质量和纯度、试剂的质量和保存条件等，因此在进行ELISA试验时需要严格控制实验条件，保证结果的准确性和可重复性。

酶联免疫吸附试验（ELISA）的程序第一节间接ELISA试验一用可溶性抗原的ELISA：1、纯化抗原：用包被液稀释至1—20ug/ml；2、以50—100ul/孔量加入酶标板孔中；3、置4（度）过夜或37（度）吸附3h；4、PBST洗三次；5、每孔200ulPBS/NCS 4（度）过夜封闭或37（度）封闭3h；6、PBST洗5次，每次1min（包被板可—20（度）或许（度）保存备用）7、每孔加50—100ul第一抗体，同时设阳性、阴性对照。

若杂交瘤筛选，每孔加杂交瘤培养上清；8、37（度）孵育2h9、PBST洗5次，每次5min10、每孔加50—100ul酶标第二抗体；若杂交瘤筛选，每孔加HRP 标记的抗小鼠（IgG+IgM）抗体；11、37（度）孵育2h12、PBST洗5次，每次数5分钟；13、每孔加OPD 或TMBS底物100ul14、37（度）避光作用；（OPD为10—20）分钟，TMBS为40分钟）；15以50ul2MH2SO4终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值（OPD 底物选用490nm滤光片，TMBS底物选用450nm滤:光片）；16结果判定：（1）P/N≥2.1 为阳性(2) P≥N+3SD 为阳性成功范例:NDV单抗检测，粘附素单抗检测，H单抗检测亚类鉴定和鸡白痢检疫等。

二、用全菌抗原的ELISA法（一）GA法1、新鲜培养的细菌用蒸馏水悬浮，光密度法或比浊法调整细菌浓度至1X10（6）个/ml。

注意：沙门氏菌等人畜共患病原体，使用前必须灭活或采用市售的灭活诊断菌液；2、酶标板中加200ul/孔，5%戊二醛（GA）溶液（0.1M NaHCO4 95ml+25%DNY戊二醛溶液5ml）;37(度);2小时3、蒸馏水洗5次;4、加细菌悬浮液,50ul/孔;5、37(度)温箱内过液,干燥吸附(20—24h)6、加PBS/NCS 220ul/孔37（度）封闭3小时或4（度）过夜封闭；7、PBST洗5次（—20（度）或4（度））存放备用；8、以下步骤同一。

ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验方法，用于检测和定量分析特定抗原或者抗体的存在。

本操作规程旨在提供一套标准化的ELISA实验步骤，以确保实验的准确性和可重复性。

二、实验材料1. 96孔ELISA板2. 酶标仪3. 微量移液器和相应的可调移液器架4. 基质溶液（PBS等）5. 抗原或者抗体样品6. 酶标记的二抗7. 洗涤缓冲液8. 底物溶液9. 住手液三、实验步骤1. 准备工作a. 将96孔ELISA板放置在可调移液器架上。

b. 准备基质溶液，并将其加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。

c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，以避免溶液的蒸发。

2. 样品处理a. 将待测样品加入ELISA板的相应孔中，每孔100μL。

b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使样品均匀分布。

c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。

3. 一抗孵育a. 将酶标记的一抗加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。

b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使一抗均匀覆盖样品。

c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。

4. 洗涤步骤a. 将洗涤缓冲液加入ELISA板的每一个孔中，每孔200μL。

b. 轻轻拍打ELISA板，使洗涤液充分覆盖孔底。

c. 倒掉洗涤液，重复以上步骤3次。

5. 二抗孵育a. 将酶标记的二抗加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。

b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使二抗均匀覆盖样品。

c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。

6. 洗涤步骤a. 重复步骤4中的洗涤步骤，以去除未结合的二抗。

7. 底物反应a. 将底物溶液加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。

b. 将ELISA板盖好，轻轻摇动，使底物均匀覆盖样品。

c. 将ELISA板放置在酶标仪中，孔底朝上，孔盖向下。

8. 反应住手a. 在适当的反应时间后，将住手液加入ELISA板的每一个孔中，每孔100μL。

ELISA方法的及步骤
ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay）是一种免疫分析的方法，也叫酶标免疫分析，是在免疫学及其它生物领域中常用的分析技术，通过酶，抗体和抗原等物质的反应来测定其中一种物质的存在量及含量。

