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实验3酶切与连接实验三、酶切与连接⼀、实验⽬的与原理简介限制性内切酶在基因⼯程中主要应⽤地以下两个⽅⾯：制作基因酶切图谱和进⾏基因克隆。
制作基因图谱，就是利⽤特定的酶切出特定的条带；⽽利⽤基因克隆时选择酶应注意以下⼏个⽅⾯：1）克隆⽚段的长度；2）克隆⽚段中切点的情况3）载体上切点的情况；4）切割与连接⽅式；5）接头状态。
酶切⽅式可分为部分酶切和完全酶切两种：1）部分酶是指同⼀DNA ⽚段上有些被切开⽽另⼀些未被切开，此法主要应⽤于基因的克隆。
⽤部分酶切法是基于基因内部可能有此酶的位点。
进⾏部分酶切可通过两个⽅式：⼀是不同的时间内在同⼀酶反应管中取样终⽌反应，利⽤时间来控制酶切的程度。
另⼀种是在其余条件相同时控制酶的稀释度，利⽤不同酶浓度控制酶切程度，这种⽅法因易于控制反应⽽被⼴泛应⽤。
2）完全酶切法适⽤于如载体切割、酶切图谱的制作、基因的鉴定与DNA ⽚段的分离⼯作。
完全酶切⼜可分为单酶切、多酶切两种。
在多酶切反应中当2种或2种以上的酶有相同的反应条件时，可同时进⾏酶切，不然须在前⼀种酶作⽤完成后将其失活，⽽后进⾏第⼆种酶切反应，这样可以避免⽚段混乱现象的出现。
⼆、材料和试剂限制性内切酶NotI 、EcoRI ；10×Buffer ， PCR 产物、pPIC9K 质粒、10×T4连接Buffer 、T4 Ligase 、DDW 、琼脂糖、电泳缓冲液、Goldview 染液、胶回收试剂盒；电泳仪、恒温⽔浴锅、EP 管、移液枪、灭菌枪头、紫外检测仪三、实验步骤1）PCR 产物双酶切（NotI ，EcoRI ），pPI9K 质粒双酶切(NotI ，EcoRI )；PCR 体系如下：2）然后电泳检测后在紫外检测仪下观察（UV ，260nm ）。
3）切胶回收（尽量不要切到不含⽬的⽚段的胶），按照胶回收试剂盒标准操作。
4）回收产物电泳检测后进⾏连接：连接体系： 10×T4连接Buffer 1µl⽬的基因 6µl质粒载体 2µl产物酶切体系pPI9K 质粒酶切体系 DDW4.6µl DDW 7µl 10×HBuffer1µl 10×H Buffer 1µl ⽬的⽚段4µl pPI9K 质粒 1.6µl NotI quickcut 0.2µl NotI quickcut 0.2µlEcoRI quickcut 0.2µl(37℃15min) EcoRI quickcut0.2µl(37℃15min)T4 Ligase 1µl混合后16℃，过夜连接。
实验四：DNA酶切与连接反应1. 实验原理1.1 DNA酶切限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。
根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否有修饰酶活性，可分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三类。
DNA重组技术中最常用的是Ⅱ型酶，切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。
II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝两个方向“读”都完全相同。
限制性内切酶的活性以酶的活性单位表示，1个酶单位（1 Unit）指的是在指定缓冲液中，37℃下反应60min,完全酶切1μg的纯DNA所用的酶量。
1.2 DNA连接核酸片段可以通过连接酶的作用连接起来而获得重组分子。
DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5’-P末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键。
一个DNA片段的5’-P末端与另一个3’-OH末端相互靠近时，在DNA连接酶的作用下，在含有Mg2+,ATP的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。
常用的DNA连接酶是T4 DNA连接酶，其作用底物是双链的DNA分子或RNA：DNA杂交分子，可以连接粘性末端、平末端。
2. 实验材料、试剂及仪器2.1 实验材料与试剂标准pUC19(2686bp) 、EcoRⅠ及其配套的酶切缓冲液、λDNA/EcoT14 I片段（50ng/μl）、T4 DNA连接酶及其配套的10×连接缓冲液、0.5×TBE电泳缓冲液、6×电泳载样缓冲液、Goldview、琼脂糖。
2.2 实验仪器水平式电泳装置、台式高速离心机、恒温水浴锅、PCR仪、微量移液枪、微波炉、凝胶成像仪。
3. 实验步骤3.1 质粒DNA酶切在200μl 的薄壁离心管中，按照下表1加入试剂，混匀。
点动离心将反应液甩至管底。
37℃(水浴)保温1h进行酶切反应。
表1：质粒DNA酶切反应加样成分及用量样品代号成份反应1用量（标准pUC19)H 无菌水7.0μlP 质粒(500ng/u稀释10倍) 10μlB 酶切缓冲液 2.0μlE EcoRI酶 1.0μl3.2 DNA片段的连接取200 μl的离心管按下表2加入试剂，混匀。
前一周我刚刚做过单酶切连接,目的片段（pKB-2为克隆载体）4600多,载体pART27，11500,连接比例3:1,昨天刚刚鉴定出来阳性克隆，阳性克隆占30%。
步骤如下：○1.前一天晚上用NoTI酶切pART27，用100μL的体系。
