铁线莲属植物叶绿体微卫星引物开发及其遗传分析

我国铁线莲属植物研究进展作者：杨维雄常晓勇尹建华来源：《现代农业科技》2020年第09期摘要; ; 铁线莲属植物是一种广泛分布于世界各地的藤本植物，在我国亦有分布，因花色多样、艳丽，在园林观赏方面具有很广阔的应用前景，一些铁线莲品种因含有特殊的代谢物而具有一定的药用价值。

本文对我国铁线莲属植物在种质资源调查、分子研究、引种栽培及繁育、药用研究、园林应用方面的研究进展进行了综述，以期为铁线莲资源的开发利用提供参考。

关键词; ; 铁线莲属植物;资源调查;栽培繁育;园林应用中图分类号; ; S68; ; ; ; 文献标识码; ; A文章编号; ;1007-5739（2020）09-0135-03; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ;开放科学（资源服务）标识码（OSID）铁线莲属（Clematis）属毛茛科（Ranunculaceae），该属植物为木质藤本，全世界约有355种[1]，在世界各地广泛分布，在园林绿化和药用方面具有一定的经济价值。

在西方园林绿化中，铁线莲素有“藤本皇后”的美称[2]，其花色丰富艳丽、花期长、适应性强，为不可多得的垂直绿化材料。

我国大约有155种铁线莲属植物资源[1-2]，是该物种野生资源最丰富的国家，但在资源的开发利用方面相对滞后，国外大多数铁线莲品种原种产于我国，而国内园艺应用的铁线莲品种多来自国外[3]。