1、准备样品
首先将样品放入微孔板中，根据所需的数量准备多个样品，如果样品太浓，可以把它们降解成所需的浓度；如果样品太稀，可以根据需要加以稀释。

2、准备抗体和抗原
分别准备抗体和抗原，其中抗体是用来特异性结合抗原的，并起到抗原的定位、分析的作用，而抗原是根据需要溶解在其中一种介质(Buffer Solution)中，通常是立即使用；如果出于其中一种原因不能立即使用，可以先保存冰上，在使用前加热到室温。

3、准备链式反应物
将抗体和抗原分别加入微孔板中，同时把链式反应物加入微孔板中，链式反应物也叫链式抗体，可以促进抗体和抗原之间的反应，一般抗体和抗原均可与链式反应物发生反应，这样可以提高反应的准确性及灵敏度。

4、酶标偶联反应
将已准备的样品、抗体、抗原和链式反应物放入微孔板中，用摇床摇匀即可进行酶标偶联反应，反应的原理是：抗体和抗原发生特异性结合，当抗体和抗原结合后，其中的链式反应物与抗原结合。

ELISA方法详细过程及步骤ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用于测定生物样本中特定分子的定量方法。

它结合了免疫化学和酶学原理。

下面是对ELISA方法的详细过程及步骤的完整版说明：1.准备工作：首先，准备实验室材料，包括ELISA板、试剂、标样、洗涤液、试管、酶标板读取器等。

确保所有物品都是干净且无污染的。

2.涂覆抗原或抗体：将要测定的抗原或抗体在ELISA板的孔中涂覆。

可以将抗原或抗体溶液加入每个孔中，然后在37°C的恒温箱中孵育2到4个小时，以便其吸附在板上。

3.孔的封闭：将孔洗涤掉未吸附的物质，并用阻断液封闭孔，以防止非特异性结合。

4.样本和标准品的加入：将待测样本和不同浓度的标准品加入对应的孔中。

将ELISA板返回恒温箱，孵育一段时间，使样本和标准品中的抗原或抗体与固相相结合。

5.洗涤：将洗涤液加入孔中，用洗涤机或手动洗涤涡流器洗涤孔，以去除未结合的物质。

6.加入检测抗体：加入检测抗体，该抗体具有与待测物质结合的亲和性。

将ELISA板返回恒温箱进行孵育，使检测抗体与待测物质结合。

7.洗涤：重复第5步中的洗涤步骤，以去除未结合的检测抗体。

8.加入次级抗体：加入与检测抗体结合的二抗，通常是与酶结合的抗体。

这个二抗具有抗体结合和酶活性。

9.洗涤：重复第5步中的洗涤步骤，以去除未结合的次级抗体。

10.反应底物：加入染色底物，它通常是可以与酶发生反应并产生可见信号的底物。

11.反应停止：通过加入停止液，中止底物的反应并停止信号的产生。

12.读板：使用酶标板读取器，在特定波长下测量每个孔的吸光度。

这个吸光度与待测样本中目标物质的含量成正比。

13.数据分析：根据标准曲线，计算出待测样本中目标物质的浓度。

总结：ELISA方法是一种常用的免疫学定量方法，它可以用于测定生物样本中特定分子的含量。

在ELISA方法中，首先将待测物质（抗原或抗体）固定在ELISA板上，然后加入待测样本和标准品，进行孵育和洗涤的步骤，以去除未结合物质。

ELISA操作步骤酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测抗原或抗体的存在和浓度。

双抗体夹心法是ELISA的一种常见方法，也被称为间接ELISA。

该方法通过将待测抗原与特异性抗体结合，然后将该复合物夹在两种抗体之间，从而实现检测目标物的定量。

以下是ELISA操作步骤（双抗体夹心法）：1.准备所需试剂和设备，包括等量酶联免疫吸附试剂，洗涤缓冲液，检测抗体，底物液和浓缩液。