体系如下：质粒30μl10×buffer 10μl0.1%BSA10μl0.1%TritonX-100 10μl灭菌水38μlNoTI 2μl○2.回收酶切产物，步骤如下：1. 加等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提一次。
加溶液后上下颠倒混匀，冰上放置5min.12000,离心5min。
2. 吸取上清，尽量不要吸到有机相，加二倍体积的无水乙醇（提前在-20度预冷）沉淀DNA. 加溶液后上下颠倒混匀，冰上放置5min.12000,离心5min。
3. 倒去乙醇，然后加70%的乙醇洗涤沉淀，上下颠倒5次，静止1-2 min，弃上清，快速离心，吸干乙醇，平放无菌操作台，鼓风吹15 min。
4. 吹干后，加20μlTE溶解.○3回收产物去磷酸化，体系如下：DNA Framgents in TE buffer 20μl10×Alcaline phosphatase buffer 5μlCLAP 1μl灭菌水24μlPS: NoTI是5′突出端，所以选用37度30 min反应。
○4.回收去磷酸产物，步骤如下：1. 加等体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提一次。
加溶液后上下颠倒混匀，冰上放置5min.12000,离心5min。
（注：酶切说明书要求抽提二次，但考虑损失太多，故舍去一次。
）2. 加等体积的氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次。
加溶液后上下颠倒混匀，冰上放置5min.12000,离心5min。
3. 添加5μl3MNaoAC。
4. 紧接着加125μl（2.5倍）冷乙醇，加完后上下颠倒混匀在-20℃下保冷30-60 min，12000,离心5min。
DNA重组技术：酶切、连接实验原理:DNA重组技术是用内切酶分别将载体和外源DNA切开，经分离纯化后，用链接酶将其连接，构成新的DNA分子。
限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5’…G↓AATTC…3’ →5’… G AATTC…3’3’…CTTAA↑G …5’ →3’… CTTAA G…5’构建DNA限制性内切酶图谱有许多方法。
通常结合使用多种限制性内切酶，通过综合分析多种酶单切及不同组合的多种酶同时切所得到的限制性片段大小来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。
酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性和精确程度。
限制性内切酶的一个活性单位U理论上， 1hr,切1ug DNA 样品中所有专一位点的所用酶量实际反应，1U酶：能完全切割1ul λDNA的一个位点不能完全切割1ug 带有4个酶切位点的样品和不纯的样品.如果采用两种限制性内切酶,必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。
若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。
若需要不同的盐浓度,则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内切酶水解。
限制性内切酶的使用注意事项：10x bf o 无盐注意混匀 L 低盐H 高盐一.仪器水浴锅(37℃，65℃) 凝胶电泳灭菌锅紫外检测离心机二.试剂及溶液λ DNA EcoR IpUC18 无菌水终止液 (40%蔗糖) 70％，100％酒精3Mol/L KAc(pH5.2) ice琼脂糖溴酚蓝TE TAEEB marker三. 用品移液器20ul 一次性手套tip 20ul 防护镜离心管0.5ml 吸水纸胶带浮子PUC 18/19, λDNA2人／组，一人做 PUC18 酶切（20ug） Takara 25ug/个一人作λDNA 酶切（15ug）EcoR1 1ul/人（10 u） (20ul) Takara 4000u/个四：酶切反应:DNA纯度、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身都会影响限制性内切酶的活性。
双酶切：载体大小为3000bp左右，在SfiⅠ和BssHⅡ位点之间有370bp左右的片段存在。
我想通过SfiⅠ和BssHⅡ双酶切，将370bp的片段切掉，然后装入不同的片段。
我的酶切体系如下：质粒（载体＋老片段）1ul（约100ng）(NEBlack Eye SfiⅠ1ul(NEBlack Eye BssHⅡ1ul10×buf 2.2ul100×BSA 0.2ul水14.8ul总体积20ul50度，2小时。
切出了370bp左右的片段，回收载体。
然后取回收载体的1ul自连，铺平板，但是长出了300多个克隆。
证明酶切不完全，怀疑有大量载体只是单酶切。
50度3小时我试过，但是质粒有降解。
酶量应该说是过量的。
请问有什么办法可以酶切完全？粘性连接（一）外源DNA和质粒载体的连接反应外源DNA片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链DNA5’磷酸和相邻的3'羟基之间形成的新的共价链。
如质粒载体的两条链都带5'磷酸，可生成4个新的磷酸二酯链。
但如果质粒DNA已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸二酯链。
在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。
相邻的５'磷酸和３'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和Ｔ４噬菌体DNA连接酶。
