酶切与连接

质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定(2011-04-29 10:42:22)转载▼质粒DNA酶切、连接、转化、筛选、鉴定实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的特性2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法5、掌握α互补筛选法的原理6、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法7、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法实验原理重组质粒的构建需要对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。

限制性核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，为重组质粒的构建提供了有力的工具。

限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。

质粒和病毒等DNA 分子小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较少，获得目的基因的方法也比较简单。

DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。

在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA连接酶。

T4 DNA 连接酶在分子克隆中主要用于：1、连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；2、连接双链DNA分子间的平端；3、在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。

目的DNA片段与载体DNA片段之间的连接方式（以T4DNA连接酶为例）主要有以下几种：（一）、具互补粘性末端片段之间的连接大多数的核酸内切限制酶都能够根据识别位点切割DNA分子，形成1~4核苷酸单链的粘性末端。

当载体和外源DNA用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。

（二）、平末端的连接载体分子和外源DNA插入片段并不一定总能产生出互补的粘性末端。

第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。

2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。

3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。

4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。

5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。

二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。

在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。

目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。

Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。

Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。

Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。

Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。

限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。

酶切连接法
酶切连接法是一种分子生物学技术，用于将不同的 DNA 片段连接在一起。

该方法通常包括以下步骤：
1. 酶切：使用特定的限制酶将待连接的 DNA 片段进行切割，产生特定的粘性末端。

2. 纯化：通过凝胶电泳或其他方法，将切割后的 DNA 片段进行纯化，去除杂质和未切割的 DNA。

3. 连接：将纯化后的 DNA 片段与载体 DNA（如质粒或病毒载体）在连接酶的作用下进行连接。

连接酶能够将粘性末端连接在一起，形成新的 DNA 分子。

4. 转化：将连接后的 DNA 分子导入宿主细胞中，如大肠杆菌或酵母细胞。

转化可以通过热激法、电穿孔法或化学转化法等方法进行。

5. 筛选：通过选择性培养基或其他方法，筛选出含有连接后的 DNA 分子的宿主细胞。

6. 鉴定：对筛选出的宿主细胞进行鉴定，确认其中含有连接后的 DNA 分子。

酶切连接法是一种常用的 DNA 克隆技术，可以用于构建基因文库、表达载体、基因敲除等实验。

该方法具有高效、简便、快速等优点，是分子生物学研究中不可或缺的技术之一。

酶切-连接-转化
酶切-连接-转化
一：酶切
1〕载体：pNZ8148，在-20度冰箱，从上往下第二个格子，在一个橙色的
放1.5ml离心管的板上〔特征：盖上写pnz1，pnz2，pnz3。

pnz18，有的已用，就没有，上面吸附柱，下面1.5ml离心管〕。

此载体
浓度较高，且27号我做的酶切回收，回收产物〔只加溶胶液，未纯化〕
在-20度冰箱，需要DNA回收试剂盒提取。

2〕目的基因：均连在T-5载体上，R基因位置,特征同pNZ8148，上
面写(R1R2R3…),R是已经提好的质粒，但我酶切没切开，你测一下nano
再决定是重新摇还是酶切。

3〕所有保藏的菌种均在-20度冰箱第二格〔一个袋中，袋上写igem
带功能基因菌种保存，其中在这袋中有很多小袋，每个袋里不同的菌〕。

4〕B基因在一1.5ml离心管里，在-20度冰箱第二格有一白色的盒子。

量挺多的，是十管合一起，标号忘了，你看下面能分出来。

5〕酶到处缺〔赵老师有HindIII〔NEB,TARARA〕,尹老师有XbaI 〔NEB〕〕，TAKARA的缓冲液要1*M,NEB的是NEBuffer2，我用的NEB的，Buffer2为体系量除10〔如100u体系加10ul〕6〕酶切3.h以上二：连
接连接酶〔没做过加连接酶的，〕问问李贽或张贺〔要是张贺回去的话〕，加完基因，载体，酶，缓冲液〔不知道加不加〕，还要加olution2或3，忘了三：转化1〕Tran-T1问赵信或一组2〕氯霉素的板，4°冰箱，从上
往下数第一个格。

