AFLP双酶切和连接方法探讨

遗传标记技术中aflpAFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）是一种遗传标记技术，广泛应用于遗传学研究和种质资源保护。

本文将从AFLP的原理、操作步骤、优势和应用等方面进行介绍。

AFLP是一种基于多态性片段长度的遗传标记技术，它结合了PCR 扩增和限制性内切酶切割的特点。

首先，通过PCR扩增目标DNA 片段，然后利用限制性内切酶对扩增片段进行切割，生成多个DNA 片段。

这些片段在聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离并检测，形成特定的DNA指纹。

通过比较不同个体或群体之间的AFLP指纹图谱，可以揭示出遗传变异的差异。

AFLP的操作步骤相对简单，主要包括DNA提取、PCR扩增、酶切反应、连接DNA适配体、选择性扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

首先，需要从样品中提取高质量的DNA。

随后，利用特定引物对目标DNA进行PCR扩增，产生大量的扩增片段。

接下来，使用限制性内切酶对PCR产物进行酶切反应，得到多个DNA片段。

这些片段会与连接了适配体的引物结合形成适配体-片段复合物，随后进行选择性扩增，选择性引物将引导特定片段的扩增。

最后，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并使用荧光染料或放射性同位素进行检测和分析。

AFLP技术具有以下几个优势。

首先，AFLP可以同时检测多个位点的多态性，相比传统的基因标记技术，其检测效率更高。

其次，AFLP技术不需要事先了解目标基因序列，适用于未知基因组的研究。

此外，AFLP可以检测到较低频率的遗传变异，对于研究物种间或个体间的遗传关系非常有用。

最后，AFLP技术具有较高的重复性和稳定性，结果可靠性较高。

AFLP技术在遗传学研究和种质资源保护中得到了广泛应用。

在遗传学研究中，AFLP可以用于揭示物种间或个体间的遗传关系、群体遗传结构的分析以及基因组演化的研究。

在种质资源保护中，AFLP可以用于遗传多样性的评估和遗传资源的鉴定，为保护和合理利用遗传资源提供科学依据。

双酶切连接反应之全攻略(双酶切连接（Double Digestion）是一种常用的分子生物学技术，用于在DNA分子上选择性地切割两个特定的限制性内切酶位点。

它可以用于构建重组DNA，进行基因克隆，等等。

下面是一个全面的双酶切连接反应的攻略，包括实验前的准备工作，实验步骤和注意事项。

实验前的准备工作：1.获得限制性内切酶：选择两个互不相容的限制性内切酶。

确保这两个酶能够在相同的反应缓冲液中活性工作。

2.准备DNA底物：获得需要连接的DNA片段。

可以通过PCR扩增，限制性消化或DNA合成等方法获得。

3.选择连接载体：选择合适的连接载体，如质粒。

确保载体具有想要插入的目标基因的适当特性，如选择性标记物（如抗生素抗性基因）和启动子等。

4.验证限制酶位点：使用限制性内切酶图谱检测DNA片段和连接载体中的限制酶位点。

这有助于确定两个限制酶是否能够溶解目标DNA片段。

实验步骤：1.提取DNA：从细菌培养基中提取所需的DNA片段。

可以使用商用试剂盒或自制提取方法。

2.酶切反应：在适当的反应条件下，将需要连接的DNA片段和连接载体分别与两个限制性内切酶一起孵育。

反应条件包括酶的浓度，缓冲液的类型和pH值，反应温度和孵育时间。

3.酶停止反应：通过加入酶停止缓冲液或加热短暂孵育，停止酶切反应。

这样可以避免过度消化和限制酶反应继续进行。

4.凝胶电泳：将切割后的DNA片段经过琼脂糖凝胶电泳分析。

这一步骤可以检测酶切效率和特异性。

将反应样品和相应的对照样品（未经酶切）加载到琼脂糖凝胶上，然后运行电泳以分离DNA片段。

5.库仑凝胶纯化：根据所选的DNA片段大小，可以选择不同浓度的琼脂糖凝胶切片进行纯化。

将所需大小的DNA片段切割下来并进行库仑凝胶分离。

6.连接反应：将纯化的DNA片段与连接载体进行连接反应。

可以使用商业化的连接试剂盒，其中包含待连接DNA和连接载体之间的连接酶，以及其他必要的试剂。

7.转化：将连接后的DNA样品转化到合适的宿主细胞中。

双酶切连接反应的注意要点1.选择适当的酶切位点：在进行双酶切连接反应之前，需要选择适当的酶切位点。

这些酶切位点应该满足以下几个要求：-位点不应该在目标DNA序列中出现，以避免酶切产生剪切产物；-两种酶切位点应该在目标DNA序列中相对靠近，以确保连接的有效性；-酶切位点的序列应该被两种酶同时识别和切割。