本文总结和分析了我国铁线莲属植物最新的研究进展，以期为进一步开发和应用铁线莲属植物提供一定的理论及实践参考。

1; ; 种质资源研究我国铁线莲品种广泛分布于全国。

以云南分布最多，占全国1/2以上，共有83个种，其中有56个种为中国特有、16个种为云南特有[4]。

李璟琦等[5]在对秦岭铁线莲资源的调查中指出，秦岭共分布有18个种、4个变种，具有较高的观赏、药用价值。

㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(３):４２~５０ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０３.００７收稿日期:２０２２－０６－１８基金项目:重庆市教育科学规划课题(２０２０－ＧＸ－３４４)ꎻ重庆人文科技学院校级科研项目(ＣＲＫＺＫ２０２２００５)ꎻ国家现代农业产业技术体系专项(ＣＡＲＳ－２３－Ａ１２)ꎻ重庆市技术创新与应用发展专项重点项目(ｃｓｔｃ２０１９ｊｓｃｘ－ｇｋｓｂＸ０１４９)作者简介:唐茜(１９８４ )ꎬ女ꎬ重庆开州人ꎬ硕士ꎬ副教授ꎬ研究方向:野生观赏植物资源开发利用及生理特性研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｍｏｄｅｎ２０１＠１６３.ｃｏｍＮ－乙酰半胱氨酸对盐胁迫下柱果铁线莲种子萌发和幼苗生长的促进效应唐茜１ꎬ张妍１ꎬ邓美伶１ꎬ王佳丽２ꎬ李强２(１.重庆人文科技学院ꎬ重庆㊀４０１５２４ꎻ２.西南大学园艺园林学院ꎬ重庆㊀４００７１５)㊀㊀摘要:为给盐碱地上推广柱果铁线莲高效种植技术提供理论依据和参考ꎬ本试验以１００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ溶液模拟盐胁迫ꎬ研究添加外源１ｍｍｏｌ/ＬＮ－乙酰半胱氨酸(ＮＡＣ)对盐胁迫下柱果铁线莲种子萌发㊁幼苗生长的促进效应及其对根系渗透调节物质含量㊁根系氧化损伤的影响ꎮ结果表明ꎬ盐胁迫抑制柱果铁线莲种子萌发㊁植株和根系生长ꎬ提高根系脯氨酸㊁可溶性糖㊁Ｎａ＋㊁丙二醛(ＭＤＡ)㊁过氧化氢(Ｈ２Ｏ２)含量ꎬ同时还提高根系抗氧化酶(ＳＯＤ㊁ＣＡＴ㊁ＰＯＤ)活性ꎬ降低Ｋ＋㊁Ｃａ２＋含量ꎮ与盐胁迫处理相比ꎬ盐胁迫下添加外源ＮＡＣꎬ其种子萌发指标显著提高ꎬ还促进植株和根系生长ꎬ根系活力提高４５.９５％ꎬ达到显著水平ꎻ根系脯氨酸㊁可溶性糖含量显著降低ꎬ可溶性蛋白含量则显著升高ꎬ且降低根系Ｎａ＋含量ꎬ提高Ｋ＋㊁Ｃａ２＋含量ꎬ也降低ＭＤＡ㊁Ｈ２Ｏ２含量ꎬ进一步提高抗氧化酶(ＳＯＤ㊁ＣＡＴ㊁ＰＯＤ)活性ꎬ缓解根系的离子毒害和氧化应激损伤ꎮ综上可知ꎬ添加外源ＮＡＣ促进盐胁迫下柱果铁线莲种子萌发和幼苗生长ꎮ其原因可能是ꎬ一方面通过提高细胞的渗透调节能力维持稳定的渗透压和离子平衡ꎬ一方面是通过激活植物体内抗氧化酶防御系统ꎬ使ＳＯＤ㊁ＣＡＴ㊁ＰＯＤ活性显著升高ꎬ及时清除体内过多的Ｈ２Ｏ２ꎬ缓解细胞的氧化损伤ꎬ从而提高植株的耐盐性ꎮ关键词:柱果铁线莲ꎻＮ－乙酰半胱氨酸ꎻ盐胁迫ꎻ种子萌发ꎻ幼苗生长ꎻ渗透调节ꎻ氧化损伤中图分类号:Ｓ６８２.３９０.１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０３－００４２－０９ＰｒｏｍｏｔｉｏｎＥｆｆｅｃｔｏｆＮ￣ＡｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅｏｎＳｅｅｄＧｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄＳｅｅｄｌｉｎｇＧｒｏｗｔｈｏｆＣｌｅｍａｔｉｓｕｎｃｉｎａｔａＣｈａｍｐ.ｕｎｄｅｒＳａｌｔＳｔｒｅｓｓＴａｎｇＱｉａｎ１ꎬＺｈａｎｇＹａｎ１ꎬＤｅｎｇＭｅｉｌｉｎｇ１ꎬＷａｎｇＪｉａｌｉ２ꎬＬｉＱｉａｎｇ２(１.ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｕｍａｎｉｔｉｅｓꎬＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＣｈｏｎｇｑｉｎｇ４０１５２４ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＬａｎｄｓｃａｐｅＡｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅꎬＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＣｈｏｎｇｑｉｎｇ４００７１５ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｅｓａｎｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｆｏｒｔｈｅｐｒｏｍｏｔｉｏｎｏｆｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｌａｎｔｉｎｇｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙｏｆＣｌｅｍａｔｉｓｕｎｃｉｎａｔａＣｈａｍｐ.ｏｎｓａｌｉｎｅ￣ａｌｋａｌｉｓｏｉｌꎬ１００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌｓｏｌｕｔｉｏｎｗａｓｕｓｅｄｔｏｓｉｍｕｌａｔｅｓａｌｔｓｔｒｅｓｓꎬａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓ１ｍｍｏｌ/ＬＮ￣ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ(ＮＡＣ)ｏｎｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎꎬｓｅｅｄｌｉｎｇｇｒｏｗｔｈꎬｃｏｎｔｅｎｔｏｆｒｏｏｔｏｓｍｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓｕｂｓｔａｎｃｅｓａｎｄｒｏｏｔｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅｏｆＣ.ｕｎｃｉｎａｔａｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｗｅｒｅｓｔｕｄ￣ｉｅｄｉｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｐｌａｎｔａｎｄｒｏｏｔｇｒｏｗｔｈꎬｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｐｒｏｌｉｎｅꎬｓｏｌｕｂｌｅｓｕｇａｒꎬＮａ＋ꎬｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ(ＭＤＡ)ꎬａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｈｙ￣ｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ(Ｈ２Ｏ２)ꎬａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅｓ(ＳＯＤꎬＣＡＴꎬＰＯＤ)ꎬａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆＫ＋ａｎｄＣａ２＋ｉｎｒｏｏｔｓ.ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｉｎｇｌｅｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｇｒｏｕｐꎬａｆｔｅｒａｄｄｉｎｇｅｘｏｇｅｎｏｕｓＮＡＣꎬｔｈｅｓｅｅｄｇｅｒ￣ｍｉｎａｔｉｏｎｉｎｄｅｘｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｍｐｒｏｖｅｄꎬａｎｄｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｓｅｅｄｌｉｎｇｐｌａｎｔｓａｎｄｒｏｏｔｓｗａｓａｌｓｏｐｒｏｍｏｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒｏｏｔｖｉｇｏｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ４５.９５％.Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎꎬｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｐｒｏｌｉｎｅａｎｄｓｏｌｕｂｌｅｓｕｇａｒｄｅ￣ｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙꎬｗｈｉｌｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙꎻｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＮａ＋ꎬＭＤＡａｎｄＨ２Ｏ２ｄｅｃｒｅａｓｅｄꎬｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＫ＋ａｎｄＣａ２＋ａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅｓ(ＳＯＤꎬＣＡＴꎬＰＯＤ)ｉｎｃｒｅａｓｅｄꎬｓｏｔｈｅｉｏｎｉｃｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓｄａｍａｇｅｏｆｒｏｏｔｓｗｅｒｅａｌｌｅｖｉａｔｅｄ.ＩｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎꎬｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓＮＡＣｃｏｕｌｄｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄｓｅｅｄｌｉｎｇｇｒｏｗｔｈｏｆＣ.ｕｎｃｉｎａｔａｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｔｈｒｏｕｇｈｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇｓｔａｂｌｅｏｓｍｏｔｉｃｐｒｅｓｓｕｒｅａｎｄｉｏｎｂａｌａｎｃｅｂｙｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｏｓｍｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆｃｅｌｌｓꎬａｎｄａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇｏｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅｏｆｃｅｌｌｓｂｙａｃｔｉｖａｔｉｎｇｔｈｅａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｅｎｚｙｍｅｄｅｆｅｎｓｅｓｙｓｔｅｍｓｕｃｈａｓｓｉｇｎｉｆｉ￣ｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＳＯＤꎬＣＡＴａｎｄＰＯＤａｎｄｔｉｍｅｌｙｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｔｈｅｅｘｃｅｓｓｉｖｅＨ２Ｏ２.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＣｌｅｍａｔｉｓｕｎｃｉｎａｔａＣｈａｍｐ.ꎻＮ￣ＡｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅꎻＳａｌｔｓｔｒｅｓｓꎻＳｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎꎻＳｅｅｄｌｉｎｇｇｒｏｗｔｈꎻＯｓｍｏｔｉｃａｄｊｕｓｔｍｅｎｔꎻＯｘｉｄａｔｉｖｅｄａｍａｇｅ㊀㊀土壤盐碱化是环境恶化的一个重要方面ꎬ盐碱土壤不仅会使植物生长受到抑制ꎬ严重的还会导致植株死亡[１]ꎮ植物的种子萌发期和幼苗期是对土壤盐分浓度最敏感的阶段ꎬ如果此阶段遭遇盐胁迫ꎬ则会严重影响植物整个生长周期[２]ꎮ盐碱土壤对植物的危害主要包括离子毒害㊁渗透胁迫㊁氧化应激损伤等ꎮ提高植物的耐盐碱能力可以较好地利用盐碱地ꎬ还能产生一定的经济效益[３]ꎮ因此ꎬ近年来众多学者开展了高耐盐植物品种选育和改良㊁提升高经济价值植物的耐盐碱能力等研究ꎮ柱果铁线莲(ＣｌｅｍａｔｉｓｕｎｃｉｎａｔａＣｈａｍｐ.)