很多，写着Cm，pNZ8148氯霉素抗性。

实验3酶切与连接实验三、酶切与连接⼀、实验⽬的与原理简介限制性内切酶在基因⼯程中主要应⽤地以下两个⽅⾯：制作基因酶切图谱和进⾏基因克隆。

制作基因图谱，就是利⽤特定的酶切出特定的条带；⽽利⽤基因克隆时选择酶应注意以下⼏个⽅⾯：1）克隆⽚段的长度；2）克隆⽚段中切点的情况3）载体上切点的情况；4）切割与连接⽅式；5）接头状态。

酶切⽅式可分为部分酶切和完全酶切两种：1）部分酶是指同⼀DNA ⽚段上有些被切开⽽另⼀些未被切开，此法主要应⽤于基因的克隆。

⽤部分酶切法是基于基因内部可能有此酶的位点。

进⾏部分酶切可通过两个⽅式：⼀是不同的时间内在同⼀酶反应管中取样终⽌反应，利⽤时间来控制酶切的程度。

另⼀种是在其余条件相同时控制酶的稀释度，利⽤不同酶浓度控制酶切程度，这种⽅法因易于控制反应⽽被⼴泛应⽤。

2）完全酶切法适⽤于如载体切割、酶切图谱的制作、基因的鉴定与DNA ⽚段的分离⼯作。

完全酶切⼜可分为单酶切、多酶切两种。

在多酶切反应中当2种或2种以上的酶有相同的反应条件时，可同时进⾏酶切，不然须在前⼀种酶作⽤完成后将其失活，⽽后进⾏第⼆种酶切反应，这样可以避免⽚段混乱现象的出现。

⼆、材料和试剂限制性内切酶NotI 、EcoRI ；10×Buffer ， PCR 产物、pPIC9K 质粒、10×T4连接Buffer 、T4 Ligase 、DDW 、琼脂糖、电泳缓冲液、Goldview 染液、胶回收试剂盒；电泳仪、恒温⽔浴锅、EP 管、移液枪、灭菌枪头、紫外检测仪三、实验步骤1）PCR 产物双酶切（NotI ，EcoRI ），pPI9K 质粒双酶切(NotI ，EcoRI )；PCR 体系如下：2）然后电泳检测后在紫外检测仪下观察（UV ，260nm ）。

3）切胶回收（尽量不要切到不含⽬的⽚段的胶），按照胶回收试剂盒标准操作。

4）回收产物电泳检测后进⾏连接：连接体系： 10×T4连接Buffer 1µl⽬的基因 6µl质粒载体 2µl产物酶切体系pPI9K 质粒酶切体系 DDW4.6µl DDW 7µl 10×HBuffer1µl 10×H Buffer 1µl ⽬的⽚段4µl pPI9K 质粒 1.6µl NotI quickcut 0.2µl NotI quickcut 0.2µlEcoRI quickcut 0.2µl(37℃15min) EcoRI quickcut0.2µl(37℃15min)T4 Ligase 1µl混合后16℃，过夜连接。

双酶切：载体大小为3000bp左右，在SfiⅠ和BssHⅡ位点之间有370bp左右的片段存在。

我想通过SfiⅠ和BssHⅡ双酶切，将370bp的片段切掉，然后装入不同的片段。

我的酶切体系如下：质粒（载体＋老片段）1ul（约100ng）(NEBlack Eye SfiⅠ1ul(NEBlack Eye BssHⅡ1ul10×buf 2.2ul100×BSA 0.2ul水14.8ul总体积20ul50度，2小时。