2.协议的优化：双酶切连接反应的协议需要进行优化，以确定最适合的条件。

一些重要的实验条件包括反应缓冲液的成分和浓度、酶的浓度和反应温度。

对于每个反应参数，应该进行范围的优化实验，以确定最佳的条件。

3.应用正确的酶切酶：双酶切连接反应需要同时使用两种酶来进行切割。

这些酶应该是互相兼容的，并且能够在相同的反应缓冲液中活性。

此外，酶的纯度和活性也应该得到保证，以确保酶切的效果。

4.反应的时间和温度：双酶切连接反应的时间和温度都需要进行优化。

反应时间应该足够长，以确保两种酶都能充分切割目标DNA序列，并且不会出现过度切割的情况。

反应温度也应该适中，通常在酶的推荐温度范围内选择。

5.质量控制：在完成双酶切连接反应之后，应该进行质量控制以确保反应的成功。

常用的方法包括琼脂糖凝胶电泳和DNA测序。

通过这些方法，可以检测连接产物的大小和纯度，并确认连接的正确性。

6.反应产物的处理：根据实验需要，对双酶切连接反应的产物进行处理。

这可能包括：-凝胶电泳分离：使用琼脂糖凝胶电泳分离不同大小的连接产物；-提取纯化：通过凝胶电泳或商业化学试剂盒，从琼脂糖凝胶中提取并纯化连接产物；-DNA测序：对连接产物进行测序，以确认连接的正确性。

总之，双酶切连接反应是一种常用的分子生物学技术，但在实验中需要注意一系列要点。

选择适当的酶切位点、优化实验条件、正确选择酶切酶、时间和温度的控制，以及进行质量控制和反应产物的处理，对于确保双酶切连接反应的成功至关重要。

这些注意要点的遵守可以确保实验结果的准确性和可靠性。

前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。

现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。

1. 回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。

选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。

双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。

应用大体系，如100微升。

2. 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。

现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。

所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。

3. 酶量的问题：对1单位酶的定义如下：在50μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。

而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4m l菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。

4. 酶切、回收后的PCR产物与载体的连接：摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。

但对于初学者从头认真计算则非常有必要。

回收的载体片段：回收的PCR 产物片段=1：10，一般取前者，后者取。

pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套。

1pmol 1000bp DNA=μg，如载体是5380bp，则为××=μg。

5. 测DNA浓度：测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER 2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。

AFLP实验方案1.实验试剂、接头和引物限制性内切酶MseI和EcoRI，T4连接酶，Taq DNA 聚合酶，dNTPs，Mg2+，引物，接头。

2.主要试剂的配置1M Tris-HCL（pH=8.0）：800 mL ddH2O +Tris碱121.1g 溶解，用浓HCL调pH 到8.0定容至1L，常温保存。

0.5M EDTA (乙二胺四乙酸二钠)（pH=8.0）：800 mL ddH2O + EDTA 186.1g，用NaOH调pH至8.0，定容至1L，室温保存。

TE缓冲液：1mL的1M Tris-HCL(pH8.0) + 800 mL ddH2O + 200 μL的0.5M EDTA，4℃保存备用CTAB溶液：NaCl 82g + CTAB 20g + 100 mL Tris-HCL + 40 mLEDTA(0.5mM)，用ddH2O定容至1L，65℃，水浴溶解。

5×TBE溶液：Tris-碱54g + 硼酸27.5g + 0.5 M的EDTA 20mL（pH=8.0），加水定容至1L。

10%过硫酸铵（APS）溶液：1g过硫酸铵，加水定容至10 mL，4℃保存（可用范围4天内）40%丙烯酰胺：丙烯酰胺38g，甲叉双丙烯酰胺2g，然后加水定容至100 mL，0.45μM滤膜过滤，4℃保存。