属于毛茛科(Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ)铁线莲属(Ｃｌｅｍａｔｉｓ)多年生草质藤本植物ꎬ全国各地均有分布ꎬ主要分布于东北㊁西部地区及浙江[４]ꎮ因其生长形态独特和独树一帜的开花特性ꎬ广泛用于城市园林植物造景ꎬ具有很高的观赏价值ꎬ又因其根茎富含三萜糖苷等活性成分ꎬ还是一味传统的中药材[５]ꎮ研究表明ꎬ铁线莲属植物具有广泛适应性ꎬ耐热㊁耐寒㊁耐干旱㊁耐弱光等[６]ꎮ然而ꎬ王凯[７]㊁李洪瑶等[８]研究发现ꎬ铁线莲属植物的耐盐碱性差异较大ꎬ低浓度盐胁迫初期有一定抗性ꎬ但胁迫时间较长时铁线莲均难以正常生长ꎮ因此ꎬ解决盐碱胁迫下柱果铁线莲种子萌发和幼苗生长困难等问题ꎬ有助于盐碱地上推广种植柱果铁线莲ꎬ开发利用盐碱地ꎮ目前主要通过种子处理㊁补充外源物质和培育耐盐碱品种等方法来提高植物适应盐碱土壤的能力ꎮ其中ꎬ补充外源物质由于成本较低且时效快成为提高植物耐盐碱研究的重点ꎬ较多的研究表明ꎬ外源物质可以提高植物细胞渗透调节能力和抗氧化酶活性ꎬ从而缓解盐胁迫对植物的伤害ꎬ提高植物的耐盐性[９]ꎮＮ－乙酰半胱氨酸(Ｎ－ａｃｅ￣ｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅꎬＮＡＣ)是半胱氨酸的Ｎ－乙酰衍生物ꎬ是一种强抗氧化剂ꎬ不仅抑制植物体内活性氧的生成ꎬ同时还能清除过多的自由基ꎬ调节细胞的新陈代谢ꎬ提高细胞活性ꎬ另外它还是植物体内内源性抗氧化剂谷胱甘肽的前体物质[１０ꎬ１１]ꎮＣｏｌａｋ等[１２]研究发现ꎬ补充外源ＮＡＣ可以通过诱导小麦根系酚酸的合成和提高抗氧化酶活性来缓解重金属的胁迫作用ꎻＰｉｃｃｈｉ等[１３]研究发现ꎬＮＡＣ能提高小麦叶片中抗氧化酶水平ꎬ尤其是抗坏血酸含量ꎬ从而缓解臭氧引起的氧化损伤ꎻ董倩[１４]研究发现ꎬ补充外源ＮＡＣ可以提高水稻叶片中抗氧化酶活性和相关基因的表达ꎬ缓解低温对水稻的刺激作用ꎬ从而增强水稻的耐寒性ꎮ这些研究结果表明ꎬＮＡＣ可诱导植物体产生抵抗非生物环境胁迫的能力ꎮ而关于ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲种子萌发和幼苗生长影响的研究还鲜有报道ꎬ且其具体的作用机制还不清晰ꎮ因此ꎬ本试验采用浸种和幼苗胁迫方式ꎬ研究分析ＮＡＣ对一定浓度ＮａＣｌ胁迫下柱果铁线莲种子萌发和幼苗生长的促进作用ꎬ解析ＮＡＣ对柱果铁线莲缓解盐胁迫的作用机制ꎬ为今后盐碱地上柱果铁线莲高效种植推广提供理论依据和技术参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料及试剂供试Ｎ－乙酰半胱氨酸(ＮＡＣ)购自上海麦克３４㊀第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀唐茜ꎬ等:Ｎ－乙酰半胱氨酸对盐胁迫下柱果铁线莲种子萌发和幼苗生长的促进效应林生化科技有限公司(纯度ȡ９９％ꎬ货号Ｃ１１１８２６６３)ꎮ柱果铁线莲种子由西南大学园艺园林学院提供ꎮ超氧化物歧化酶(ＳＯＤ)试剂盒㊁过氧化氢酶(ＣＡＴ)试剂盒㊁过氧化物酶(ＰＯＤ)试剂盒㊁过氧化氢(Ｈ２Ｏ２)测试盒㊁可溶性糖(ｓｏｌｕｂｌｅｓｕｇａｒ)试剂盒㊁脯氨酸(Ｐｒｏ)试剂盒㊁总蛋白定量测定试剂盒(ＢＣＡ法)均购自南京建成生物工程研究所ꎮ丙二醛(ＭＤＡ)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司ꎮ１.２㊀试验设计试验于２０２１年２ ９月在西南大学园林园艺学院进行ꎮ在前期试验结果(１００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ胁迫下柱果铁线莲种子萌发受到明显抑制)的基础上ꎬ参考李洪瑶等[８]的方法ꎬ本试验选择ＮａＣｌ胁迫浓度为１００ｍｍｏｌ/ＬꎬＮＡＣ浓度为１ｍｍｏｌ/Ｌ[１２]ꎮ试验设置４个处理ꎬ即对照(Ｔ０):无菌蒸馏水ꎻ盐胁迫处理(Ｔ１):１００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ溶液ꎻＮＡＣ处理(Ｔ２):１ｍｍｏｌ/ＬＮＡＣ溶液ꎻＮＡＣ＋ＮａＣｌ处理(Ｔ３):１００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ＋１ｍｍｏｌ/ＬＮＡＣꎮ１.３㊀种子萌发试验选取饱满成熟的柱果铁线莲种子ꎬ在直径２０ｃｍ培养皿中用０.２％高锰酸钾消毒５ｍｉｎꎬ用无菌蒸馏水冲洗３遍ꎬ再将种子放置在恒温培养箱中ꎬ２８ħ条件下无菌蒸馏水浸泡４８ｈꎬ之后取出用无菌滤纸吸干ꎮ然后ꎬ将种子分成４份ꎬ按照１.２试验设计进行４个处理(Ｔ０~Ｔ３)ꎬ即用对应的溶液浸泡２ｈꎬ再用无菌水冲洗３遍控干ꎬ放置在铺有２层滤纸的育苗盘(长３２ｃｍꎬ宽２５.５ｃｍꎬ高６.７ｃｍ)中萌发ꎮ滤纸上提前加对应的处理溶液５ｍＬꎮ每个育苗盘放置５０粒种子ꎬ每处理３个重复ꎮ然后ꎬ将育苗盘移至南方山地园艺学教育部重点实验室的人工气候室中进行萌发试验ꎬ条件为昼/夜温度２８ħ/２５ħ㊁光照/黑暗时间１４ｈ/１０ｈ㊁光照强度５０００ｌｘ和空气湿度６５％~７５％ꎮ每天上午１０ʒ００开始观察种子萌发情况ꎮ育苗盘中的滤纸每隔２ｄ更换１次ꎬ以确保处理溶液浓度一致ꎮ１.４㊀幼苗胁迫生长试验按照１.３中方法进行种子萌发ꎬ待其根系长至３~４ｃｍ时ꎬ选取长势一致的种苗移栽至花盆ꎬ用土盖住根部ꎬ露出种仁ꎮ花盆规格:口径１２.３０ｃｍꎬ底径９.６０ｃｍꎬ高１３.２０ｃｍꎬ容量１.５０Ｌꎮ每盆装入相同重量的配土(泥炭ʒ珍珠岩＝１ʒ１)ꎮ每盆移栽３株ꎬ每处理１５盆ꎬ重复３次ꎮ待幼苗全部移栽成活且第一片真叶全部展开后开始实施处理ꎬ每盆浇灌对应处理的溶液５０ｍＬꎬ避免溶液接触叶片ꎮ为保证每盆土壤盐浓度不变和土壤水分正常ꎬ每隔２ｄ测量一次土壤含水量ꎬ根据土壤含水量定期喷施无菌蒸馏水ꎮ１.５㊀测定指标与方法１.５.１㊀种子萌发指标测定㊀每天观察种子萌发情况ꎬ并及时清除霉变种子ꎮ种子发芽标准为胚根长度大于种子长度的５０％ꎮ第３０天统计种子发芽势(ＧＰ)ꎬ第５０天统计种子发芽率(ＧＲ)ꎮＧＰ＝３０ｄ内发芽种子数/种子总数ˑ１００％ꎻＧＲ＝５０ｄ内发芽种子数/种子总数ˑ１００％ꎻ种子发芽指数(ＧＩ)＝ð(Ｇｔ/Ｄｔ)ꎮ其中ꎬＧｔ为第ｔ天发芽种子数ꎬＤｔ为对应Ｇｔ的发芽天数ꎮ种子活力指数(ＶＩ)＝ＳˑＧＩꎮ式中Ｓ为种子胚苗的鲜重(ｇ)ꎮ１.５.２㊀幼苗胁迫生长试验指标测定㊀实施处理后第１０㊁２０㊁３０天每个处理分别随机选取５盆进行试验ꎮ用游标卡尺测量幼苗株高㊁茎粗ꎮ采集幼苗并按地上部㊁地下部分开ꎬ洗净后置于烘箱中４５ħ烘至恒重ꎬ用分析天平分别称取两者干重ꎮ将幼苗新鲜根部清洗干净后再用无菌滤纸擦干ꎬ使用根系分析仪(型号ＧＸＹ－Ａꎬ杭州托普仪器有限公司)进行根长㊁根表面积㊁根体积分析ꎻ再分别称取各处理根样０.５０ｇꎬ加入预冷ＰＢＳ溶液５ｍＬꎬ研磨至匀浆ꎬ在４ħ下５０００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ吸取上清液－８０ħ保存ꎬ用于相关指标测定ꎮ其中ꎬＳＯＤ㊁ＣＡＴ㊁ＰＯＤ活性和ＭＤＡ㊁Ｈ２Ｏ２㊁脯氨酸㊁可溶性糖㊁可溶性蛋白含量测定严格按照试剂盒说明书操作ꎮ根系活力参照白宝璋等[１５]的氯化三苯基四氮唑法(ＴＴＣ)测定ꎮ幼苗根系洗净后在烘箱中１１０ħ杀青３０ｍｉｎꎬ再６０ħ烘干至恒重ꎬ研磨成粉末ꎬ委托西南大学分析测试中心采用火焰光度计法测定Ｎａ＋㊁Ｋ＋㊁Ｃａ２＋含量[１６]ꎮ１.６㊀数据处理与分析采用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２０１０进行试验数据整理ꎬ用ＳＰＳＳ２２.０软件和ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８.０进行数据分析和作图ꎮ４４㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀２㊀结果与分析２.１㊀ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲种子萌发的影响由表１可以看出ꎬ与对照(Ｔ０)相比ꎬ盐胁迫处理(Ｔ１)种子发芽率㊁发芽势㊁发芽指数㊁活力指数均显著下降ꎬ分别降低６４.１０％㊁５０.０１％㊁６４.９８％和８２.７１％ꎬ可见盐胁迫严重影响柱果铁线莲种子萌发ꎮ与Ｔ０相比ꎬＮＡＣ处理(Ｔ２)种子发芽率㊁发芽势无显著差异ꎬ而发芽指数㊁活力指数则显著提高ꎬ显示ＮＡＣ在一定程度上可激活柱果铁线莲种子萌发ꎮ与Ｔ１相比ꎬＮＡＣ＋ＮａＣｌ处理(Ｔ３)种子发芽率㊁发芽势㊁发芽指数㊁活力指数均显著提高ꎬ分别提高１３７.０９％㊁７６.２５％㊁１００.５３％㊁４０９.８９％ꎻ与Ｔ０相比ꎬＴ３处理各种子萌发指标均显著下降ꎮ综上表明ꎬ盐胁迫显著影响柱果铁线莲种子萌发ꎬ添加外源ＮＡＣ可以显著缓解盐胁迫ꎬ显著提高种子各萌发指标ꎬ但难以恢复到对照水平ꎮ㊀㊀表１㊀㊀㊀ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲种子萌发的影响处理发芽率(％)发芽势(％)发芽指数活力指数Ｔ０６５.３５ʃ８.６５ａ５３.１６ʃ７.４４ａ１６.２２ʃ１.１８ｂ４２.６８ʃ２.３５ｂＴ１２３.４６ʃ３.７７ｃ２６.５７ʃ３.２６ｃ５.６８ʃ０.５９ｄ７.３８ʃ１.４３ｄＴ２６８.０６ʃ９.３７ａ５５.２８ʃ６.７６ａ２３.５２ʃ２.２１ａ６４.８３ʃ３.８５ａＴ３５５.６２ʃ７.２３ｂ４６.８３ʃ５.７２ｂ１１.３９ʃ０.８６ｃ３７.６３ʃ２.７８ｃ㊀㊀注:同列数据后不同小写字母表示处理间在０.０５水平上差异显著ꎬ下同ꎮ２.２㊀ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系生长的影响盐胁迫处理３０ｄ时柱果铁线莲幼苗根系生长状况见表２ꎮ可以看出ꎬ与Ｔ０相比ꎬＴ１处理幼苗的相对根长㊁相对根表面积㊁相对根体积和根系活力均显著下降ꎬ分别降７２.０％㊁６４.０％㊁６８.０％和２８.８５％ꎬ表明盐胁迫下根系生长受到显著抑制ꎮ与Ｔ０相比ꎬＴ２处理幼苗的相对根长㊁相对根表面积㊁相对根体积和根系活力均得到显著提高ꎬ可知ＮＡＣ一定程度上能激活根系活力ꎬ提升根系生长能力ꎮ与Ｔ１相比ꎬＴ３处理幼苗的相对根长㊁相对根表面积㊁相对根体积和根系活力均显著提高ꎬ分别高出１４２.８６％㊁６３.８９％㊁１０６.２５％和４５.９５％ꎬ然而Ｔ３处理幼苗的根系生长状况难以恢复到对照水平ꎮ表明ꎬ添加外源ＮＡＣ可以缓解ＮａＣｌ对柱果铁线莲幼苗根系的胁迫作用ꎮ㊀㊀表２㊀ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系生长的影响处理相对根长相对根表面积相对根体积根系活力[ｍｇ/(ｇ ｈ)]Ｔ０１.００ｂ１.００ｂ１.００ｂ０.５２ｂＴ１０.２８ｄ０.３６ｃ０.３２ｄ０.３７ｃＴ２１.２８ａ１.３６ａ１.２２ａ０.６６ａＴ３０.６８ｃ０.５９ｂ０.６６ｃ０.５４ｂ２.３㊀ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲幼苗植株生长的影响盐胁迫处理３０ｄ时柱果铁线莲幼苗生长状况见表３ꎮ与Ｔ０相比ꎬＴ１处理幼苗株高㊁茎粗㊁单株地上部干重㊁单株地下部干重均显著下降ꎬ降幅分别为３７.６３％㊁３４.６６％㊁３２.０７％和３２.３６％ꎮ与Ｔ０相比ꎬＴ２处理幼苗各生长指标值均显著增大ꎬ可见ꎬＮＡＣ对柱果铁线莲幼苗具有一定的促生作用ꎮ与Ｔ０相比ꎬＴ３处理幼苗株高㊁茎粗㊁地上部干重显著下降ꎬ而地下部干重则差异不显著ꎻ与Ｔ１相比ꎬＴ３处理幼苗株高㊁茎粗㊁地上部干重㊁地下部干重显著增大ꎬ分别增３２.９９％㊁４９.７７％㊁３６.５２％㊁４５.６６％ꎮ综上表明ꎬＮＡＣ可以促进柱果铁线莲幼苗植株生长ꎬ还能缓解盐胁迫对其生长的抑制作用ꎮ同时ꎬ从植株叶片生长情况(表３)可以看出ꎬ盐胁迫导致叶片发黄ꎬ严重时植株死亡ꎬ而添加外源ＮＡＣ可以减轻叶片变黄程度ꎬ提高植株盐胁迫抗逆能力ꎮ㊀㊀表３㊀ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲幼苗植株生长的影响处理株高(ｃｍ)茎粗(ｍｍ)单株地上部干重(ｇ)单株地下部干重(ｇ)生长状况Ｔ０１５.３６ʃ２.６７ｂ６.５２ʃ０.７４ｂ２.６２ʃ０.１５ｂ０.６８ʃ０.０５ｂ叶片正常Ｔ１９.５８ʃ１.２６ｄ４.２６ʃ０.６２ｄ１.７８ʃ０.１９ｄ０.４６ʃ０.０４ｃ叶片严重发黄ꎬ部分植株死亡Ｔ２１７.６３ʃ３.３９ａ６.８３ʃ０.７６ａ２.８６ʃ０.３３ａ０.８４ʃ０.０８ａ叶片正常Ｔ３１２.７４ʃ２.５５ｃ６.３８ʃ０.６８ｃ２.４３ʃ０.１８ｃ０.６７ʃ０.０７ｂ少部分叶片变黄２.４㊀ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系渗透调节物质的影响ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系渗透调节物质的影响结果见图１ꎮ可知ꎬ随着生长进程ꎬ对照(Ｔ０)和ＮＡＣ(Ｔ２)处理幼苗根系脯氨酸和可溶性糖含量变化不显著ꎬ可溶性蛋白含量则出现先增加后降低趋势ꎬ第１０天与第３０天时可溶性蛋白含量差异不显著ꎻＴ１㊁Ｔ３处理幼苗根系脯氨酸㊁可溶性糖含量均是先增加后降低ꎬ可溶性蛋白含量则是第１０天最高ꎬ之后逐渐下降ꎬ第３０５４㊀第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀唐茜ꎬ等:Ｎ－乙酰半胱氨酸对盐胁迫下柱果铁线莲种子萌发和幼苗生长的促进效应天时最低ꎮ与Ｔ０相比ꎬＴ１㊁Ｔ２㊁Ｔ３处理幼苗根系脯氨酸含量均显著增加ꎬ其中Ｔ１显著高于Ｔ０㊁Ｔ２和Ｔ３ꎮ与Ｔ０相比ꎬ除第１０天外ꎬＴ１㊁Ｔ３处理根系可溶性糖含量均显著增加ꎻ与Ｔ１相比ꎬＴ３处理根系可溶性糖含量显著降低ꎮ盐胁迫第１０天时ꎬ与Ｔ０相比ꎬＴ１㊁Ｔ３处理可溶性蛋白含量显著增加ꎬＴ３显著高于Ｔ１ꎻ第２０㊁３０天时Ｔ１处理可溶性蛋白含量均显著低于其它处理ꎬＴ３处理可溶性蛋白含量则显著高于其它处理ꎮ综上可见ꎬ盐胁迫对幼苗根系渗透调节物质含量的影响很大ꎬ而添加外源ＮＡＣ可以有效缓解盐胁迫作用ꎮ柱上不同小写字母表示处理间差异达到０.０５显著水平ꎬ下同ꎮ图１㊀不同处理柱果铁线莲幼苗根系中㊀㊀渗透调节物质含量变化２.５㊀ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系渗透调节离子含量的影响从表４中可以看出ꎬ非盐胁迫下ꎬ第１０㊁２０㊁３０天Ｔ０㊁Ｔ２处理幼苗根系Ｎａ＋㊁Ｋ＋㊁Ｃａ２＋含量和Ｋ＋/Ｎａ＋㊁Ｃａ２＋/Ｎａ＋值均变化较小ꎬ相互间不存在显著差异ꎮ盐胁迫下ꎬＴ１㊁Ｔ３处理幼苗根系Ｎａ＋㊁Ｋ＋㊁Ｃａ２＋含量随着盐胁迫时间延长均发生明显变化ꎬ其中Ｎａ＋含量均逐渐升高ꎻＫ＋㊁Ｃａ２＋含量及Ｋ＋/Ｎａ＋㊁Ｃａ２＋/Ｎａ＋值Ｔ１处理逐渐降低ꎬＴ３处理逐渐升高ꎮ与Ｔ０相比ꎬ第１０㊁２０㊁３０天Ｔ１处理幼苗根系Ｎａ＋含量显著升高ꎬ分别高出１０.６５㊁１７.３３㊁２４.１２倍ꎻＫ＋含量显著降低ꎬ分别降４０.６１％㊁４７.２５％和５５.１１％ꎻＣａ２＋含量显著降低ꎬ分别降４０.６１％㊁５３.９６％㊁６１.６０％ꎮ与Ｔ１相比ꎬ第１０㊁２０㊁３０天Ｔ３处理幼苗根系Ｎａ＋含量显著降低ꎬ分别降２１.３８％㊁５２.２４％㊁６１.４１％ꎻＫ＋含量显著升高ꎬ分别高２１.４１％㊁５５.６０％㊁９２.４８％ꎻＣａ２＋含量显著升高ꎬ分别高１３.１７％㊁７１.１０％㊁１３２.８０％ꎻＫ＋/Ｎａ＋值显著升高ꎬ分别高５５.２４％㊁２２５.４６％㊁３９４.６０％ꎻＣａ２＋/Ｎａ＋值显著升高ꎬ分别高４６.４３％㊁２５７.７０％㊁５１２.