实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体DNA连接酶都是首选的用酶。
这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。
ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。
不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。
现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体ＤＮＡ。
在瓜作用的底物。
如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。
这倦，在ＤＮＡ浓度低时，质粒ＤＮＡ重新环化将卓有成效。
如果连接反应中ＤＮＡ浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。
因此在ＤＮＡ浓度高时，连接反的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。
Dugaiczyk等(1975;同时参见Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第２、３期合刊）从理论上探讨了ＤＮＡ浓度对连接产物性质的影响。
简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数：j和i。
j是ＤＮＡ分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j的数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈随机卷曲。
这样，j与ＤＮＡ分子的长度成反比（因为ＤＮＡ越长，某一给定分子的两末端的越不可能相互作用），因此j对给定长度的ＤＮＡ分子来说是一个常数，与ＤＮＡ深度无关。
j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是ＤＮＡ长度，以cm计，b是随机卷曲的ＤＮＡ区段的长度。
b的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响ＤＮＡ的刚度。
i是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml这里Ｎo是阿佛伽德罗常数，Ｍ是ＤＮＡ的摩尔浓度（单位：mol/L)。
理论上，当j=i时，给定ＤＮＡ分子的一个末端与同一分子的另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。
因而在这样的条件下，在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。
而当j>i时，有利于重新环化；当i>j，则有利于产生多联体。
图1.9显示了ＤＮＡ区段的大小与连接反应混合物中j:i之比分别为0.5、1、2和5时所需ＤＮＡ浓度之间关系（Ｄugaiczyk等，1985）。
现在考虑如下的连接反应混合物：其中除线状质粒之外，还含有带匹配末端的外源ＤＮＡ片段。
对于一个给定的连接混合物而言，产生单体环状重组基因组的效率不仅受反应中末端的绝对浓度影响，而且还受质粒和外源ＤＮＡ末端的相对浓度的影响。
当i是j的２－３倍（即末端的绝对浓度足以满足分子间连接的要求，而又不致引起大量寡聚体分子的形成时）外源ＤＮＡ末端浓度的２倍时，有效重组体的产量可达到最大。
这些条什下，连接反应终产物的大约40％都是由单体质粒与外源ＤＮＡ所形成的嵌合体。
当连接混合物中线瘃质粒的量恒定（j:i=3）而带匹配末端的外源ＤＮＡ的量递增时，这种嵌合体在连接反应之末的理论产量。
涉及带粘端的线状磷酸化质粒ＤＮＡ的连接反应应包含：１）足量的载体ＤＮＡ，以满足j:i>1和j:i<3。
对一个职pUC18一般大小的质粒，这意味着连接反应中应含有载体ＤＮＡ为20-60μg/ml。
２）未端浓度等于或稍高于载体ＤＮＡ的外源ＤＮＡ，如外源ＤＮＡ浓度比载体低得多，在效连接产物的数量会很低，这样就很难别小部分带重组抽粒的转化菌落。
这种情况下，可考虑采用一些步骤来减少带非重组质粒的背景菌落。
如用磷酸酶处理线状质粒ＤＮＡ或发迹克隆策略以便通过定向克隆的方法构建重组质粒。
(二）粘端连接１）用适当的限制酶消化质粒和外源ＤＮＡ。
如有必要，可用凝胶电泳分离片段并（或）用碱性磷酸酶处理质粒ＤＮＡ。
通过酚：氯仿抽提和乙沉淀来纯化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其浓度为100/ml。
２）按如下所述设立连接反应混合物：a．将0.1μl载体ＤＮＡ转移到无菌微量离心管中，加等摩尔量的外源ＤＮＡ。
b．加水至7.5μl，于45℃加温５分钟以使重新退炎的粘端解链，将混合物冷却到０℃。
c．加入：10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液１μlＴ４噬菌体ＮＤＡ连接酶0.1Weiss单位５mmol/L ATP 1μl于16℃温育１－４小时10xT4噬菌体ＤＮＡ连接酶缓冲液200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)50mmol/K MgCl250mmol/L二硫苏糖醇500μg/ml牛血清白蛋白（组分Ｖ.Sigma产品）（可用可不用）该缓训液应分装成小份，贮存于－20℃。