2.预先涂上酶标板：用特异性抗体溶液将酶标板的孔涂覆。

将抗体溶液加入每个孔中，然后在常温下孵育2小时或过夜在4°C下孵育。

孵育结束后，将溶液倒掉，然后用洗涤缓冲液洗涤掉未结合的抗体。

3.加入待测样品：将待测样品加入酶标板中，然后在常温下孵育1小时。

孵育结束后，倒掉孵育液，并用洗涤缓冲液洗涤掉未结合的样品。

4.加入检测抗体：将检测抗体加入酶标板孔中，然后在常温下孵育1小时。

检测抗体可以与目标物中的特异性抗体结合，并形成夹心复合物。

5.加入底物液：将底物液加入每个孔中，然后在室温下孵育20-30分钟。

底物液通常含有染色剂，当底物液与酶产生反应时，颜色会发生变化。

6.停止反应：在孵育结束后，加入停止液停止反应。

停止液会改变底物液的pH值，从而停止酶的反应。

这将保持颜色稳定，并允许结果的定量测量。

7.结果分析：使用酶标仪读取每个孔的吸光值。

这些吸光值可以用于计算样品中目标物的浓度。

通常，在酶标板上设置标准曲线，用于根据吸光值确定目标物的浓度。

8.清洗：在每个步骤之后，用洗涤缓冲液充分清洗酶标板。

洗涤的目的是去除未结合的试剂和非特异性物质，以确保结果的准确性。

9.数据处理和统计分析：根据读数结果计算样品中目标物的浓度，并进行统计分析。

常见的统计方法包括均值、标准差和方差。

以上是双抗体夹心法ELISA的一般操作步骤。

在实际操作中，可能会根据具体要求进行一些调整和优化。

同时，实验室安全操作规范和个性化要求也需要被遵循和注意。

ELISA间接法检测抗体效价实验原理：ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），酶联免疫吸附实验。

指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上，进行免疫反应的定性和定量方法。

ELISA操作过程：（一）抗原包被（蛋白包被浓度一般是0.5 ug-10 ug）①准备ELISA酶标板，根据检测的量包被抗原。

②用包被液（NaHCO3-Na2CO3溶液）梯度稀释抗原，包被100 ul/孔，设置双复孔。

③用保鲜膜密封酶标板，盖上盖，放在装有湿棉花的饭盒中，4℃过夜（16h-24h）。

（二）洗涤①取出酶标板，弃掉保鲜膜，甩掉其中液体，吸水纸上拍干。

②加入洗涤液，300 ul/孔，震荡，室温放置3 min。

甩掉其中液体，吸水纸上拍干。

③共洗涤3次。

④用纯水再洗两次。

（三）封闭①用PBS配制好5%的FBS溶液（封闭液，现用现配）。

②洗涤后加入封闭液300 ul/孔。

③保鲜膜密封酶标板，装饭盒中，37 ℃培养箱2h。

④封闭之后无需洗涤。

（四）一抗孵育①封闭快好前的30分钟准备好一抗（单克隆抗体），用封闭液稀释，稀释梯度1：1000，1：3000，1：9000，1：27000。

同时设置空白组（空白封闭液），阴性对照组（未免疫细胞上清），阳性对照组（多抗）。

②加入一抗100 ul/孔。

③孵育：37℃，1h。

（五）洗涤（六）二抗孵育①用封闭液稀释二抗，二抗稀释度是1：3000。

②洗涤后，加入二抗，100 ul/孔。

③孵育：37℃，45 min。

（七）洗涤（洗涤五次，再用纯水洗涤两次）（八）底物显色①配制底物液（一块板用量，96孔，10 ml）：1×甲液4.86 ml +1×乙液5.14 ml + 4 mgOPD（3-4粒），迅速混匀。

待充分溶解后加入30% H2O2 50ul 即可。

注：OPD（邻苯二胺）有致癌性，操作时应戴手套。

底物液需现用现配，H2O2最后加，不然过一会儿就变黄了。