切出了370bp左右的片段，回收载体。

然后取回收载体的1ul自连，铺平板，但是长出了300多个克隆。

证明酶切不完全，怀疑有大量载体只是单酶切。

50度3小时我试过，但是质粒有降解。

酶量应该说是过量的。

请问有什么办法可以酶切完全？粘性连接（一）外源DNA和质粒载体的连接反应外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。

如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。

但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。

在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。

相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和Ｔ４噬菌体DNA连接酶。

实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。

这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。

ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。

不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。

现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。

在瓜作用的底物。

如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。

实验四：DNA酶切与连接反应1. 实验原理1.1 DNA酶切限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。

根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性，可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三类。

DNA重组技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。

II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全相同。

限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，1个酶单位（1 Unit）指的是在指定缓冲液中，37℃下反应60min,完全酶切1μg的纯DNA所用的酶量。

1.2 DNA连接核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子。

DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5’-P末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键。

一个DNA片段的5’-P末端与另一个3’-OH末端相互靠近时，在DNA连接酶的作用下，在含有Mg2+,ATP的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。

常用的DNA连接酶是T4 DNA连接酶，其作用底物是双链的DNA分子或RNA：DNA杂交分子，可以连接粘性末端、平末端。

2. 实验材料、试剂及仪器2.1 实验材料与试剂标准pUC19(2686bp) 、EcoRⅠ及其配套的酶切缓冲液、λDNA/EcoT14 I片段（50ng/μl）、T4 DNA连接酶及其配套的10×连接缓冲液、0.5×TBE电泳缓冲液、6×电泳载样缓冲液、Goldview、琼脂糖。

2.2 实验仪器水平式电泳装置、台式高速离心机、恒温水浴锅、PCR仪、微量移液枪、微波炉、凝胶成像仪。

3. 实验步骤3.1 质粒DNA酶切在200μl 的薄壁离心管中，按照下表1加入试剂，混匀。

点动离心将反应液甩至管底。

37℃(水浴)保温1h进行酶切反应。

表1：质粒DNA酶切反应加样成分及用量样品代号成份反应1用量（标准pUC19)H 无菌水7.0μlP 质粒(500ng/u稀释10倍) 10μlB 酶切缓冲液 2.0μlE EcoRI酶 1.0μl3.2 DNA片段的连接取200 μl的离心管按下表2加入试剂，混匀。

酶切连接的原理
酶切连接是一种常用的分子生物学技术，用于将DNA片段连接到载体DNA上或两个DNA片段连接起来。

酶切连接的原理基于DNA酶切和DNA连接两个主要步骤。

酶切是指利用特定的限制性内切酶酶切DNA分子，将DNA 分子切割成特定的碎片。

限制性内切酶能够识别DNA的特定序列，将该序列切割成特定的酶切位点。

每个限制性内切酶都有自己特定的酶切位点，例如EcoRI酶切位点为5'-GAATTC-3'，BamHI酶切位点为5'-GGATCC-3'。

通过选择合适的限制性内切酶，可以将DNA切割成特定长度的碎片。

连接是指将两个DNA片段联接在一起。

连接需要使用DNA 连接酶，该酶能够在两个DNA片段的断裂末端引入磷酸二酯键，将两个片段连接起来形成一个连续的DNA分子。

DNA连接酶通常需要一个活性磷酸基团和一个OH基团来实施连接。

在连接过程中，两个断裂末端的OH基团与连接酶的活性磷酸基团形成磷酸二酯键，连接酶同时被释放。

在酶切连接过程中，首先将目标DNA与限制性内切酶在适宜条件下反应，使DNA被切割成合适长度的碎片。

然后，利用DNA连接酶将切割后的DNA片段连接至载体DNA上或其他DNA片段上，形成目标DNA的完整结构。

连接后的DNA可以经过序列验证和进一步的应用，如基因克隆、基因工程等。

总之，酶切连接技术通过酶切和连接两个关键步骤，使得
DNA片段可以被精确地切割和连接成特定结构。

这种技术在分子生物学研究和基因工程领域有着广泛的应用。

实验七、DNA的酶切、连接限制性核酸内切酶可以识别并附着特定的DNA序列，并对每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割，使DNA双链产生平末端或黏性末端。