５０％ꎮ综上表明ꎬ盐胁迫使柱果铁线莲幼苗根系参与渗透调节的Ｎａ＋含量显著升高ꎬＫ＋㊁Ｃａ２＋含量显㊀㊀表４㊀㊀ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系离子含量的影响(ｍｇ/ｇ)指标处理１０ｄ２０ｄ３０ｄＮａ＋Ｔ０１.９２ʃ０.０６ｃ２.１５ʃ０.１１ｃ２.１３ʃ０.１３ｃＴ１２２.３６ʃ１.３５ａ３９.４２ʃ１.６４ａ５３.５１ʃ２.１７ａＴ２２.０５ʃ０.０９ｃ２.３６ʃ０.０８ｃ２.５５ʃ０.１２ｃＴ３１７.５８ʃ０.７８ｂ１８.８３ʃ１.２２ｂ２０.６５ʃ０.８９ｂＫ＋Ｔ０３９.６５ʃ２.３５ａ４１.０２ʃ２.７４ａ４３.８１ʃ１.８２ａＴ１２３.５５ʃ１.７８ｃ２１.６４ʃ１.６３ｃ１９.６７ʃ１.５２ｃＴ２４０.３８ʃ２.１７ａ４２.６４ʃ３.１１ａ４５.８２ʃ２.８２ａＴ３２８.５９ʃ１.６４ｂ３３.６７ʃ２.１１ｂ３７.８６ʃ１.８８ｂＣａ２＋Ｔ０２１.６７ʃ１.２６ａ２２.３９ʃ１.７２ａ２２.５５ʃ１.８３ａＴ１１２.６８ʃ１.３３ｃ１０.３１ʃ０.８２ｃ８.６６ʃ０.５４ｃＴ２２２.５１ʃ１.７２ａ２３.０６ʃ１.９５ａ２２.８２ʃ２.３１ａＴ３１４.３５ʃ１.９５ｂ１７.６４ʃ２.０７ｂ２０.１６ʃ１.８６ｂＫ＋/Ｎａ＋Ｔ０２０.６５ʃ１.０４ａ１９.０８ʃ０.９７ａ２０.５７ʃ１.２６ａＴ１１.０５ʃ０.０２ｃ０.５５ʃ０.０６ｃ０.３７ʃ０.０５ｃＴ２１９.７０ʃ０.８７ａ１８.０７ʃ０.６８ａ１９.５０ʃ０.６３ａＴ３１.６３ʃ０.４５ｂ１.７９ʃ０.０４ｂ１.８３ʃ０.０５ｂＣａ２＋/Ｎａ＋Ｔ０１１.２８ʃ０.４６ａ１０.４１ʃ０.９５ａ１０.５９ʃ０.６６ａＴ１０.５６ʃ０.０４ｃ０.２６ʃ０.０２ｃ０.１６ʃ０.０３ｃＴ２１０.９８ʃ１.２３ａ９.７７ʃ１.７３ａ９.７１ʃ１.９０ａＴ３０.８２ʃ０.０７ｂ０.９３ʃ０.０３ｂ０.９８ʃ０.０８ｂ６４㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀著降低ꎬ从而使根系细胞的渗透势降低㊁胁迫加重ꎬ给幼苗根系带来离子毒害ꎬ使植株无法正常生长ꎻ添加外源ＮＡＣ后ꎬ根系细胞渗透势得到提高ꎬ从而提升了幼苗盐胁迫下的渗透调节能力ꎬ缓解细胞离子失衡现象ꎬ减轻根系的离子胁迫ꎮ２.６㊀ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系ＭＤＡ和Ｈ２Ｏ２含量的影响盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系ＭＤＡ和Ｈ２Ｏ２含量的变化见图２ꎮ可知ꎬ在非盐胁迫下ꎬＴ０和Ｔ２处理幼苗根系ＭＤＡ㊁Ｈ２Ｏ２含量一直维持在一个较低水平ꎬ随着培养时间延长ꎬ均出现先升高后降低趋势ꎻ盐胁迫下ꎬ随着处理时间延长ꎬＴ１处理幼苗根系ＭＤＡ㊁Ｈ２Ｏ２均逐渐升高ꎬ而Ｔ３则先升高后降低ꎮ与Ｔ０相比ꎬ盐胁迫第１０㊁２０㊁３０天Ｔ１处理幼苗ＭＤＡ含量显著增多ꎬ分别增加１２０.５５％㊁１１２.５６％㊁２３６.６３％ꎻＨ２Ｏ２含量也显著增多ꎬ分别增加９４.３８％㊁８４.２１％和１８２.３１％ꎮ与Ｔ１相比ꎬ盐胁迫第１０㊁２０㊁３０天Ｔ３处理幼苗ＭＤＡ含量显著降低ꎬ分别减少２９.１６％㊁２３.０５％㊁５６.５２％ꎻＨ２Ｏ２含量也显著降低ꎬ分别减少２２.８３％㊁１９.１４％㊁４９.６４％ꎮ综上表明ꎬ盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系细图２㊀ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系㊀㊀ＭＤＡ、Ｈ２Ｏ２含量的影响胞内产生大量ＭＤＡ和Ｈ２Ｏ２ꎬ添加外源ＮＡＣ可在一定程度上缓解幼苗的盐胁迫ꎬ减轻细胞的脂质过氧化ꎮ２.７㊀ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系抗氧化酶活性的影响柱果铁线莲幼苗根系抗氧化酶活性变化见图３ꎮ可以看出ꎬ在非盐胁迫下ꎬ随生育进程ꎬＴ０㊁Ｔ２处理幼苗根系ＳＯＤ活性先升高后降低ꎬＣＡＴ活性则呈小幅逐渐升高趋势ꎬＰＯＤ活性则维持在一个较低水平ꎮ第１０㊁２０㊁３０天ꎬＴ０㊁Ｔ２处理幼苗根系ＳＯＤ㊁ＣＡＴ㊁ＰＯＤ活性变化均无显著差异ꎬ可见ꎬ添加外源ＮＡＣ对幼苗根系不存在胁迫作用ꎮ盐胁迫初期ꎬ与Ｔ０处理相比ꎬＴ１㊁Ｔ３处理幼苗根系ＳＯＤ㊁ＣＡＴ㊁ＰＯＤ活性显著升高ꎻ随着盐胁图３㊀ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系抗氧化酶活性的影响７４㊀第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀唐茜ꎬ等:Ｎ－乙酰半胱氨酸对盐胁迫下柱果铁线莲种子萌发和幼苗生长的促进效应迫时间延长ꎬＴ１㊁Ｔ３处理ＳＯＤ活性均先升高后降低ꎬＣＡＴ活性均逐渐上升ꎬ而ＰＯＤ活性两处理变化趋势不同ꎬＴ１逐渐下降ꎬＴ３则先升高后降低ꎮ与Ｔ１相比ꎬ第１０㊁２０㊁３０天Ｔ３处理幼苗根系ＳＯＤ活性分别提高３.６３％㊁７.３１％㊁８３.０２％ꎬ后两者达显著水平ꎻＣＡＴ活性分别提高２１.５３％㊁２９.３９％㊁２３.５６％ꎬ均差异显著ꎻＰＯＤ活性分别提高１.９４％㊁４６.９２％㊁５６.７０％ꎬ后两者达显著水平ꎮ综上表明ꎬ盐胁迫使柱果铁线莲幼苗根系抗氧化酶活性发生显著变化ꎬ添加外源ＮＡＣ可以进一步提高ＳＯＤ㊁ＣＡＴ㊁ＰＯＤ活性ꎬ有助于清除细胞内过多的ＲＯＳꎬ缓解根系细胞质膜的氧化损伤ꎬ维持其正常生长发育ꎮ３㊀讨论３.１㊀ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲种子萌发和幼苗生长的影响种子萌发是植物整个生长周期中的起始阶段ꎬ此阶段最易遭受外界环境的非生物胁迫ꎮ种子萌发活性的强弱在一定程度上影响着植株的后续生长ꎮ植物遭受最广泛的非生物胁迫即盐碱胁迫ꎬ它严重影响种子萌发和植株生长发育[１７ꎬ１８]ꎮ董飞等[１９]研究不同浓度盐胁迫对菊科植物种子萌发的影响时发现ꎬ随着盐胁迫浓度增大ꎬ种子萌发指数显著降低ꎬ胚芽㊁胚根生长均呈现下降趋势ꎻＷｕ等[２０]研究指出ꎬ盐胁迫显著降低番茄产量和品质ꎻＪａｌｉｌｉ等[２１]发现ꎬ盐胁迫显著提高紫花苜蓿体内的氧化应激损伤ꎬ造成植株死亡ꎮ本研究结果表明ꎬ柱果铁线莲在１００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ胁迫下ꎬ种子发芽率㊁发芽势㊁发芽指数㊁活力指数均显著降低ꎬ另外幼苗根系生长也受到显著抑制ꎬ同时还显著降低株高㊁茎粗㊁地上部干重和地下部干重ꎬ可见ꎬ盐胁迫不仅对柱果铁线莲种子萌发还对幼苗生长产生严重的毒害作用ꎮ这一研究结果与张凤娥[２２]㊁王凯[７]㊁李洪瑶[８]等的研究结果相似ꎮ造成这一毒害作用的原因主要是盐分改变土壤含水比㊁形成渗透胁迫ꎬ使种子和根系难以在环境中吸收到足够水分ꎬ导致体内物质合成受阻ꎬ从而影响种子萌发和幼苗正常生长ꎮＮ－乙酰半胱氨酸(ＮＡＣ)属于小分子物质ꎬ不需要主动运输即可直接进入细胞ꎬ在植物体内不仅可以作为合成谷胱甘肽酶(ＧＳＨ)的前体物质ꎬ其本身还是一种非酶抗氧化物质ꎬ具有缓解植物非生物胁迫作用[２３]ꎮ本研究发现ꎬ盐胁迫下外源添加１ｍｍｏｌ/ＬＮＡＣ溶液时ꎬ柱果铁线莲种子各萌发指标均得到显著提高ꎬ另外发现ＮＡＣ不仅促进幼苗根系生长㊁提高根系活力ꎬ还进一步促进植株生长和生物量积累ꎮ表明ꎬ添加一定浓度的外源ＮＡＣ能够缓解ＮａＣｌ对柱果铁线莲种子和幼苗的胁迫作用ꎬ提高其对非生物胁迫的抵抗能力ꎮ３.２㊀ＮＡＣ对盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系渗透调节物质的影响盐碱㊁重金属㊁高低温等非生物胁迫严重影响植物生长㊁果实品质ꎬ为缓解环境的胁迫作用ꎬ植物体内形成了一套复杂的防御机制ꎮ渗透调节是植物应对逆境胁迫的主要作用机制之一ꎬ脯氨酸㊁可溶性蛋白㊁可溶性糖是植物体内主要的渗透调节物质ꎮ脯氨酸在植物体内处于游离状态ꎬ在受到胁迫时会大量积累ꎬ调节细胞渗透势ꎬ另外其本身还是关键的抗氧化物质[２４ꎬ２５]ꎮ可溶性糖在植物体内不仅是合成有机化合物的原料ꎬ在细胞受到逆境胁迫时还能提高自身含量来保护细胞内的酶活性ꎬ从而起到缓解逆境胁迫的作用[２６]ꎮ本研究结果显示ꎬ非盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系脯氨酸㊁可溶性糖含量均处于较低水平ꎬ但盐胁迫下其根系脯氨酸㊁可溶性糖含量显著上升ꎬ且随着胁迫时间延长其含量均先升高后降低ꎬ总体一直处于较高水平ꎻ添加外源ＮＡＣ后幼苗根系脯氨酸㊁可溶性糖含量显著低于单独盐胁迫处理ꎬ且随着时间延长ꎬ脯氨酸㊁可溶性糖含量均呈现先升高后降低趋势ꎮ表明ꎬ盐处理对柱果铁线莲幼苗产生显著的胁迫作用ꎬ幼苗体内通过积累脯氨酸㊁可溶性糖含量来缓解这种胁迫作用ꎬ而添加ＮＡＣ则缓解盐对幼苗的胁迫作用ꎬ脯氨酸㊁可溶性糖含量显著低于单独盐处理ꎬ但仍显著高于对照ꎮ此外ꎬ可溶性蛋白在植物受到逆境胁迫时同样起着重要作用ꎬ其不仅是植物所需的营养物质ꎬ在逆境胁迫下还对生物膜和碳物质起保护作用[２７]ꎮ本研究结果显示ꎬ盐胁迫第１０天ꎬ与对照相比ꎬ盐处理(Ｔ１)及其添加外源ＮＡＣ处理(Ｔ３)可溶性蛋白含量显著增加ꎬ且Ｔ３显著高于Ｔ１ꎻ第２０㊁３０天Ｔ１处理可溶性蛋白含量均显著低于其它处理ꎬＴ３处理可溶性蛋白含量则显著高于其它处理ꎮ说明添加外源ＮＡＣ可以有效提高幼苗根８４㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀系可溶性蛋白含量ꎬ进而提高自身的渗透调节能力㊁缓解盐胁迫ꎮ植物的渗透调节物质还包括体内的无机离子ꎬ如Ｎａ＋㊁Ｋ＋㊁Ｃａ２＋等ꎬ盐胁迫下根系会吸收较多的Ｎａ＋ꎬ使细胞内Ｎａ＋水平显著升高ꎬＫ＋含量则显著降低ꎬ另外细胞内大量的Ｎａ＋会与Ｃａ２＋发生交换ꎬ使Ｃａ２＋含量降低ꎬ细胞内的离子平衡被严重打破ꎬ使得植物对外界矿质离子的吸收受阻ꎬ影响植物的新陈代谢[２８]ꎮ本研究结果显示ꎬ盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系Ｎａ＋含量显著升高ꎬ相应的Ｋ＋㊁Ｃａ２＋含量和Ｋ＋/Ｎａ＋㊁Ｃａ２＋/Ｎａ＋值显著降低ꎬ根系离子平衡被严重破坏ꎬ胁迫加剧ꎬ且随着胁迫时间延长ꎬ这种胁迫程度愈发严重ꎻ盐胁迫下添加外源ＮＡＣꎬ根系Ｎａ＋含量显著降低ꎬＫ＋㊁Ｃａ２＋含量和Ｋ＋/Ｎａ＋㊁Ｃａ２＋/Ｎａ＋值显著升高ꎬ说明添加ＮＡＣ促进根系对Ｋ＋㊁Ｃａ２＋的选择运输ꎬ提高细胞的渗透势ꎬ从而改善根系的离子平衡ꎮ这可能是因为ＮＡＣ具有促进根系生长和提高根系活力的能力ꎬ使得根系离子的渗透调节能力得到加强ꎬ从而提高柱果铁线莲幼苗抗盐胁迫的能力ꎮ３.３㊀ＮＡＣ缓解盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系氧化损伤的作用盐胁迫下ꎬ植物根系细胞会大量积累ＭＤＡꎬ导致膜脂过氧化ꎬ且当ＭＤＡ积累到一定程度时会进一步使细胞内部产生大量活性氧(ＲＯＳ)ꎬ影响植株正常生长发育ꎬ而Ｈ２Ｏ２是典型的ＲＯＳ之一ꎬ因此ꎬ通过检测植株根系细胞内ＭＤＡ和Ｈ２Ｏ２含量可以反映植株的逆境胁迫能力[２９]ꎮ本研究结果显示ꎬ盐胁迫下柱果铁线莲幼苗根系ＭＤＡ㊁Ｈ２Ｏ２含量显著升高ꎬ且随着胁迫时间延长ꎬ两者含量随之显著增多ꎬ这与刘晓涵等[２９]的研究结果类似ꎻ与盐胁迫处理相比ꎬ盐胁迫下添加ＮＡＣ处理幼苗根系ＭＤＡ和Ｈ２Ｏ２含量均显著降低ꎬ且均随处理时间延长而先升高后降低ꎬ说明ＮＡＣ在一定程度上能提高植物的抗盐胁迫能力ꎬ能缓解ＮａＣｌ对柱果铁线莲幼苗产生的氧化损伤ꎮ植物在非生物胁迫下已经形成由ＳＯＤ㊁ＣＡＴ㊁ＰＯＤ等组成的氧化应激体系ꎬ它可以有效清除植物体内过多的ＲＯＳ和自由基ꎬ使植物对环境胁迫产生一定的抗性ꎮ谢文辉等[３０]研究发现葛藤幼苗在盐胁迫下显著提高叶片内抗氧化酶活性ꎻＳａｒｗａｒ等[３１]研究发现ꎬ辣椒幼苗在盐胁迫初期体内抗氧化酶活性会显著升高ꎬ胁迫时间延长时抗氧化酶活性呈现下降趋势ꎮ本研究结果同样显示ꎬ柱果铁线莲幼苗盐胁迫初期根系抗氧化酶活性会显著升高ꎬ随着胁迫时间延长ＳＯＤ活性会先升高后逐渐下降ꎬＣＡＴ活性则逐渐升高ꎬＰＯＤ活性则逐渐降低ꎻ盐胁迫同时添加外源ＮＡＣ后ꎬ根系ＳＯＤ㊁ＣＡＴ㊁ＰＯＤ活性会进一步提高ꎬ均高于盐胁迫处理ꎮ这一研究结果与Ｃｏｌａｋ[１２]㊁Ｐｉｃｃｈｉ[１３]㊁董倩[１４]等的研究结果相似ꎮ表明ꎬ逆境胁迫下添加外源ＮＡＣ能够激活柱果铁线莲幼苗体内的抗氧化酶系统ꎬＳＯＤ㊁ＣＡＴ㊁ＰＯＤ活性显著升高ꎬ从而清除体内积累的Ｈ２Ｏ２ꎬ缓解盐胁迫造成的氧化损伤ꎬ达到促进植株健康生长的目的ꎮ４㊀结论本研究结果表明ꎬ添加外源ＮＡＣ能够有效缓解ＮａＣｌ对柱果铁线莲种子和幼苗的胁迫作用ꎬ促进植株生长ꎮ其具体的作用机制主要通过两个方面来实现:一是ＮＡＣ提高根系渗透调节物质脯氨酸㊁可溶性糖㊁可溶性蛋白㊁Ｋ＋㊁Ｃａ２＋含量ꎬ提高细胞的渗透调节能力ꎬ维持稳定的渗透压和离子平衡ꎬ从而提高根系对盐胁迫的抗性ꎻ二是ＮＡＣ激活植物体内抗氧化酶防御系统ꎬ使ＳＯＤ㊁ＣＡＴ㊁ＰＯＤ活性显著升高ꎬ清除体内产生的大量ＲＯＳꎬ缓解细胞的脂质过氧化作用ꎬ维持柱果铁线莲细胞质膜的稳定性㊁完整性ꎮ综之ꎬ在１００ｍｍｏｌ/ＬＮａＣｌ胁迫下添加１ｍｍｏｌ/ＬＮＡＣꎬ可以显著缓解盐胁迫对柱果铁线莲种子和幼苗的毒害作用ꎮ这种缓解作用在蛋白质组学和代谢组学方面的机制还有待进一步研究ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀郭敏ꎬ王楠ꎬ付畅.植物根系耐盐机制的研究进展[Ｊ].生物技术通报ꎬ２０１２(６):７－１２.[２]㊀孙浩月ꎬ吴洪斌ꎬ李明ꎬ等.褪黑素浸种对盐胁迫下芸豆幼苗生长及生理特性的影响[Ｊ].河南农业科学ꎬ２０２１ꎬ５０(１２):１１１－１２０.[３]㊀刘昊ꎬ王倩ꎬ徐惠敏ꎬ等.盐胁迫对小果黑核桃幼苗外部形态和生理变化的影响[Ｊ].天津农学院学报ꎬ２０２１ꎬ２８(４):１－５.[４]㊀高晓洁ꎬ张水利.天目山自然保护区铁线莲属药用植物资源调查研究[Ｊ].中国现代应用药学ꎬ２０２０ꎬ３７(９):１０５８－１０６２.[５]㊀ＦｒａｇａＳꎬＮａｓáｒｉｏＦＤꎬＧｏｎçａｌｖｅｓＤꎬｅｔａｌ.Ｃａｆｅｒａｎａｓｅｅｄｓ(Ｂｕｎ￣９４㊀第３期㊀㊀㊀㊀㊀㊀唐茜ꎬ等:Ｎ－乙酰半胱氨酸对盐胁迫下柱果铁线莲种子萌发和幼苗生长的促进效应。