Urea Buffer：尿素529.4g + 235 mL 5×TBE + 定容至1L（加水）（37℃助溶）3M NaAc：8mL H2O，4.801g 乙酸钠50×TAE：Tris-碱242g，EDTA-Na2 37.2g + 800 mL 水，搅匀，然后加57.1g冰醋酸充分溶解，定容至1L（加水）亲水剂：亲水硅烷300 μL + 冰醋酸160 μL + 95%乙醇30mL疏水剂：剥离硅烷1mL + 95%乙醇2mL固定液：无水乙醇200 mL，冰醋酸10 mL，1790 mL的水（可用4次）染色液：同固定液，另加4g AgNO3 避光保存（可用4次）显影液：水2000 mL，NaOH 60g，使用前8 min加4 mL的甲醛变性剂：去离子甲酰胺100 mL，1g 过硫酸钠，4℃保存（可用范围4天内）AFLP实验步骤：基因组DNA的酶切与连接AFLP使用两种限制性内切酶：MseI 和EcoRI（1）酶切MseI /EcoRI双酶切反应体系：MseI酶（10U/μL）0.5 μLEcoRI酶（10U/μL）0.5 μL20×NEB buffer4 2 μL模板DNA 2 μLddH2O 15 μL总体积20 μL37℃酶切3h（1h，2h，3h，4h，5h，6h，12h和24h，检测最佳酶切时间），65℃灭活20 min（2）连接MseI-接头：（+）5’-TACTCAGGACTCAT-3’（-）3’-GAGTCCTGAGTAGCAG-5’EcoRI-接头：（+）5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’（-）3’-CATCTGACGCATGGTTAA-5'AFLP连接体系：MseI酶（10U/μL）0.5 μLEcoRI酶（10U/μL）0.5 μL10×NEB Buffer4 2 μLMseI-adaptor（10 μM）0.5 μLEcoRI-adaptor（10 μM）0.5 μLT4连接酶（400 U/μL）0.1 μL酶切产物10 μLddH2O 5.9 μL总体积20 μL16℃过夜（12-16h）连接，65℃灭活15 min（3）预扩增预扩增引物：MseI-C：5’-CATGAGTCCTGAGTAAC-3’EcoRI-A：5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’AFLP预扩增反应体系：10×PCR Buffer（不含Mg2+） 2 μLMgCl2 （10 mM） 1.2 μLdNTP（2.5 mM each） 1.5 μLMseI-C（10 μM）0.5 μLEcoRI-A（10 μM）0.5 μLTaq酶（5 U/μL）0.2 μL酶切连接产物 4 μLddH2O 10.1 μL总体积20 μLPCR扩增反应：94℃ 3 min94℃40 s56℃45 s 24个循环（18,20,22,24,26,28,30寻找最佳）72℃ 1 min72℃10 min反应完后，PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测（4）选择性扩增1:20稀释取10 μL预扩增产物，加入190 μL的dd H2O，将预扩增产物稀释20倍，作为选择性扩增的模板选择性扩增的引物序列：MseI-CNN：5’-GATGAGTCCTGAGTAAC-3’EcoRI-ANN：5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’扩增产物置于-4℃保存AFLP选择性扩增的体系：10×PCR Buffer（不含Mg2+） 2 μLMgCl2 （10 mM） 1.2 μLdNTP（2.5 mM each） 1.5 μLMseI-CNN（10 μM）0.5 μLEcoRI-ANN（10 μM）0.5 μLTaq酶（5 U/μL）0.25 μL酶切产物 2.5 μLddH2O 11.55 μL总体积20 μL选择性扩增反应：94℃ 5 min；94℃30 s65℃30 s（-0.7℃/cycle）每个循环降低0.7℃13个循环72℃ 1 min94℃30 s56℃30 s 23个循环72℃ 1 min72℃ 5 min选择性扩增的引物序列（5）变性选择性扩增反应结束后，加入变性剂，在PCR仪上95℃变性处理5 min，后迅速取出放置在冰上，于-20℃保存备用。

双酶切步骤
嘿，朋友们！今天咱就来讲讲双酶切步骤。

你可别小瞧这双酶切，
它就像是一场精细的手术，每一步都得小心翼翼，不然可就出岔子啦！
首先呢，你得准备好你的“手术工具”，也就是各种试剂和酶啦。

这
就好比厨师要准备好食材和调料才能做出美味佳肴一样。

然后，就是要把你的 DNA 片段给找出来。

这 DNA 片段就像是一个宝贝，得好好对待它，不能让它有一点点损伤哦。

接下来，把酶和 DNA 放在一起，让它们开始“亲密接触”。

这时候
你就得像个守护天使一样，在旁边好好看着，确保一切都按计划进行。

在这个过程中，温度可很重要哦！就像人洗澡水不能太烫也不能太
冷一样，得恰到好处。

不然酶宝宝可不高兴，就不好好工作啦。

时间也是关键啊！不能太短，太短了酶切不完全；也不能太长，太
长了可能会有其他问题出现。

这就好像烤蛋糕，时间掌握不好，蛋糕
不是没熟就是烤焦了。

等酶切结束后，可不能就不管啦。

得检查检查，看看切得怎么样。

这就像是考试结束后要检查一遍试卷一样，可不能马虎。

要是切得好，那当然开心啦，就像考了个好成绩一样。

要是切得不好，也别灰心，找找原因，下次再来。

总之，双酶切步骤虽然听起来有点复杂，但只要你认真对待，就一
定能做好。

就像学骑自行车一样，一开始可能会摔倒，但多练习几次
就会啦。

所以啊，大家别怕困难，大胆去尝试吧！相信自己，一定能掌握好
双酶切步骤，在生物学的世界里畅游无阻！这双酶切啊，真的是很神
奇的一个过程，能让我们看到生命的奥秘一点点被揭开。