DNA连接酶能连接DNA链中3’-OH末端和5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。

DNA连接酶的催化作用需要消耗能量。

1、酶切反应DNA样品：PCR纯化产物、空载体pQE30； 内切酶：Bam HⅠ、Hin dⅢ；反应体系：50μL。

酶活性1 μl Bam HⅠ（QuickCut）限制酶在50μl的反应体系中，在30℃条件下，经过5 min反应，可将1μgλDNA 完全消化。

37℃反应也表现出相同的酶活性，但不如30℃时稳定。

1 μl Hin dⅢ（QuickCut）限制酶在50μl的反应体系中，在37℃条件下，经过5 min反应，可将1μgλDNA 完全消化。

50μL反应体系ddH2O补至50μl10×QuickCut Green5uLBufferDNA（pQE30、EGFP）200ngQuickCut Bam H I1uLQuickCut Hin dⅢ1uL注：本实验消化约5μg DNA样品，按实际浓度计算所用的体积。

分别对空质粒、EGFP进行酶切。

操作步骤1.按上表组分配制酶切反应液；2.用枪头轻轻混匀；3.在37℃保湿孵育30min；4. 1.2%琼脂糖凝胶电泳20min，使用QuickCut GreenBuffer可直接上样；5.进行胶回收，回收产物置于-20℃冰箱保存，用于连接反应。

2、连接反应DNA样品：目的基因片段、空载体pQE30；（经双酶切并回收纯化）连接酶：T4 DNA连接酶；反应体系：20μL。

20μL反应体系ddH2O补至20μL 10×ligation buffer2uL载体DNA（pQE30）50ng目的DNA片段（EGFP）33ngT4 DNA Ligase (350U/μl)1uL注：载体和目的基因的摩尔比为1:3，50ng/3.4kb : 33ng/0.72kb = 14.7 : 45.8 ≈ 1:3操作步骤1.按上表组分配制酶切反应液；2.用枪头轻轻混匀；3.在16℃保湿孵育3h；（可在PCR仪里进行）4.连接产物由值日生放置于-20℃冰箱保存，用于转化实验。

一、实验名称：目的DNA和载体质粒的酶切、回收和连接二、实验原理：（一）DNA的限制性酶切重组质粒的构建需要使用限制性核酸内切酶对DNA分子进行切割，并连接到合适的载体上进行体外重组。

限制性核酸内切酶是指来源于细菌或真菌的一类可以识别DNA特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。

1. 限制酶分类根据限制酶的结构、因子的需求切位与作用方式，可将限制行内切酶分为三种类型：第一型限制酶同时具有修饰及认知切割的作用；另有认知DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位距离认知位可达数千个碱基之远,并不能准确定位切割位点，所以并不常用。

第二型限制酶只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。

该酶可以识别长度4~6个核苷酸的回文序列，并在识别序列内切割双链DNA，是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。

第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。

可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对，并不能准确定位切割位点，所以并不常用。

综上所述，Ⅱ类限制性内切酶是重组DNA技术的基本工具酶。

2. 粘性末端及平末端Ⅱ类限制性内切酶对双链DNA进行切割时往往可以产生两种不同的切割末端，分别是粘性末端和平末端。

a：沿着中轴线切口（即沿着DNA双链中对应的磷酸二酯键）切开，得到的就是两个平末端；b：在中轴线的两端切口切开，可在切口处留下几个未配对的核苷酸片段，即5’突出。

这些片断可以通过重叠的5‘末端形成的氢键相连，或者通过分子内反应环化。

因此称这些片段具有粘性，叫做粘性末端。

本实验利用EcoRⅠ和BamHⅠ对质粒进行双酶切，产生带有黏性末端的DNA片段。

3. 影响酶切的因素（1）DNA限制酶：包括限制酶的活性以及用量。

大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。

当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。