植物资源与环境学报,2019,28(2):42-48Journal of Plant Resources and Environment铁线莲属植物ISSR -PCR 反应体系优化及遗传多样性分析余伟军1,姚㊀红1,孙瑞琦1,王桂青1,钟淮钦2,黄敏玲2,①,曾黎辉1,①(1.福建农林大学园艺学院,福建福州350002;2.福建省农业科学院作物研究所,福建福州350013)摘要:对铁线莲属(Clematis Linn.)植物基因组DNA 的ISSR -PCR 反应体系进行了优化,并采用ISSR 分子标记对32个铁线莲属植物(包括8个野生种㊁1个变种和23个品种)及2个近缘属植物的遗传多样性进行研究㊂结果显示:铁线莲属植物基因组DNA ISSR -PCR 最佳反应体系的总体积为25.0μL,包括40ng㊃μL -1模板DNA 1.0μL㊁0.4μmol㊃L -1引物1.0μL㊁0.15mmol㊃L -1d NTPs 2.0μL㊁10ˑEx Taq Buffer(Mg 2+Plus)2.0μL㊁TaKaRa Ex Taq 酶0.2μL 和ddH 2O 18.8μL㊂对32个铁线莲属植物及2个近缘属植物基因组DNA 的ISSR -PCR 分析结果显示:共扩增出172个条带(位点),平均每条引物扩增出13.2个位点,其中,多态性位点168个,平均每条引物扩增出12.9个多态性位点,平均多态性位点百分率为98.2%㊂聚类分析结果显示:32个铁线莲属植物及2个近缘属植物的遗传距离在0.22~1.21之间㊂在遗传距离1.02处,将32个铁线莲属植物分为3个大组, 杰出 ( Superba )单独聚为1个大组, 斯托尔韦克 ( Stolwijk Gold )和 柠檬之梦 ( Lemon Dream )聚为1个大组,其余植物聚为第3大组;在遗传距离0.92处,将第3大组进一步划分为3个亚组,第1亚组包括 阿迪森 ( Addisonii )㊁ 帕斯卡( Pascal )和 樱桃唇 ( Cherry Lip ),第2亚组包括短柱铁线莲(C.cadmia Buch.-Ham.ex Wall.)㊁灰叶铁线莲C.canescens (Turcz.)W.T.Wang et M.C.Chang ㊁毛蕊铁线莲(siandra Maxim.)㊁曲柄铁线莲(C.repens Finet et Gagnep.)㊁ 铃儿响叮当 ( Jingle Bells )和 雀斑 ( Freckles ),第3亚组包括吴兴铁线莲(C.huchouensis Tamura)等20个铁线莲属植物;在遗传距离0.77处,将第3亚组划分为7个小组㊂研究结果表明:ISSR 分子标记能够应用于铁线莲属植物的遗传多样性分析㊂关键词:铁线莲属;ISSR -PCR;反应体系优化;遗传多样性中图分类号:Q946-33;S68㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1674-7895(2019)02-0042-07DOI:10.3969/j.issn.1674-7895.2019.02.06收稿日期:2018-08-31基金项目:福建农林大学科技创新项目(KFA17352A);福建省自然科学基金项目(2016J01109)作者简介:余伟军(1991 ),男,福建宁德人,硕士研究生,主要从事铁线莲及百香果遗传育种方面的研究㊂①通信作者E-mail:837223458@;lhzeng@Optimization of ISSR-PCR reaction system and analysis on genetic diversity of Clematis plants㊀㊀㊀YU Weijun 1,YAO Hong 1,SUN Ruiqi 1,WANG Guiqing 1,ZHONG Huaiqin 2,HUANG Minling 2,①,ZENG Lihui 1,①(1.College of Horticulture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China;2.Crop Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013,China),J.Plant Resour.&Environ.,2019,28(2):42-48Abstract :ISSR-PCR reaction system of genomic DNA of Clematis Linn.plants was optimized,and genetic diversity of 32plants of Clematis (including 8wild species,1variety,and 23cultivars)and 2plants of related genera was researched by using ISSR molecular marker.The results show that total volume of optimal ISSR-PCR reaction system of genomic DNA from Clematis plants is 25.0μL,including 1.0μL of 40ng㊃μL -1template DNA,1.0μL of 0.4μmol㊃L -1primer,2.0μL of 0.15mmol㊃L -1d NTPs,2.0μL of Ex Taq Buffer (Mg 2+Plus),0.2μL of TaKaRa Ex Taq polymerase,18.8μL of ddH 2O.The result of ISSR-PCR analysis on genomic DNA from 32plants of Clematis and 2plants of第2期余伟军,等:铁线莲属植物ISSR-PCR反应体系优化及遗传多样性分析related genera shows that172bands(loci)are amplified with average of13.2loci per primer,in which, there are168polymorphic loci with average of12.9polymorphic loci per primer and average percentage of polymorphic loci of98.2%.The cluster analysis result shows that genetic distance of32plants of Clematis and2plants of related genera is0.22-1.21.At the genetic distance of1.02,32plants of Clematis are divided into three major groups, Superba is clustered into one major group, Stolwijk Gold and Lemon Dream are clustered into one major group,the rest are clustered into the third major group.At the genetic distance of0.92,the third major group is further divided into three subgroups,the first subgroup includes Addisonii , Pascal ,and Cherry Lip ,and the second subgroup does C.cadmia Buch.-Ham.ex Wall.,C.canescens(Turcz.)W.T.Wang et M.C.Chang,siandra Maxim.,C.repens Finet et Gagnep., Jingle Bells ,and Freckles ,the third subgroup does20plants of Clematis such as C.huchouensis Tamura.At the genetic distance of0.77,the third subgroup is divided into seven small groups.It is suggested that ISSR molecular marker can be applied to the genetic diversity analysis on Clematis plants.Key words:Clematis Linn.;ISSR-PCR;reaction system optimization;genetic diversity㊀㊀铁线莲(Clematis florida Thunb.)中观花品种的观赏性好㊁抗逆性强,是园林应用中不可多得的藤本花卉㊂铁线莲在日本以及欧洲许多国家的各类花园和家庭园艺中均有应用[1],深受人们喜爱㊂铁线莲属(Clematis Linn.)中部分种类具有清热利尿和止痛祛风等功效[2],药用价值和经济价值很高㊂目前,越来越多的研究人员致力于铁线莲属植物的开发与利用,以获得更大的市场效益㊂全世界铁线莲属植物有350多种[3],除南极洲外,在全世界范围内广泛分布㊂国内该属植物超过140种,在全国各地均有分布,其中,在华中和西南地区的分布面积较大,并且,该属植物在云南分布的种类最多,约有60种以及20变种[4]㊂‘中国植物志“[5]89-235将铁线莲属植物划分为8组:尾叶铁线莲组 Sect.Viorna(Reichb.)Prantl ㊁长瓣铁线莲组 Sect.Atragene(Linn.)DC. ㊁黄花铁线莲组 Sect.Meclatis(Spach)Tamura ㊁灌木铁线莲组(Sect.Fruticella Tamura)㊁威灵仙组(Sect.Clematis Tamurin)㊁铁线莲组(Sect.Viticella DC.)㊁绣球藤组(Sect.Cheiropsis DC.)和丝铁线莲组(Sect. Naraveliopsis Hand.-Mazz.)㊂已有研究者对铁线莲属植物的组织构造㊁细胞学和形态特征等方面[6-10]进行研究,为该属植物的鉴定和分类奠定了基础㊂由于铁线莲属植物分布广泛,种类繁多,遗传背景复杂多样,仅通过花萼性状和雄蕊被毛等生物学特征不能准确地鉴定和分类,因此,应在形态学研究的基础上结合分子生物学方法,对该属植物进行更全面的研究㊂ISSR(inter-simple sequence repeat)分子标记使用的引物无需了解DNA序列,且较RFLP㊁RAPD和SSR具有更高的多态性和遗传稳定性[11-12]㊂本研究利用ISSR技术建立铁线莲ISSR-PCR最佳反应体系,对收集的国内外32个铁线莲属植物(包括8个野生种㊁1个变种和23个品种)以及2个近缘属植物 包括铁筷子品种 水晶 (Helleborus thibetanus Winterbells )和耧斗菜品种 喜鹊 (Aquilegia viridiflora Magpie ) 进行亲缘关系和遗传多样性分析,以期为铁线莲属植物中种㊁变种和品种的分类提供科学依据,并为铁线莲属植物种质资源的利用和新品种选育提供理论基础㊂1㊀材料和方法1.1㊀材料供试34份材料中,包括短柱铁线莲(Clematis cadmia Buch.-Ham.ex Wall.)㊁吴兴铁线莲(C. huchouensis Tamura)㊁灰叶铁线莲 C.canescens (Turcz.)W.T.Wang et M.C.Chang ㊁贵州铁线莲(C.kweichowensis C.Pei)㊁毛蕊铁线莲(siandra Maxim.)㊁棉团铁线莲(C.hexapetala Pall.)㊁曲柄铁线莲(C.repens Finet et Gagnep.)和厚叶铁线莲(C. crassifolia Benth.)8个野生种,分别采自浙江省湖州市长兴县㊁浙江省湖州市吴兴区㊁四川省阿坝藏族羌族自治州马尔康县㊁湖北省十堰市竹溪县㊁湖南省怀化市沅陵县㊁北京市怀柔区喇叭沟门满族乡㊁四川省乐山市峨眉山和广东省从化市吕田镇;还包括大花小木通 C.armandii var.farquhariana(Rehder et E.H.Wilson)W.T.Wang 1个变种, 灵感 ( Inspiration )㊁ 如古 ( Rooguchi )㊁ 包查德伯爵34植物资源与环境学报第28卷㊀夫人 ( Comtesse de Bouchaud )㊁ 魔法喷泉 ( Magic Fountain )㊁ 翠鸟 ( Kingfisher )㊁ 钻石 ( Diamantina )㊁ 红星 ( Red Star )㊁ 皇帝 ( Kaiser )㊁ 杰出 ( Superba )㊁ 斯托尔韦克 ( Stolwijk Gold )㊁ 柠檬之梦 ( Lemon Dream )㊁ 阿迪森 ( Addisonii )㊁ 帕斯卡 ( Pascal )㊁ 樱桃唇 ( Cherry Lip )㊁ 苹果花 ( Apple Blossom )㊁ 倒影 ( Reflections )㊁ 乌托邦 ( Utopia )㊁ 绿玉 ( Alba Plena )㊁ 铃儿响叮当 ( Jingle Bells )㊁ 雀斑 ( Freckles )㊁ 波兰精神 ( Polish Spirit )㊁ 前卫 ( Avant Garde )和 开心果 ( Pistachio )23个铁线莲属品种以及铁筷子品种 水晶 和耧斗菜品种 喜鹊 2个近缘属植物,均购自浙江虹越花卉股份有限公司㊂ISSR分子标记使用的86条通用引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成㊂10ˑEx Taq Buffer (Mg2+Plus)㊁d NTPs和TaKaRa Ex Taq酶购自宝生物工程(大连)有限公司㊂1.2㊀方法1.2.1㊀基因组DNA的提取㊀采用CTAB法[13]提取基因组DNA,采用质量体积分数1.0%琼脂糖凝胶电泳检测提取的基因组DNA,并用UV-9000S紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)测定基因组DNA的浓度和质量,于-18ħ保存㊁备用㊂1.2.2㊀ISSR-PCR反应体系的优化㊀在25.0μL ISSR-PCR反应体系中,包括TaKaRa Ex Taq酶0.2μL,10ˑEx Taq Buffer(Mg2+Plus)2.0μL,模板DNA 浓度分别为10㊁20㊁40㊁60㊁80和100ng㊃μL-1,引物浓度分别为0.2㊁0.3㊁0.4㊁0.5和0.6μmol㊃L-1,d NTPs浓度分别为0.10㊁0.15㊁0.20㊁0.25㊁0.30和0.35mmol㊃L-1㊂在进行其中某一因子或水平实验时,其他因子固定为模板DNA浓度40ng㊃μL-1㊁引物浓度0.4μmol㊃L-1及d NTPs浓度0.20 mmol㊃L-1㊂扩增反应程序为:94ħ预变性5min; 94ħ变性50s,50ħ退火l min,72ħ延伸1min,40个循环;72ħ延伸10min㊂PCR产物于4ħ保存㊂扩增反应参数的优化均使用引物879㊂1.2.3㊀ISSR引物的筛选及退火温度的确定㊀利用优化的ISSR-PCR反应体系,以灰叶铁线莲和 樱桃唇 基因组DNA为模板,对86条ISSR引物进行筛选,选出扩增结果重复性好㊁扩增条带清晰且多态性高的引物㊂设置45.7ħ㊁47.7ħ㊁50.4ħ㊁51.8ħ㊁54.0ħ和55.4ħ6个退火温度,确定所筛选引物的最佳退火温度㊂1.2.4㊀ISSR扩增㊀利用筛选出来的引物㊁最佳退火温度以及优化的ISSR-PCR反应体系对供试34份材料的基因组DNA进行扩增㊂扩增产物在0.5ˑTAE 电泳缓冲液中用质量体积分数1.5%琼脂糖凝胶电泳分离,EB染色10min,JS-2000凝胶成像分析系统(上海培清科技有限公司)扫描并保存电泳图㊂1.3㊀数据整理和统计统计ISSR-PCR扩增产物同一位置的条带,有条带记为 1 ,无条带记为 0 ,利用EXCEL2003软件进行数据统计㊂利用SPSS13.0统计分析软件计算各材料间的遗传距离㊂2㊀结果和分析2.1㊀DNA提取及检测部分铁线莲属植物基因组DNA的电泳检测结果见图1㊂结果显示:扩增条带明亮清晰㊂各样品的OD260/OD280比值在1.6~2.0之间,说明蛋白质和多酚类等干扰物质含量少㊂M:DL15000marker.1:短柱铁线莲Clematis cadmia Buch.-Ham.ex Wall.;2:吴兴铁线莲C.huchouensis Tamura;3:灰叶铁线莲C. canescens(Turcz.)W.T.Wang et M.C.Chang;4:贵州铁线莲C. kweichowensis C.Pei;5:毛蕊铁线莲siandra Maxim.;6:棉团铁线莲C.hexapetala Pall.;7: 灵感 Inspiration ;8: 如古 Rooguchi ;9:曲柄铁线莲C.repens Finet et Gagnep.;10: 包查德伯爵夫人 Comtesse de Bouchaud ;11:厚叶铁线莲C.crassifolia Benth.;12: 魔法喷泉 Magic Fountain .图1㊀铁线莲属部分植物基因组DNA的电泳检测结果Fig.1㊀Electrophoresis detection result of genomic DNA from some of Clematis Linn.plants44第2期余伟军,等:铁线莲属植物ISSR -PCR 反应体系优化及遗传多样性分析2.2㊀ISSR -PCR 反应体系优化铁线莲属植物基因组DNA 的ISSR -PCR 反应体系优化结果见图2㊂结果显示:当模板DNA 浓度为40ng㊃μL -1㊁引物浓度为0.4μmol㊃L-1和d NTPs 浓度为0.15mmol㊃L-1时,扩增条带较多且清晰度最好㊂最终确定ISSR -PCR 最佳反应体系的总体积为25.0μL,包括40ng ㊃μL -1模板DNA 1.0μL㊁0.4μmol㊃L -1引物1.0μL㊁0.15mmol㊃L -1d NTPs 2.0μL㊁10ˑEx Taq Buffer (Mg 2+Plus)2.0μL㊁TaKaRaEx Taq 酶0.2μL 和ddH 2O 18.8μL㊂A:模板DNA 浓度,1~6依次为10㊁20㊁40㊁60㊁80和100ng㊃μL -1模板DNA Template DNA concentration,1-6are in order of 10,20,40,60,80,and 100ng㊃μL -1template DNA;B:引物浓度,1~5依次为0.2㊁0.3㊁0.4㊁0.5和0.6μmol㊃L -1引物Primer concentration,1-5are in order of 0.2,0.3,0.4,0.5,and 0.6μmol㊃L -1primer;C:d NTPs 浓度,1~6依次为0.10㊁0.15㊁0.20㊁0.25㊁0.30和0.35mmol㊃L -1d NTPs d NTPs concentration,1-6are in order of 0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,and 0.35mmol㊃L -1d NTPs.M:DL2000marker.图2㊀铁线莲属植物基因组DNA 的ISSR -PCR 反应体系优化结果Fig.2㊀Optimization result of ISSR-PCR reaction system of genomic DNA from Clematis Linn.plants2.3㊀ISSR 引物的筛选和扩增结果分别用灰叶铁线莲和 樱桃唇 的基因组DNA 为模板,对86条ISSR 引物进行筛选,选出扩增条带多且清晰的引物13条㊂对筛选出的13条引物分别设置6个退火温度进行PCR 扩增,确定各引物的最佳退火温度(表1)㊂表1㊀用于32个铁线莲属植物及2个近缘属植物基因组DNA ISSR -PCR 反应的引物和退火温度及扩增结果Table 1㊀Primers and annealing temperature used for ISSR-PCR reaction of genomic DNA from 32plants of Clematis Linn.and 2plants of related genera and their amplification results引物㊀Primer编号No.序列Sequence退火温度/ħAnnealing temperature位点数Number of loci多态性位点数Number of polymorphic loci多态性位点百分率/%Percentage of polymorphic loci811GAGAGAGAGAGAGAGAC 54.0161593.8812GAGAGAGAGAGAGAGAA54.01414100.0835AGAGAGAGAGAGAGAGYC 51.866100.0845CTCTCTCTCTCTCTCTRG 54.0181688.9847CACACACACACACACARC 54.01111100.0854TCTCTCTCTCTCTCTCRG51.855100.0860TGTGTGTGTGTGTGTGRA 54.01313100.0866CTCCTCCTCCTCCTCCTC 55.41717100.0868GAAGAAGAAGAAGAAGAA 51.81515100.0879CTTCACTTCACTTCA 54.01212100.0892TAGATCTGATATCTGAATTCCC 54.0181794.4899CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA 51.81111100.0900ACTTCCCCACAGGTTAACACA54.01616100.0总计Total 172168均值Average13.212.998.254植物资源与环境学报第28卷㊀㊀㊀利用筛选出的13条引物对32个铁线莲属植物及2个近缘属植物基因组DNA 进行ISSR -PCR 反应,扩增结果(表1)显示:13条引物共扩增出172个条带(位点),平均每条引物扩增出13.2个位点,其中,多态性位点168个,平均每条引物扩增出12.9个多态性位点,平均多态性位点百分率为98.2%㊂13条引物中,引物845和892扩增出的位点数最多,均为18个㊂其中,引物886对32个铁线莲属植物及2个近缘属植物基因组DNA 的ISSR -PCR 扩增图谱见图3㊂M:DL2000marker.1:短柱铁线莲Clematis cadmia Buch.-Ham.ex Wall.;2:吴兴铁线莲C.huchouensis Tamura;3:灰叶铁线莲C.canescens (Turcz.)W.T.Wang et M.C.Chang;4:贵州铁线莲C.kweichowensis C.Pei;5:毛蕊铁线莲siandra Maxim.;6:棉团铁线莲C.hexapetala Pall.;7: 灵感 Inspiration ;8: 如古 Rooguchi ;9:曲柄铁线莲C.repens Finet et Gagnep.;10: 包查德伯爵夫人 Comtesse de Bouchaud ;11:厚叶铁线莲C.crassifolia Benth.;12: 魔法喷泉 Magic Fountain ;13: 翠鸟 Kingfisher ;14: 钻石 Diamantina ;15: 红星 Red Star ;16: 皇帝 Kaiser ;17: 杰出 Superba ;18: 斯托尔韦克 Stolwijk Gold ;19: 柠檬之梦 Lemon Dream ;20:耧斗菜品种 喜鹊 Aquilegia viridiflora Magpie ;21:铁筷子品种 水晶 Helleborus thibetanus Winterbells ;22: 阿迪森 Addisonii ;23: 帕斯卡 Pascal ;24: 樱桃唇 Cherry Lip ;25: 苹果花 Apple Blossom ;26: 倒影 Reflections ;27: 乌托邦 Utopia ;28: 绿玉 Alba Plena ;29: 铃儿响叮当 Jingle Bells ;30: 雀斑 Freckles ;31: 波兰精神 Polish Spirit ;32: 前卫 Avant Garde ;33: 开心果 Pistachio ;34:大花小木通C.armandii var.farquhariana (Rehder et E.H.Wilson)W.T.Wang.图3㊀引物866对32个铁线莲属植物及2个近缘属植物基因组DNA 的ISSR -PCR 扩增图谱Fig.3㊀ISSR-PCR amplification pattern of genomic DNA from 32plants of Clematis Linn.and2plants of related genera using primer 8862.4㊀遗传多样性分析基于ISSR -PCR 扩增结果的32个铁线莲属植物及2个近缘属植物的聚类图见图4㊂由图4可以看出:32个铁线莲属植物及2个近缘属植物的遗传距离在0.22~1.21之间,其中,32个铁线莲属植物的遗传距离在0.22~1.09之间,铁筷子品种 水晶 和耧斗菜品种 喜鹊 与32个铁线莲属植物的遗传距离较远㊂在遗传距离1.02处,将32个铁线莲属植物分为3个大组, 杰出 单独聚为1个大组, 斯托尔韦克 和 柠檬之梦 聚为1个大组,其余29个铁线莲属植物聚为第3大组;在遗传距离0.92处,将第3大组进一步划分为3个亚组,第1亚组包括 阿迪森 ㊁ 帕斯卡 和 樱桃唇 ,第2亚组包括短柱铁线莲㊁灰叶铁线莲㊁毛蕊铁线莲㊁曲柄铁线莲㊁ 铃儿响叮当 和 雀斑 ,第3亚组包括吴兴铁线莲等20个铁线莲属植物;在遗传距离0.77处,将第3亚组又进一步划分为7个小组,其中,吴兴铁线莲和贵州铁线莲聚为1个小组㊂供试32个铁线莲属植物中,8个野生种(短柱铁线莲㊁毛蕊铁线莲㊁灰叶铁线莲㊁曲柄铁线莲㊁吴兴铁线莲㊁贵州铁线莲㊁棉团铁线莲和厚叶铁线莲)㊁1个变种(大花小木通)与23个品种间亲缘关系的分析结果显示:短柱铁线莲㊁毛蕊铁线莲㊁灰叶铁线莲和曲柄铁线莲与 铃儿响叮当 和 雀斑 的亲缘关系较近;吴兴铁线莲㊁贵州铁线莲㊁棉团铁线莲和大花小木通与 苹果花 的亲缘关系较近;厚叶铁线莲与 灵感 ㊁ 如古 和 包查德伯爵夫人 等品种的亲缘关系较近㊂64第2期余伟军,等:铁线莲属植物ISSR -PCR反应体系优化及遗传多样性分析1:短柱铁线莲Clematis cadmia Buch.-Ham.ex Wall.;2:吴兴铁线莲C.huchouensis Tamura;3:灰叶铁线莲C.canescens (Turcz.)W.T.Wang et M.C.Chang;4:贵州铁线莲C.kweichowensis C.Pei;5:毛蕊铁线莲siandra Maxim.;6:棉团铁线莲C.hexapetala Pall.;7: 灵感 Inspiration ;8: 如古 Rooguchi ;9:曲柄铁线莲C.repens Finet et Gagnep.;10: 包查德伯爵夫人 Comtesse de Bouchaud ;11:厚叶铁线莲C.crassifolia Benth.;12: 魔法喷泉 Magic Fountain ;13: 翠鸟 Kingfisher ;14: 钻石 Diamantina ;15: 红星 Red Star ;16: 皇帝 Kaiser ;17: 杰出 Superba ;18: 斯托尔韦克 Stolwijk Gold ;19: 柠檬之梦 Lemon Dream ;20:耧斗菜品种 喜鹊 Aquilegia viridiflora Magpie ;21:铁筷子品种 水晶 Helleborus thibetanus Winterbells ;22: 阿迪森 Addisonii ;23: 帕斯卡 Pascal ;24: 樱桃唇 Cherry Lip ;25: 苹果花 Apple Blossom ;26: 倒影 Reflections ;27: 乌托邦 Utopia ;28: 绿玉 Alba Plena ;29: 铃儿响叮当 Jingle Bells ;30: 雀斑 Freckles ;31: 波兰精神 Polish Spirit ;32: 前卫 Avant Garde ;33: 开心果 Pistachio ;34:大花小木通C.armandii var.farquhariana (Rehder et E.H.Wilson)W.T.Wang.图4㊀基于ISSR -PCR 扩增结果的32个铁线莲属植物及2个近缘属植物的聚类图Fig.4㊀Dendrogram of 32plants of Clematis Linn.and 2plants of related genera based on ISSR-PCR amplification result3㊀讨㊀㊀论本研究建立的铁线莲属植物基因组DNA ISSR -PCR 最佳反应体系的总体积为25.0μL,包括40ng㊃μL-1模板DNA 1.0μL㊁0.4μmol㊃L-1引物1.0μL㊁0.15mmol㊃L -1d NTPs 2.0μL㊁10ˑEx Taq Buffer(Mg 2+Plus)2.0μL㊁TaKaRa Ex Taq 酶0.2μL 和ddH 2O 18.8μL㊂筛选出的13条引物对32个铁线莲属植物及2个近缘属植物基因组DNA 的ISSR -PCR反应结果显示:共扩增出172个条带(位点),其中,多态性位点168个,平均多态性位点百分率为98.2%,说明ISSR 分子标记可以应用于铁线莲不同品种以及野生种间的鉴别,也为进一步的杂交育种工74植物资源与环境学报第28卷㊀作中亲本选择与杂交组合的制定提供依据㊂‘铁线莲栽培12月计划“[14]将铁线莲品种划分为常绿组(包括常绿大洋组㊁常绿木通组和常绿卷须组)㊁华丽杂交组㊁葡叶组㊁大叶组㊁西藏组㊁蒙大拿组㊁全缘组㊁德克萨斯组㊁尾叶组㊁长瓣组㊁早花大花组㊁晚花大花组㊁南欧组和佛罗里达组㊂本研究对32个铁线莲属植物的聚类结果与铁线莲的园艺分类结果较为一致,如第1等级划分出蒙大拿组( 杰出 )和长瓣组( 金叶子 和 柠檬之梦 )与其他组间的差异;第2等级划分出德克萨斯组( 阿迪森 ㊁ 帕斯卡 和 樱桃唇 )与其他组之间的差异;第3等级划分出常绿组( 苹果花 )㊁全缘组( 灵感 和 如古 )和大花组( 包查德伯爵夫人 ㊁ 魔法喷泉 ㊁ 翠鸟 ㊁ 钻石 ㊁ 红星 和 皇帝 )与其他组间的差异,由此可见,ISSR分子标记不仅能够区分铁线莲不同品种的分组,对于同一分组中亲缘关系较近的类群也能检测出较高的多态性[15]㊂本研究首次从分子水平鉴定了铁线莲属野生种与品种间的亲缘关系,结果显示:短柱铁线莲㊁毛蕊铁线莲㊁灰叶铁线莲和曲柄铁线莲与常绿卷须组的亲缘关系较近;吴兴铁线莲㊁贵州铁线莲和棉团铁线莲与常绿木通组的亲缘关系较近;厚叶铁线莲与全缘组和早花大花组的亲缘关系较近㊂相关研究结果表明:短柱铁线莲和吴兴铁线莲属于铁线莲组[16],毛蕊铁线莲㊁曲柄铁线莲和贵州铁线莲属于尾叶铁线莲组[17],灰叶铁线莲属于灌木铁线莲组[18],棉团铁线莲属于威灵仙组棉团铁线莲亚组(Subsect.Angustifolia Tamura)[5]153-156,[19],而本文的研究结果显示短柱铁线莲和毛蕊铁线莲的亲缘关系更近,吴兴铁线莲和贵州铁线莲的亲缘关系更近㊂推测导致这一结果的原因可能是由于生物学性状容易受到环境等外界因子的影响,说明传统的生物学形态分类方法不能完全准确鉴定铁线莲属植物的亲缘关系,建议结合分子标记等生物学方法与形态学性状进行进一步验证㊂本研究结果还显示: 魔法喷泉 与 钻石 并非市场上所说的同物异名,而是2个不同的园艺品种㊂此外,2个近缘属植物铁筷子品种 水晶 和耧斗菜品种 喜鹊 与 杰出 的遗传距离较近,建议进行授粉杂交,观察这2个品种是否能够通过与铁线莲属植物进行属间远缘杂交来改造铁线莲属植物的基因组,获得更多的优良性状㊂参考文献:[1]㊀章银柯,江㊀燕.我国铁线莲属植物研究现状及其园林应用[J].北方园艺,2007(3):122-124.[2]㊀陈文允,普春霞.云南省铁线莲属药用资源调查[J].云南中医学院学报,2006,29(1):31-33.[3]㊀王文采,李良千.铁线莲属一新分类系统[J].植物分类学报,2005,43(5):431-488.[4]㊀江㊀南,管开云,王仲朗.云南铁线莲属植物地理分布及区系特征[J].云南植物研究,2007,29(2):145-154. [5]㊀中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志:第二十八卷[M].北京:科学出版社,1999.[6]㊀王㊀璇,张玉华,蔡少青,等.来源于铁线莲属透骨草的鉴别研究[J].中国中药杂志,1998,23(4):198-254. [7]㊀YANG Q E.Cytology of ten species in Anemone,one in Anemoclemaand six in Clematis(Trib.Anemoneae,Ranunculaceae)from China [J].植物分类学报,2002,40(5):396-405.[8]㊀胡玉涛,周政昆.9种铁线莲属药用植物的比较鉴别[J].基层中药杂志,2002,16(4):36-37.[9]㊀SHI J H,LI L Q.Leaf epidermal feature in Clematis(Ranunculaceae)with reference to its systematic significance[J].植物学报,2003,45(3):257-268.[10]㊀孙㊀诚,谢㊀磊,李良千.铁线莲属尾叶铁线莲组(毛茛科)基于形态学证据的分支系统学[J].植物学通报,2007,24(1):87-98.[11]㊀TSUMURA Y,OHBA K,STRAUSS S H.Diversity andinheritance of inter-simple sequence repeat polymorphisms inDouglas-fir(Pseudotsuga menziesii)and sugi(Cryptomeriajaponica)[J].Theoretical and Applied Genetics,1996,92(1):40-45.[12]㊀张立荣,徐大庆,刘大群.SSR和ISSR分子标记及其在植物遗传育种研究中的应用[J].河北农业大学学报,2002,25(1):90-94.[13]㊀赵孟良,韩㊀睿,马胜超,等.菊芋基因组DNA提取方法的比较[J].中国蔬菜,2012(14):41-44.[14]㊀米米童.铁线莲栽培12月计划[M].武汉:湖北科学技术出版社,2018:4-8.[15]㊀韦荣昌,李㊀虹,蒋建刚,等.多倍体无籽罗汉果及其亲本遗传背景的ISSR分析[J].园艺学报,2012,39(2):387-394.[16]㊀WANG W-T.A revision of Clematis sect.Viticella(Ranunculaceae)[J].广西植物,2007,27(1):1-28. [17]㊀谢㊀磊.铁线莲属尾叶铁线莲组的修订 兼论铁线莲属基于花粉形态学证据的系统发育[D].北京:中国科学院植物研究所,2005:29-35.[18]㊀WANG W-T,LI L-Q.A revision of Clematis sect.Fruticella(Ranunculaceae)[J].植物分类学报,2005,43(3):193-209.[19]㊀WANG W-T.A revision of Clematis sect.Clematis(Ranunculaceae)[J].植物分类学报,2003,41(1):1-62.(责任编辑:张明霞)84。