大家加油哦！。

基础理论　Basic researchA FLP的原理及其应用王　斌　翁曼丽(中国科学院遗传研究所　100101)提　要:AFLP是检测DNA多态性的一种新的分子标记技术。

对其起源、基本原理、技术程序和应用范围及前景进行了介绍和描述。

关键词:分子标记技术　AFLP　原理　应用1　分子标记技术的快速发展在过去10a中,分子标记技术得到了突飞猛进的发展,至今已有10余种分子标记技术相继出现,并在各个研究领域得到了应用。

其中在植物分子生物学领域中应用最广泛的是RF LP和RA PD。

R FL P 的结果稳定可靠,重复性好,特别适应于建立连锁图,例如水稻RF LP连锁图的建立〔1,2〕。

RF L P比较作图进一步揭示了在主要粮食作物中,R FL P标记在染色体上的排列具有类似的顺序〔3,4〕。

因此R FL P 自出现至今虽然已有10多a了,但它仍是当今应用最广泛的一种分子标记。

然而,R FL P必须经过滤膜转移和So uthern杂交,费时、费力、周期长。

另外, RF L P对DN A多态性检出的灵敏度不高,RF L P连锁图上还有很多大的空间区,这限制了它的进一步发展。

PCR对分子标记技术的发展产生了巨大的推动作用,迄今所用的分子标记技术尽管可以分为多种类型,其实除了以传统的Souther n杂交为基础的RF L P外,其它各类分子标记都涉及P CR。

R AP D就是以随机引物为模板通过P CR扩增进行DN A多态性研究的,与RF LP相比,它较便宜,方便易行,非常灵敏,DN A用量少,而且不需要同位素,安全性好。

继RF L P之后,RA PD是应用最广泛的,特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面,近年来报道了大量的与各种目的基因连锁的R AP D标记。

近来西红柿P to基因和水稻Xa21基因的成功分离就是首先找到了与目的基因紧密连锁的RA PD标记,然后通过M BC(M ap based clo ning)方法克隆了目的基因〔5,6〕。

AFLP 技术的基本原理与实验方法AFLP 技术的基本原理:AFLP 技术是一项新的分子标记技术，其原理是：基因组DNA经过二种酶不同的限制性内切酶酶切后，产生粘性末端，再使用连接酶将人工合成的双链接头连接在酶切位点的粘性末端。

接头一端具有与内切酶同样的识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板进行预扩增。

接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。

引物由3部分组成: ①核心碱基序列，该碱基序列与人工接头互补；②特异性酶切序列；③引物3’端选择性碱基。

选择性碱基延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性酶切片段被扩增。

另外，通过选择在末端分别添加了1～3个选择性核苷酸的不同引物，可以达到选择扩增的目的。

这些选择性核苷酸使得引物选择性地识别具有特异配对序列的内切酶酶切片段。

并与之结合，实现特异性扩增。

实验方法:(1)DNA 酶切AFLP技术成功的关键在于DNA的充分酶切,所以对模板质量要求较高,在DNA完全溶解后利用紫外分光光度仪测定DNA浓度，将DNA浓度用双蒸水调整到50ng/ul,应避免其他DNA污染和抑制物质的存在。

表1：E-M酶切体系表2：P-M酶切体系表3：P-T酶切体系表4：E-T酶切体系表5：M-S酶切体系表6：T-S酶切体系※先将模板吸入PCR板中，再将内切酶、Buffer、双蒸水配制为Mix（因内切酶用量很少或者因少数枪头质量问题，每次吸取内切酶时一定要注意观察吸取是否足量），将配制好的Mix 加入到模板中，最后在配好的反应体系中加入矿物油覆盖离心，放入PCR仪或水浴锅中37℃条件下5－6小时，然后立即转入65℃条件下1小时完全酶切。

一般做1/2倍体系即可。

目前本实验室拥有的内切酶有：EcoRⅠ；MseⅠ；PstⅠ；TaqⅠ；SacⅠ,以上内切酶均为Fermentas 公司生产。

(2)连接表8：连接体系※在连接的过程中不同的内切酶都有其对应的接头（表7），不同的酶切组合就用相应的接头组合。