另外，再设立两个对照反应，其中含有（１）只有质粒载体；（２）只有外源ＤＮＡ片段。
如果外源ＤＮＡ量不足，每个连接反应可用50-100ng质粒ＤＮＡ，并尽可能多加外源ＤＮＡ，同时保持连接反应体积不超过10μl。
可用至少３种不同方法来测定Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶的活性。
大多数制造厂商（除New England Biolabs公司外）现在都用Weiss等，１1968)对该酶进行标化。
１个Weiss单位是指在37℃下20分钏内催化１mmol32P从焦磷酸根置换到[γ,β-32P]A TP所需酶时，１个Weiss单位相当于0.2个用外切核酸酶耐受试验来定义的单位（Modrich和Lehman,1970)或者60个粘端单位（如Ｎew England Biolabs公司所定义）。
因此，0.015Ｗeiss单位的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶在16℃下30分钟内可使50％的λ噬菌体HindⅢ片段（5μg）得以连接。
在本书中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶一律用Weiss 单位表示。
\par 目前提供的Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶均为浓溶液（1-5单位/μl），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫苏糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀释成100单位/ml的浓度置存。
处于这种浓度并在这种缓冲液中的Ｔ４噬体ＤＮＡ连接酶于-20℃保存３个月可保持稳定。
３）每个样品各取１－２μl转化大肠杆菌感受态细胞。
（三）平端ＤＮＡ连接Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶不同于大肠杆菌ＤＮＡ连接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的连接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于ＤＮＡ很容易成为平端，所以这是一个极为有用的酶学物性。
有了这样的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相连。
然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下４个条件：１）低浓度（0.5mmol/L）的A TP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。
２）不存在亚精胺一类的多胺。
３）极高浓度的连接酶（50Weiss单位．ml）。
４）高浓度的平端。
１．凝聚剂在反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致ＤＮＡ分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Ｈarrison,1985)或氯化六氨全高钴（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得适当浓度的平端ＤＮＡ的总是迎刃而解。
在连接反应中，这些物质具有两作用：１）它们可使平端ＤＮＡ的连接速率加大１－３个数量级，因此可使连接反应在酶ＤＮＡ浓度不高的条件下进行。
２）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物。
这样，即使在有利于自身环化（j:i=10）的ＤＮＡ浓度下，所有的ＤＮＡ产物也将是线状多聚体。
\par 在设立含凝聚剂的连接反应时，下列资料可供参考。
（１）聚乙二醇（PEG8000）１）用去离子水配制的ＰＥＧ8000贮存液（40％）分装成小份，冰冻保存，但加入连接反应混合物之前应将其融化并使其达到室温。
在含15％PEG 8000的连接反应混合物中，对连接反刺激效应最为显著。
除PEG 800和Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶以外，其他所有连接混合物的组分应于０℃混合，然后加适当体积的PEG 8000（处于室温），混匀，加酶后于20℃进行温育。
２）连接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2时对连接反应的刺激效应最为显著，甚至A TP浓度略有增加或ＭgCl2浓度略有降低，都会严重降低刺激的强度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。
３）浓度为15％的PEG 8000可刺激带粘端的ＤＮＡ分子的连接效率提高至原来的10-100倍，反应的主产物是串联的多联体。
４）PEG 8000可刺激短至８个核苷酸的合成寡聚物的平端连接，在这一方面，它与氯化六氨合高钴有所不同。
（２）氯化六氨合高钴１）氯化六氨合高钴可用水配成10mmol/L贮存液贮存于-20℃，它对连接反应的刺激具有高度的浓度信赖性。
当连接反应混合物中盐深度为1.0-1.5μmol/L时，其刺激作用最大。
氯化六氨合高钴可使平端连接的效率大约提高到原来的50W部，但只能使端连接的效率提高到原来的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。