我国铁线莲属植物研究进展我国铁线莲属植物是我国珍稀植物资源之一，被广泛应用于中药、食品、保健品等领域。

近年来，对我国铁线莲属植物的研究取得了一些进展，下面就对其研究进展进行介绍。

我国对铁线莲属植物的系统分类学研究取得了一定成果。

通过对铁线莲属植物的形态特征、生态习性以及遗传物质的分析，初步确定了铁线莲属植物的分类及演化关系。

目前已经发现我国境内共有铁线莲属植物140余种，其中包括了一些新的物种和异名。

对铁线莲属植物的化学成分进行了深入研究。

通过化学成分的研究，发现铁线莲属植物中含有丰富的生物活性成分，包括多种活性物质，如多糖、黄酮、生物碱等。

这些化学成分具有一定的药理学活性，对抗氧化、抗炎、抗肿瘤等具有明显效果。

铁线莲属植物还富含多种维生素、矿物质等营养成分，对人体健康有益。

对铁线莲属植物的药理学研究也有所进展。

通过实验研究发现，铁线莲属植物具有抗菌、抗病毒、降血脂、调节免疫等药理学作用。

铁线莲属植物还具有一定的抗肿瘤效果，可以有效抑制肿瘤细胞的生长和扩散。

对于一些疾病的预防和治疗，铁线莲属植物也具有一定的促进作用。

铁线莲属植物的种质资源保护与利用研究也有所开展。

通过对铁线莲属植物种质资源的调查与收集，建立了一定的铁线莲属植物种质库，并通过资源的保存与鉴定，保护了许多珍稀濒危物种。

对铁线莲属植物的栽培技术研究也取得了一些进展。

通过对铁线莲属植物的适生环境与生长条件的调查研究，研究了其种植技术与栽培方法，为铁线莲属植物的人工种植提供了一定的技术支持。

我国对铁线莲属植物的研究进展较为系统和全面。

在系统分类学、化学成分、药理学、种质资源保护与利用以及栽培技术等方面都取得了一些成果。

但是仍需进一步加强对铁线莲属植物的研究，深入挖掘其药理学活性和营养价值，提高其资源的利用效率，为其在中药、食品等领域的应用开发提供更多的科学依据。

利用叶绿体微卫星分析北美冷杉（松科）的遗传分化CATHERINE M. CLARK, THOMAS R. WENTWORTH, DA VID M. O’MALLEY摘要：对南Appalachian山脉的Fraser fir(Abies fraseri)保护策略是建立在其与相近种balsam (A. balsamea)和中间类型intermediate (A. balsamea var. phanerolepis)的具有截然不同的特点的基础上的。

这些较为接近的物种也存在过渡的类型，渐变种的变异在先前的研究中曾有报道。

利用叶绿体微卫星标记对78个个体的基因组DNA进行聚合酶链式反应扩增以反映Fraser, balsam和intermediate fir的地理分布。

物种间在两个位点上基因多样性水平介于0.65到0.84。

等位基因频率表明物种间存在显著的差异，RST值分别为0.36和0.10。

单倍型多样性和D2SH以balsam fir最高，intermediate fir最低。

基于两个位点的等位基因大小分布进行单倍型系统树分析，表明具有两个截然不同的分支。

其中，92%的单倍型在来自于balsam fir和intermediate fir的一个分支上，84%在来自于Fraser fir和intermediate fir的另一个分支上。

不管分类学等级如何，叶绿体微卫星标记提供的遗传分化能够为Fraser fir的保护确定进化显著单元。

关键词：冷杉属；叶绿体DNA；叶绿体单倍型；叶绿体微卫星；叶绿体SSRs；保护；Fraser fir；松科北美冷杉、Fraser fir、balsam fir以及balsam、intermediate fir的一些品种，往往处于隔离状态(Hawley and DeHayes, 1985)同时认为其关系较近(Flora of North America Editorial Committee,1993)。

药用植物学练习题库含答案一、单选题（共80题，每题1分，共80分）1、天南星和半夏的入药部位是（）A、根茎B、块茎C、球茎D、小块茎E、鳞茎正确答案：B2、根的初生木质部分化成熟的顺序是（）A、内始式B、外始式C、裂生式D、外起源E、内起源正确答案：B3、洋葱的地下部分为（）A、无被鳞茎B、球茎C、有被鳞茎D、根茎E、块茎正确答案：C4、银杏的茎（）A、节细缩B、节膨大C、具长短枝D、节间极短E、节间中空正确答案：C5、双子叶植物叶的脉序通常为（）A、直出平行脉B、射出平行脉C、弧形脉序D、网状脉序E、分叉脉序正确答案：D6、茎细长平卧于地面，节上生有不定根，如连钱草。

