人脐带间充质干细胞的分离、培养及其肝细胞生物学特性分析

脐带源间充质干细胞的分离和生物学性状吕璐璐1,2,刘拥军2,许贞书1,王 彤2,张浪辉1,朱雄鹏1,梁琳慧2,王 晗2,陈志哲1,韩忠朝2摘要: 目的 建立从脐带分离间充质干细胞的方法,并研究其生物学性状。

方法 脐带经酶消化后于DM EM -L G/F -12培养基中培养,倒置显微镜及电镜观察细胞形态学,细胞计数绘制细胞生长曲线,计数成纤维细胞集落形成单位(CFU -F ),流式细胞仪测定细胞周期及细胞免疫表型,免疫组织化学染色及RT -P CR 检测其体外诱导成脂肪和成骨分化的能力,R T -PCR 检测其细胞因子的分泌,与脐血来源CD34+细胞共同培养检测其支持造血的能力。

结果 经酶消化后,每cm 脐带可得到中位数为1.01@106的有核细胞,CFU -F 产率为1/1609有核细胞,经贴壁传代可分离出成纤维样细胞,细胞倍增时间为(28.02?10.53)h 。

流式细胞仪分析细胞周期显示,>80%的细胞处于G 0/G 1期,S +G 2+M 期的细胞仅占(13.04?4.31)%。

免疫表型分析显示,CD13、CD29、CD44、CD105(SH 2)、CD73(SH 3)、CD166和M H C -I 阳性,CD45、CD34、CD38、CD31和M HC -Ⅱ阴性。

体外诱导实验证实,该细胞具有成脂肪和成骨分化的能力。

RT -P CR 显示,该细胞表达干细胞因子、血小板生成素,酪氨酸激酶受体配基、白细胞介素-6、巨噬细胞集落刺激因子、白血病抑制因子、基质细胞衍生因子和血管内皮细胞生长因子,不表达白细胞介素-3。

与脐血来源CD34+细胞共同培养2周可见鹅卵石形成区,共培养8周证实其支持长期造血能力。

结论 建立从脐带中分离间充质干细胞的方法,脐带是间充质干细胞的新的来源。

关键词: 间充质干细胞;脐带;多能干细胞中图分类号: R331.22 文献标识码: A 文章编号: 1672-4194(2006)02-0099-06收稿日期:2006-01-25 修回日期:2006-02-13基金项目:国家863计划(2003AA205060)、973重大基础研究项目(001CB5101)和国家自然科学基金资助项目(30300186)作者单位: 1.福建医科大学附属协和医院、福建省血液病研究所,福州 3500012.泰达国家干细胞中心,中国医学科学院、中国协和医科大学血液学研究所,天津 300020作者简介:吕璐璐(1973~),女,主治医师,福建医科大学2003级博士研究生通讯作者:韩忠朝间充质干细胞(M SC)是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞,因其在组织工程、造血干细胞移植以及基因治疗领域的潜在应用,成为干细胞研究的热点。

人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【摘要】目的：探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。

方法收集健康足月新生儿脐带组织，采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面抗原，将细胞冻存3个月后复苏，鉴定复苏后细胞的特性。

结果组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高；细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105，不表达造血干细胞表型CD34、CD45等；冻存后再复苏细胞活性高达80％～90％。

结论组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞，为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。

%Objective To exploreisolating,culturing,identifying,freezing and thawing mesenchymal stem cells(MSCs)approach from Wharton j elly of human umbilical cord.Methods The MSCs were isolated from neonate umbilical cord,cultured by tissue explants adherent method.The surface markers were identified by flow cytometry.Passage cells,frozen 6 months, were thawed,then their biological characteristics were identified.Results MSCs were easily obtained from Wharton j elly of human umbilical cord via the proposed approach of tissue adherence.The flow cytometry analysis showed that MSCs expressed CD29,CD44,CD90 and CD105 positively,but negatively for CD34,CD45.The living cells of MSCs were 80%-90% after having been frozen and the thawed cells had the same characteristics as the previous.Conclusion MSCs can be successfully isolated from Wharton j elly of human umbilical cord by this method. The stem cells derived from Wharton j elly of humanumbilical cord may be a novel alternative source of human MSCs for experimental and clinical applications.【期刊名称】《河北医科大学学报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】3页(P21-23)【关键词】脐带;间充质干细胞;胎血【作者】韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【作者单位】河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军白求恩国际和平医院药剂科，河北石家庄 050082;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军第二六○医院病理科，河北石家庄 050041【正文语种】中文【中图分类】R394.2干细胞是一群具有自我更新和分化潜能的细胞，根据发育状态可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。

4 Hochedlinger K , Y amada Y , Beard C , et al. Ectopic expression of O ct-4 blocks progen-i t or-cell dif ferentiat ion an d causes dysplasia in epith elial t issues. Cell, 2005, 121: 465-477.
7 M itchell K E, W eiss M L, M itch ell BM , et al. M at rix cells f rom Whart on. s jelly f orm neurons and glia. St em Cells, 2003, 21: 50-60. ( 收稿日期: 2005-07- 25)
一、材料和方法 . 材料: 脐带 取自 天 津市 中 心 妇产 医院足月剖 宫产 新生 儿, 均 经父 母 授权 同意。 2. 细胞 分 离扩 增: 将 脐带 从 手 术台 上取下, 剪 碎至 1 mm3 大 小 组织 块。组 织块接种于 DM EM / F12 培养基中, 放置 于饱和湿 度孵 箱内培 养, 1 周后, 去 掉组 织块 更 换 培养 基。 细胞 长 到 80% 融 合 时, 0. 25% 胰蛋白酶消化, 传代培养。 3. 细胞表 面分 子标 志检 测: 取第 3、 5、10 代 的 脐带 MSC ( UCM SC) , 胰蛋 白 酶消化后制 成单细胞悬 液。分别 加入抗 人 CD13- PE、CD14- FIT C、CD31- PE、 CD34- PE、CD45- PE、CD11a- P E、CD29PE、CD105- FI T C、CD106- PE 单抗各 5Ll。 4 e 孵育 30 min, 流式细胞仪检测。 4. 细胞 周期 测 定: 分 别取 第 3 代及 第 8 代 U CM SC, 消化 后 离心, 磷 酸 盐缓 冲液( PBS) 漂洗, 50 mg/ L 碘化丙 锭标记 细胞, 100 mg/ L RNA 酶处理。流式细胞 术检测细胞周期。 5. RT- PCR 检 测: 取 3 @ 106 第 3 代 细胞, 以 T r izol 提 取 总 RNA , 逆 转 录 为 cDN A, 测 O CT- 4 基 因 表 达。引 物 序 列 为: Pr imer15.- GACA ACAA T AGAGAA C-

Ａ Ｓ Ｒ Ｃ Ｏｂｅｔ ｅ Ｔｏｅ ｔｂｉｈ ａｍｅｈ ｄ ｔ ｅ ａａｅｍｅｅ ｃ ｙ ｌｓｅ ｃ ｌ ｒｍ ｕ ｎ Ｂ Ｔ Ａ Ｔ： ｊｃｉ ｖ ｓａ ｌ ｔｏ ｏ ｓｐ ｒｔ ｓ ｓｎ ｈ ｍａ ｔｍ ｅｌ ｆｏ ｈ ｍａ ｓ
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