应为()A、缠绕茎B、根状茎C、平卧茎D、匍匐茎E、直立茎正确答案：D7、药材莲须是植物的（）A、雄蕊B、花蕾C、花序D、花托E、开放的花正确答案：A8、居间分生组织的活动结果是（）A、产生异常构造B、植物体短期迅速伸长C、植物体持续伸长D、产生周皮E、产生次生维管组织正确答案：B9、果皮坚硬，内含一粒种子，成熟时果皮与种皮分离，如板栗、榛子等为（）A、坚果B、角果C、蒴果D、核果E、荚果正确答案：A10、茅苍术根茎的（）A、皮层内侧有时有厚壁组织B、表皮下方有厚壁组织C、维管束外方有厚壁组织D、次生木质部中无厚壁组织E、木栓层中有厚壁组织正确答案：E11、顶端分生组织的活动结果是（）A、产生次生维管组织B、产生周皮C、植物体短期迅速伸长D、产生异常构造E、植物体持续伸长正确答案：E12、栝楼、丝瓜、南瓜等葫芦科植物的果实一般为（）A、梨果B、瓠果C、浆果D、核果E、柑果正确答案：B13、常含叶绿体的是（）A、厚角细胞B、导管C、管胞D、纤维E、石细胞正确答案：A14、太子参茎下部的花为（）A、闭锁花B、普通花C、雌花D、单性花E、雄花正确答案：A15、半夏的地下部分为（）A、有被鳞茎B、根茎C、球茎D、无被鳞茎E、块茎正确答案：E16、真菌的细胞通常缺少（）A、细胞壁B、液泡C、质体D、原生质E、细胞核正确答案：C17、槟榔种子的种皮内层和外胚乳常插入内胚乳中形成（）A、吸收组织B、皮下组织C、错入组织D、营养组织E、内生组织正确答案：C18、叶片或托叶变态成刺状，称为（）A、叶卷须B、鳞叶C、叶状柄D、苞片E、叶刺正确答案：E19、主脉常在叶的背面隆起是因为叶的背面（）A、下表皮增厚B、维管组织发达C、机械组织发达D、分泌组织发达E、薄壁组织发达正确答案：C20、益母草、黄芩、薄荷等植物的花冠为（）A、唇形花冠B、蝶形花冠C、漏斗形花冠D、钟状花冠E、十字花冠正确答案：A21、 1心皮的单室子房，胚珠沿腹缝线的边缘着生，如甘草、黄芪等称为（）A、侧膜胎座B、基生胎座C、边缘胎座D、特立中央胎座E、中轴胎座正确答案：C22、子囊菌亚门（）A、缺有性阶段B、有性孢子为子囊孢子C、有能动孢子D、有性孢子为接合孢子E、有性孢子为担孢子正确答案：B23、沉香、降香等的入药部位是茎的（）A、边材B、早材C、春材D、心材E、秋材正确答案：D24、草麻黄和牡丹为（）A、乔木B、草质藤本C、草本D、灌木E、亚灌木正确答案：E25、茎的次生木质部中最普遍的导管是（）A、环纹导管B、孔纹导管C、网纹导管D、梯纹导管E、螺纹导管正确答案：B26、药材红花是植物的（）A、花托B、花蕾C、开放的花D、花序E、雄蕊正确答案：C27、由2心皮合生复雌蕊发育而成，果实成熟时分离成两个分果瓣，悬于中央果柄的上端，如小茴香、当归为（）A、颖果B、翅果C、双悬果D、坚果E、角果正确答案：C28、核果的食用部分是（）A、花筒与外、中果皮一起发育而来B、胎座与中、内果皮发育而来C、中果皮和内果皮D、内果皮内壁上的囊状毛E、中果皮正确答案：E29、甘蔗茎、葡萄果实表面的白粉状物是（）A、晶体B、淀粉C、毛茸D、角质E、蜡被正确答案：E30、茎枝上的每一节上只生一片复叶，该叶序为（）A、互生叶序B、对生叶序C、轮生叶序D、簇生叶序E、其他正确答案：A31、人参、黄连属于（）A、多年生草本B、草质藤本C、一年生草本D、二年生草本E、茎卷须正确答案：A32、党参、丝瓜属于（）A、茎卷须B、草质藤本C、一年生草本D、多年生草本E、二年生草本正确答案：B33、被称为细胞的“动力工厂”的是（）A、质膜B、线粒体C、细胞核D、叶绿体E、有色体正确答案：B34、伞形科中具有单叶的植物是（）A、川芎B、狭叶柴胡C、防风D、紫花前胡E、当归正确答案：B35、萼筒或花瓣基部延长成管状或囊状称（）A、距B、花盘C、合蕊柱D、雌雄蕊柄E、雌蕊柄正确答案：A36、双子叶植物茎的初生构造中维管束为（）A、周木型B、辐射型C、周韧型D、无限外韧型E、有限外韧型正确答案：D37、似总状花序，花序轴细长，但小花无柄，螺旋状排列于花轴的周围，如车前、牛膝等称为（）A、穗状花序B、葇荑花序C、总状花序D、轮伞花序E、头状花序正确答案：A38、单室子房内，胚珠着生在顶部，如桑、杜仲等称为（）A、边缘胎座B、顶生胎座C、侧膜胎座D、特立中央胎座E、基生胎座正确答案：B39、雄蕊下部细长的柄状部分，其上部生花药是（）A、花柱B、花丝C、花药D、子房E、柱头正确答案：B40、茄科植物的果实（）A、具有宿存的花柱B、埋藏于膨大的花托内C、具有宿存的花萼D、顶部常具有冠毛E、基部有宿存花被形成的果托正确答案：C41、叶柄特化成叶片状，称为（）A、叶状柄B、苞片C、叶卷须D、鳞叶E、叶刺正确答案：A42、有胚乳的种子，其营养物质主要贮藏在()A、胚根B、胚茎C、子叶D、胚芽E、胚乳正确答案：E43、豆科植物的果实为（）A、角果B、核果C、蓇葖果D、荚果E、浆果正确答案：D44、花瓣4枚，分离，上部外展呈十字形，如菘蓝称为（）A、唇形花冠B、蝶形花冠C、钟状花冠D、漏斗形花冠E、十字花冠正确答案：E45、樟科植物的果实（）A、基部有宿存花被形成的果托B、具有宿存的花萼C、顶部常具有冠毛D、具有宿存的花柱E、埋藏于膨大的花托内正确答案：A46、瞢荚果成熟时（）A、沿背缝线开裂B、沿一侧腹缝线开裂C、沿两侧腹缝线开裂D、沿腹缝线或背缝线开裂E、沿腹缝线和背缝线开裂正确答案：D47、果实的外果皮薄，中果皮肉质肥厚，内果皮木质化而坚硬，内含1粒种子，该果实为（）A、匏果B、牵牛子C、梨果D、核果E、坚果正确答案：D48、裙带菜的植物体为（）A、单细胞B、群体C、丝状体D、叶状体E、树枝状体正确答案：D49、百部、何首乌的药用部分为()A、球茎B、块根C、块茎D、根茎E、鳞茎正确答案：B50、大戟、南瓜的雌蕊为（）A、离生心皮雌蕊B、5心皮复雌蕊C、3心皮复雌蕊D、单雌蕊E、2心皮复雌蕊正确答案：C51、铁线莲属植物的果实（）A、顶部常具有冠毛B、具有宿存的花柱C、基部有宿存花被形成的果托D、具有宿存的花萼E、埋藏于膨大的花托内正确答案：B52、下列那种是有限花序（）A、轮伞花序B、穗状花序C、总状花序D、头状花序E、葇荑花序正确答案：A53、麦冬、莎草的根系属于（）A、侧根B、直根系C、定根D、不定根E、须根系正确答案：E54、束中形成层是由（）保留下来的A、异常形成层B、基本分生组织C、木栓形成层D、原形成层E、原表皮层正确答案：D55、水绵所含色素中（）A、花青素占优势B、藻蓝素占优势C、藻红素占优势D、叶绿素占优势E、墨角藻黄素占优势正确答案：D56、大戟科的主要有毒成分是（）A、黄酮类B、挥发油C、强心苷D、生物碱E、脂肪油和蛋白质正确答案：D57、何首乌的托叶（）A、变为卷须B、呈翅状C、形成托叶鞘D、呈叶片状E、呈刺状正确答案：C58、荚果成熟时（）A、沿两侧腹缝线开裂B、沿一侧腹缝线开裂C、沿腹缝线或背缝线开裂D、沿背缝线开裂E、沿腹缝线和背缝线开裂正确答案：E59、地钱植物体为（）A、雌雄异株B、雌雄同株C、雌雄同序D、茎叶体E、无性植物正确答案：A60、一般所述的花是指（）的花A、裸子植物B、孢子植物C、被子植物D、蕨类植物E、隐花植物正确答案：C61、由两个心皮连合构成子房一室，胚珠着生在子房内的腹缝线上，此胎座为（）A、基生胎座B、侧膜胎座C、边缘胎座D、中轴胎座E、特立中央胎座正确答案：B62、桔梗、党参等的花为（）A、子房下位周位花B、子房上位下位花C、子房下位上位花D、子房上位周位花E、子房半下位周位花正确答案：E63、 Salvia miltiorrhiza Bunge的雄蕊为（）A、能育雄蕊4个B、能育雄蕊2个C、二强雄蕊，D、四强雄蕊E、聚药雄蕊正确答案：B64、入药部分为根状茎的植物是()A、甘草B、人参C、菘蓝D、黄芪E、黄精正确答案：E65、苹果、梨、山楂、枇杷等属于（）A、浆果B、蓇葖果C、核果D、梨果E、角果正确答案：D66、在被子植物分类和鉴定上最主要的依据是()A、根B、茎C、叶D、花E、种子正确答案：D67、一些十字花科植物根的初生木质部为（）A、三原型B、五原型C、多原型D、四原型E、二原型正确答案：E68、根的后生木质部从性质上看属于（）A、原生木质部B、外生木质部C、异常木质部D、次生木质部E、初生木质部正确答案：E69、蒴果沿腹缝线开裂的方式称（）A、齿裂B、室背开裂C、盖裂D、室轴开裂E、室间开裂正确答案：E70、贯众的囊群盖为（）A、多边形B、圆盾形C、多角形D、菱形E、方形正确答案：B71、唇形科植物的茎（）A、呈方形B、具环状托叶痕C、中空D、具明显的皮孔E、呈三角形正确答案：A72、攀援植物在茎上产生的不定根属于（）A、攀援根B、支持根C、贮藏根D、气生根E、寄生根正确答案：A73、木贼茎表皮具有（）A、矿质化细胞B、复表皮C、间隙腺毛D、蜜腺E、腺鳞正确答案：A74、石松的孢子囊为（）A、圆形B、卵圆形C、椭圆形D、肾形E、多边形正确答案：D75、木纤维仅存在于（）体内的木质部中A、裸子植物B、蕨类植物C、苔藓植物D、隐花植物E、被子植物正确答案：E76、下列哪种属于聚花果（）A、莲B、五味子C、桑葚D、八角茴香E、草莓正确答案：C77、被子植物导管壁上的纹孔为（）A、正面观呈现3个同心圆的具缘纹孔B、单纹孔C、半缘纹孔D、正面观呈现2个同心圆的具缘纹孔E、纹孔沟正确答案：D78、接骨木等木本茎的表面（）A、呈三角形B、具明显的皮孔C、具环状托叶痕D、中空E、呈方形正确答案：B79、在木质茎的横切面上可见射线的（）A、高度B、长度C、高度和宽度D、长度和高度E、长度和宽度正确答案：E80、由单雌蕊或复雌蕊的上位或下位子房发育而成，外果皮薄，中果皮和内果皮不易区分，肥厚肉质，含丰富的浆汁，内含一至多粒种子。

铁线莲‘Multi-Blue’体细胞胚诱导和植株再生第34卷第6期2010年11月南京林业大学(自然科学版)JournalofNanjingForestryUniversity(NaturalScienceEdition)V o1.34.No.6Nov.,2010铁线莲'Multi-Blue'体细胞胚诱导和植株再生张启香,胡恒康.,方炎明(1.南京林业大学森林资源与环境学院,江苏南京210037;2浙江农林大学林业与生物技术学院,浙江临安311300;3.江西农业大学园林与艺术学院,江西南昌330045)摘要:以铁线莲品种'Multi.Blue'的茎尖为外植体,1/2MS为基本培养基,进行胚性愈伤组织和体细胞胚的诱导及植株再生条件的选择.结果表明:茎尖外植体在1/2MS+TDZ(1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L)+2%蔗糖+0.7%琼脂的固体培养基中培养时可形成淡黄色块状至颗粒状愈伤组织,经继代培养后可逐渐形成胚性愈伤组织;体细胞胚诱导以1/2MS+TDZ(0.2mgZL)+IBA(0.1mg/L)+ABA(0.3mg/L)+CH(0.5g/L)为佳,诱导率可达96%;而适宜的体细胞胚萌发培养基为1/2MS+6一BA(0.2mg/L)+IBA(0.05mg/L).体胚再生植株经驯化后,移栽成活率可达80%以上.关键词:铁线莲'Multi—Blue';体细胞胚;植株再生中图分类号:$718文献标志码:A文章编号:1000—2006(2010)06—0018—05 EmbryogenesisandplantregenerationofClematis'Multi-Blue' ZHANGQi—xiang,HUHeng—kang,FANGY an.ming(1.CollegeofForestResourcesandEnvironment,NanjingForestryUniversity,Nanjing210 037,China;2.SchoolofForestryandBioteehnology,ZhejiangA&FUniversity,Lin'an311300,China;3Colleg eofLandscapeArchitectureandArt,JiangxiAgficultureUniversity,Nanchang330045,China) Abstract:UsingstemtipofClematis'Multi—Blue'asexplantsand1/2MSasculturemedia,thesuitableconditionsfor inductionofembryogeniecallusandsomaticembryos,aswellasplantregeneration,weredet ermined.Theresultsindi—catedthattheoptimalconditionsforinductionofembryogeniccalluswere1/2MSsupplemen tedwith1.0mg/LTDZ,0.5m#LNAAand2%scourseplus0.7%agar.Explantsculturedinthissolidmediumcouldfor myellowmassiveor granularcallusandproducedembryogeniecallusaftersubculture.Suitablemediaforsomati cembryoinductionwere1/2MSaddedwith0.2mg/LTDZand0.1mg/LIBAplus0.5g/LCH,withaninductionrateof96%. Thegermination rateofsomaticembryoswasthehighestwhentheplantgrowthregulatorswere0.2mg/L6-BA and0.05mg/LIBA.The planfletswithrootweresuccessfullytransplantedtothemediumwithvermiculite.Thesurviv alrateofregenerationplantcouldbeuptoatleast80%.Keywords:Clematis'Multi—Blue';embryogenesis;plantregeneration铁线莲属(ClematisL.)大多为常绿或落叶的多年生木质藤本植物,花大色艳,花型多变,花期长,园艺用途广泛,观赏价值高,是非常优良的垂直绿化材料,在国外的垂直绿化中具有重要地位.该属植物也具有较高的药用价值…,是我国许多中医临床和民问常用的利尿通淋或祛风止痛类药物.由于铁线莲属植物多数存在结实少或萌发时间长,发芽率低等问题,不宜采用有性繁殖,园林栽培应用受到限制.为了扩大铁线莲属植物优良栽培品种的繁殖以及育种平台的建立,国内外学者陆续开展了相关研究:Leifert等使用1/2MS培养基对C.montana'Rubens'进行培养获得丛生芽.Mitrofanova等对体细胞胚胎发生和器官发生途径所获得铁线莲属植物的亲缘关系进行了较详细的研究.倪新等报道了红花铁线莲茎,叶及花梗等外植体的愈伤组织和收稿日期:2009—12—07修回日期:2010-09—13基金项目:浙江省自然科学基金项目(Y3090091);浙江林学院博士启./~(2008FR021);南京林业大学"十一五"人才工程项目作者简介:张启香(1975～),副教授,博士.方炎明(通信作者),教授.E-mail:*********************.vii.引文格式:张启香,胡恒康,方炎明.铁线莲'Multi—Blue'体细胞胚诱导和植株再生[J].南京林业大学:自然科学版,2010,第6期张启香,等:铁线莲'Multi—Blue'体细胞胚诱导和植株再生l9植株再生并获得了大量的分化苗.泽仁旺姆等对甘青铁线莲(tangutica)进行了组织培养研究,解决了该植物种子萌发时间长,发芽率低等问题,大大提高了繁殖率.张启香等对铁线莲'Multi.Blue'组织培养后发现,1/2MS为茎尖培养的最佳培养基.铁线莲'Multi—Blue'是由荷兰引进的一个优良的铁线莲属植物的杂交栽培品种,为铁线莲'ThePresident'的变种,1983年注册于荷兰,其萼片,雄蕊均花瓣状,具有较高的观赏价值,有性繁殖很难产生可育的种子,且种子难以保持该品种母本的优良性状,生产中通常对其进行扦插繁殖,但繁殖系数较低.笔者以铁线莲'Multi—Blue'的茎尖为外植体进行组织培养,获得体细胞胚培养体系,以期为铁线莲属植物新品种培育及转基因工作的开展提供参考. 1材料与方法1.1材料供试材料为南京林业大学树木园内种植的铁线莲'Multi—Blue',该品种2004年5月从荷兰引进,取当年萌发新枝的茎尖作为试验外植体.1.2处理及诱导方法剪取铁线莲'Multi—Blue'当年萌发新枝的茎尖,依次进行自来水冲洗2h,70%乙醇灭菌30S, 无菌水冲洗3～4次,稀释l0倍的NaCIO灭菌20min并抽真空,无菌水冲洗5次后,用灭菌滤纸吸干表面水分,接入配制好的培养基中』.基本培养条件:1/2MS为基本培养基,蔗糖质量浓度20L,琼脂质量分数0.7%,pH=5.7,温度(25±1)℃,光照/黑暗(光照16h/d,光照度为2400Ix)条件下培养.(1)胚性愈伤组织诱导.采用TDZ和NAA进行正交试验,共设置16个处理,每因素设4个水平,每个处理10瓶,每瓶接种2个茎尖,重复3次. 诱导率=(诱导出胚性愈伤组织外植体的数量/接种外植体的数量)×100%,6周后统计诱导率. (2)体细胞胚诱导.对生长调节物质和复合添加物的种类及水平进行优化筛选,采用TDZ,IBA,ABA和CH(水解酪蛋白)进行正交试验,每因素设4个水平,共设置16个处理,每处理10瓶,每瓶接种2～4块胚性愈伤组织,重复3次,进行铁线莲'Multi—Blue'体细胞胚的诱导,6周后统计诱导率.(3)体胚发育与植株再生.以1/2MS为基本培养基,生长调节物质选用6一BA(0,0.2,0.4和0.6mg/L)和IBA(0,0.01和0.05mg/L)进行完全组合.每个处理10瓶,每瓶接种4个体胚,重复3 次.光照条件下培养(光照16h/d,光照度为1500lx),30d后转移至新鲜培养基中,6周后统计出苗率.1.3数据处理采用EXCEL和SigmaPlot8.0系统软件对实验数据进行统计分析,实验数据均为3次重复的平均值.2结果与分析2.1植物生长调节物质对铁线莲'Multi-Blue'胚性愈伤组织诱导的影响实验发现,茎尖接人诱导培养基后约15d开始启动(图1—1),长出的愈伤组织淡黄色,晶莹,透明(图1—2).25d左右出现少许褐变,经继代培养后,褐变停止,并开始长出黄绿色,快速增殖的胚性愈伤组织(图1—3).显微镜下观察发现:非胚性愈伤组织结构松散,细胞较大,胞间隙明显;而胚性愈伤组织细胞多为圆球状,细胞质浓,细胞核较大,胞间隙小,结构紧凑.生长调节物质的种类及配比对胚性愈伤组织的诱导及生长有较显着的影响(表1),尤其是TDZ对胚性愈伤组织的诱导起着至关重要的作用.当TDZ浓度为0时,4个处理(A,A:,,A)下胚性愈伤组织的诱导率均低于20%,随着TDZ浓度的提高诱导率明显升高,当TDZ的质量浓度为1.0mg/L时达到最高(图2),然后随着浓度提高诱导率下降,说明过高浓度的TDZ对铁线莲的胚性愈伤组织诱导产生了一定的抑制作用.当TDZ为1.0mg/L时,4个处理(AAlo,A.,,A.:)的诱导率较高,其中A.处理诱导率最高,达90.0%,而且胚性愈伤组织形成速度较快,生长良好.当TDZ质量浓度为0.5mg/L时,胚性愈伤组织形成速度较慢,诱导率低,其中A处理有褐化现象.而当TDZ质量浓度增加至1.5mg/L时,愈伤组织产生速度较快,但胚性愈伤组织诱导率较低,褐化现象较严重,愈伤组织结构疏松.方差分析表明,诱导率以TDZ的作用最为明显,且TDZ各水平之间存在极显着差异,诱导率随着浓度的升高而呈先升高后降低的变化趋势.而NAA各水平之间存在显着性差异(图2).由进一步多重比较结果可以看出,Am与其他处理均存在极显着差异,而且愈伤组织形成快,诱导率高,愈伤组织呈透明状.根据统计结果按诱导率均值进行优选,以A..处理,即1.0,~g/LTDZ和0.5mg/LNAA组合处理最优.20南京林业大学(自然科学版)第34卷图1铁线莲'Multi-Blue'体细胞胚诱导和植株再生Fig.1EmbryogenesisandplantregenerationofClematis'Multi-Blue'注:1.茎尖接种后2周;2.从茎尖诱导的愈伤组织;3.胚性愈伤组织;4.体胚从愈伤组织中发生;5.鱼雷胚;6.子叶胚;7.体胚萌发;8.幼苗;9再生植株移栽.表1不同生长调节物质对铁线莲'Multi-Blue'胚性愈伤组织诱导的影响Table1EffectsofdifferentplantgrowthregulatorsonembryogenesiscaHusofC.'Multi-Blue'.竺.山品:要+.山m…g.L-1):要……"…TDZNAA…'………''…,''TDZNAA…'',……A.0.00.00OO±0MlAo1.0O.O73.47±0.47CcA,0.00.516.67±1.65JiAl0100.590.00±1.0AaAO.OI.0l4.OO±O.I4KiA,,1,01.078.00±0.6BbA0.02.010.87±0.13LkA,1.02.066.00±1.5DdA0.5O.057.14±0.86FeA131.50.045.83±0.8HgA0.5O.565.96±0.04DdA141.50.565.22±0.22DdA0.51.064.0H0±1.ODEdA1.51.058.oo±1.0FeAO.52.O5O.0o±1.5GfAl61.52.041.30±0.3Ih注:同一列中小写字母不同者示差异显着(.D<0.05);大写字母不同者示差异极显着(p<0.O1).2.2植物生长调节物质及复合添加物对铁线莲'Multi-Blue'体细胞胚诱导的影响当TDZ浓度较低时,体细胞胚诱导率随其浓度升高而增加,当质量浓度为0.2mg/L时诱导率达到最高,为36.25%,然后随着TDZ浓度升高,诱导率逐渐降低且材料易玻璃化,0.2mg/L与其余处理间存在极显着差异(图3).当IBA为0.1mg/L时,诱导率为39.33%,且与其他处理间存在极显着差异.添加低浓度的ABA有利于铁线莲'Multi-Blue'体细胞胚的增殖,当质量浓度为0.3ms/L时,增殖系数最高.水解酪蛋白(CH)对铁线莲'Multi—Blue'体细胞胚的增殖具有明显影响,质量浓度为0.5L时效果最好,与其余处理存在极显着性差异(图3).对各处理进行方差分析及多重比较结果显示,TDZ(0.2mg/L)+IBA(O.1mg/L)+ABA(O.3mg/L)+CH(0.5g/L)处理与其余处理之间存在极显着差22南京林业大学(自然科学版)第34卷胞胚增殖,但不同质量浓度的ABA处理效果差异显着,以0.3mg/L效果最佳,说明体细胞胚增殖与ABA浓度间存在剂量效应,这与王清连等H在棉花中的研究结果一致.以铁线莲'Multi—Blue'的侧芽茎尖为外植体进行胚性愈伤组织及体细胞胚的诱导,在适合的条件下体细胞胚能正常发育及成熟,成功获得了由体细胞胚萌发的再生植株且移栽成活,为铁线莲属植物进行分子育种提供了良好的理论基础.但体细胞胚形成的数量较少,体细胞胚的发生及其同步化调控技术的机理仍需进一步研究.参考文献:[1]RajaNaikaH,KrishnaV.Antimicrobialactivityofextractsfrom theleavesofClematisgourianaRoxb『J].1ntJBiomedicalPhar- nlaSciences,2007(1):69—72.f2]LeifertC,CamottaH,WaitesWM.Effectofcombinationsofan. tibioticsonmicropropatatedClematis,Dephinium,Hosta,Irisand Photenia[J].PlantCellTissOrgCult,1992,29:153—160.[3]MitmfanovaIV,GalaevAV,SivolapIuM.Investigationofmolec—ular—geneticheterogeneityofclematisplants(ClematisL.)ob—tainedbyorganogenesisandsomaticembryogenesisinvitro[J]. TsitolGenet,2003,37(6):6—12.[4]倪新,马毓.红花铁线莲(Clematiscoccinea)的组织培养[J]. 植物学通报,1984,2(2/3):71—73.[5]泽仁旺姆,尼珍,潘多.西藏甘青铁线莲的再生植株[J].西藏科技,2002(9):61.[6J张启香,方炎明,吕梅,等.铁线莲C.'Multi—Blue'不定芽及体细胞胚发生的初步研究[J].园艺,2007,34(2):465—468.[7]EssigFB.SeedlingmorphologyinC/emat/s(Ranunculaeeae) anditstaxonomicimplications[J].Sida,1991,14:377—390.[8]陈懿涵,桂仁意,林新春,等.花秆绿竹试管快速繁殖[J].浙江林学院,2008,25(3):397—400.[9J管开云,李志坚,李景秀.铁线莲属植物的引种栽培研究初报[J].云南植物研究,2002,24(3):392—396.[10]张金政,孙国峰,龙雅宜.四个铁线莲新品种的选育[J].中国园林,2001,17(5):64—66.[1】】MandegaranSieber.SomaticembryogenesisinClematisintegrifo—lia×C.viticella[J].PlantCell,TussueandOrganCulture,2000,62:163—165.[12]HanumanaikaRajaNaika,V enkatarangaiahKrishna.Plantregen—erationfromcalluscultureofClematisgourianaRdxb.--aral'eme- dicinalplant[J].TurkJournalBiology,2008,32:99—103.[13]吴耀荣,谢旗.ABA与植物胁迫抗性[J].植物学通报,2006,23(5):511—518.[14]KikuchiA,SanukiN,HigashiK,eta1.,Abscisicacidand stresstreatulenta1)eessentialfortheacquisitionofembryogenie competencebycarrotsomaticcells[J].Planta,2006,223:637—645.[15]王清连,王敏,师海荣.植物激素对棉花体细胞胚胎发生的诱导及调节作用[J].生物技术通讯,2004,15(6):577—579.(责任编辑郑琰妓)。

第32卷 第1期V o l .32 No .1草 地 学 报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2024年 1月J a n . 2024d o i :10.11733/j.i s s n .1007-0435.2024.01.008引用格式:贾艳艳,邱玉鹏,周欣莹,等.基于形态标记和I S S R 分子标记的长瓣铁线莲遗传多样性分析[J ].草地学报,2024,32(1):75-86J I A Y a n y a n ,Q I U Y u p e n g ,Z H O UX i n y i n g ,e t a l .G e n e t i cD i v e r s i t y A n a l y s i s o f C l e m a t i s m a c r o p e t a l a B a s e d o n I S S R a n d M o r p h o l o g i c a lM a r k e r s [J ].A c t aA g r e s t i aS i n i c a ,2024,32(1):75-86基于形态标记和I S S R 分子标记的长瓣铁线莲遗传多样性分析贾艳艳,邱玉鹏,周欣莹,耿宇航,孙浩男,刘冬云*(河北农业大学,河北保定071000)收稿日期:2023-06-01;返修日期:2023-11-18基金项目:河北省铁线莲属植物种质资源收集与新种质创制(20326339D )资助作者简介:贾艳艳(1996-),女,汉族,河北承德人,硕士研究生,主要从事园林花卉育种栽培方向研究,E -m i a l :331291361@q q.c o m ;*通信作者A u t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e ,E -m i a l :510297525@q q.c o m 摘要:为快速区分鉴定市场上繁多的长瓣铁线莲(C l e m a t i sm a c r o p e t a l a )品种,了解长瓣铁线莲间的遗传多样性水平及亲缘关系,本试验利用形态标记结合I S S R 分子标记对25个长瓣铁线莲品种和1个野生种进行遗传多样性研究㊂结果表明:14个数量形状的变异系数在0.24%~2.32%之间;15个假质量性状的信息多样性指数H 在0~2.29%之间,遗传多样性指数D 在0~0.94%之间;在欧式距离为15时,可将29个表型性状划分为七类,在欧式距离为15时,可将26个长瓣铁线莲划分为五类㊂12条引物共扩增出144个条带,多态性条带占比为100%㊂利用引物U B C 815㊁U B C 824和U B C 836构建26个长瓣铁线莲的指纹图谱,可快速区分鉴定26个长瓣铁线莲㊂U P GMA 聚类结果显示,在遗传相似系数为0.68时,可将26个长瓣铁线莲划分为八大类㊂形态标记结合I S S R 分子标记可有效鉴别长瓣铁线莲种质资源,以期为长瓣铁线莲种质资源收集保存㊁创制新品种等提供理论基础㊂关键词:长瓣铁线莲;形态标记;I S S R 分子标记;遗传多样性;中图分类号:S 682.1+9 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2024)01-0075-12G e n e t i cD i v e r s i t y A n a l ys i s o f C l e m a t i sm a c r o p e t a l a B a s e do n M o r p h o l o gi c a lM a r k e r s a n d I S S R M o l e c u l a rM a k e r s J I A Y a n -y a n ,Q I U Y u -p e n g ,Z H O U X i n -y i n g ,G E N G Y u -h a n g ,S U N H a o -n a n ,L I U D o n g -yu n *(H e b e iA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y B a o d i n g ,B a o d i n g,H e b e i P r o v i n c e 071000,C h i n a )A b s t r a c t :T h i s e x p e r i m e n t a i m e dt o q u i c k l y d i s t i n g u i s ha n d i d e n t i f y t h ev a r i e t i e so f C l e m a t i sm a c r o p e t a l a o n t h em a r k e t ,a n d t ou n d e r s t a n dd i v e r s i t y a n d r e l a t i o n s h i p s a m o n g 26C l e m a t i s m a c r o pe t a l a s a m p l e s .T h e e x p e r i m e n t u s e dm o r p h o l o g i c a lm a r k e r s c o m b i n e dw i t h I S S R m o l e c u l a rm a r k e r s t os t u d yg e n e t i cd i v e r s i t y a n d p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s a m o n g 26C l e m a t i s m a c r o p e t a l a .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e v a r i a t i o n c o ef -f i c i e n t o f 14q u a n t i t a t i v e s h a p e s r a ng e d f r o m0.24%t o2.32%,w i t ha na v e r a g e c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o no f 0.29%f o r l e a f i n d i c a t o r s a n d 0.64%f o r f l o w e r i n d i c a t o r s .Th ei n f o r m a t i o nd i v e r s i t y i n d e xHo f 15q u a l i t y t r a i t s r a n g e d f r o m0t o 2.29%,a n d t h e g e n e t i c d i v e r s i t y i n d e xDr a n g e d f r o m0t o 0.94%.A t aE u r o pe a n d i s t a n c e of 15,29p h e n o t y p i c t r a i t sw e r e d i v i d e d i n t o 7c a t eg o r i e s ,a n d a t aE u r o pe a n d i s t a n c e of 15,26s a m -p l e s o f C l e m a t i sm a c r o pe t a l a w e r e d i v i d e d i n t o5c a t e g o r i e s .T h e t o t a l of 144b a n d sw e r e a m p l i f i e du s i ng 12p r i m e r s ,w i th a p o l y m o r p hi s mr a t e o f 100%.U s i n g pr i m e r sU B C 815,U B C 824,a n dU B C 836t o c o n s t r u c t f i n g e r p r i n tm a p s o f 26C l e m a t i sm a c r o p e t a l a ,26C l e m a t i sm a c r o p e t a l a w e r e q u i c k l y d i s t i n g u i s h e da n d i -d e n t i f i e d .T h eU P GMAc l u s t e r i n g a n a l y s i s r e s u l t s s h o w e d t h a tw h e n t h e g e n e t i c s i m i l a r i t y c o e f f i c i e n tw a s 0.68,26C l e m a t i sm a c r o p e t a l a c o u l db ed i v i d e d i n t o8c a t e g o r i e s .P h e n o t y p i c t r a i t sc o m b i n e d w i t hI S S R m o l e c u l a rm a r k e r s c o u l d e f f e c t i v e l y i d e n t i f y t h e g e r m p l a s mr e s o u r c e so f C l e m a t i sm a c r o p e t a l a .T h e s e r e -s e a r c hr e s u l t s p r o v i d e dat h e o r e t i c a lb a s i sf o rt h ec o l l e c t i o na n d p r e s e r v a t i o no f C l e m a t i sm a c r o pe t a l a草地学报第32卷g e r m p l a s mr e s o u r c e s,a sw e l l a s t h e c r e a t i o no f n e wv a r i e t i e s.K e y w o r d s:C l e m a t i sm a c r o p e t a l a;M o r p h o l o g i c a lm a r k e r s;I S S R m o l e c u l a rm a r k e r s;G e n e t i c d i v e r s i t y铁线莲属(C l e m a t i s)植物具有较高的观赏价值和应用价值,常被用于植物园㊁公园和家庭花园等地的装饰绿化[1-3]㊂长瓣铁线莲为攀援藤本花卉,花形奇特,呈钟状到碗状,蓝紫色花色在自然界中较为少见,外轮雄蕊不育,多瓣化,花瓣状退化雄蕊数量众多㊂长瓣铁线莲是很好的花卉装饰材料,在国外被广泛应用于园林的垂直绿化,可配植于假山或岩石园中,亦可做切花㊁瓶插㊁盆景等应用,但在国内鲜有应用[4-5]㊂遗传标记主要有4种,即形态标记(M o r p h o-l o g i c a lm a r k e r)㊁细胞标记(C y t o l o g i c a lm a r k e r)㊁生化标记(B i o c h e m i c a lm a r k e r)和分子标记(M o l e c u-l a rm a r k e r)[6]㊂4种标记方法各有利弊,结合2种或2种以上标记方法可提高结果可靠性㊂董媛等[7]利用形态标记对河南洛阳9种常见栽培芍药(P a e-o n i a l a c t i f l o r a P a l l.)品种进行了分类;李晓慧等[8]对17份叶菜用甘薯(D i o s c o r e a e s c u l e n t a)进行形态标记研究时表明,由于环境因素影响,形态标记在多数植物中多态性较差,存在表现型不同而遗传物质相同,或表现型相同而遗传物质不同等情况,需结合分子标记进行深入研究㊂王楠等[9]以铁线莲园艺品种 G r a v e t y eB e a u-t y 为研究对象,应用I S S R分子标记技术建立了最优I S S R-P C R反应体系㊂和文志等[10]以16个铁线莲品种为试验材料,采用I S S R分子标记技术研究了16个品种的遗传多样性㊂王鑫等[11]以河北省17个野生铁线莲为试验材料,采用I S S R和r D N A-I T S 标记方法鉴定了17个野生种间的亲缘关系㊂余伟军等[12]以32个铁线莲属植物为试验材料,采用I S-S R分子标记技术研究了32个试验材料间的遗传多样性㊂铁线莲属植物约有300种之多,经过育种专家长期的繁殖培育,很多早已无法追溯遗传背景㊂为解决铁线莲属植物遗传背景模糊复杂的问题,前人多从形态学和细胞学上对铁线莲属植物进行了遗传多样性及亲缘关系研究[13-17],但对于分子生物学的相关研究报道较少㊂常用的分子标记方法有R A P D(随机扩增多态性D N A)㊁S R A P(相关序列扩增多态性)㊁S S R(简单重复序列)㊁I S S R(简单序列重复区间)㊁及I T S序列等,与其他分子标记技术相比,I S S R分子标记技术具有多态性丰富,易操作,稳定性高的优点,被广泛应用于植物品种鉴定㊁遗传多样性和系统发育等研究中[18-20]㊂本试验对26个长瓣铁线莲进行形态及I S S R 分子标记遗传多样性研究,探究长瓣铁线种质资源的遗传多样性水平及亲缘关系,以快速区分鉴定市场上繁多的长瓣铁线莲品种,为I S S R分子标记技术在长瓣铁线莲品种分类测评鉴定㊁遗传多样性评价㊁亲缘关系分析等方面研究提供理论依据㊂形态标记结合I S S R分子标记可有效鉴别长瓣铁线莲种质资源,研究结果可为长瓣铁线莲种质资源收集保存㊁创制新品种等提供理论基础㊂1材料与方法1.1材料26份供试材料由课题组于2019 2021年收集自国内外,每个品种(野生种)引种10株,种植于河北农业大学试验基地,种植基质为进口草炭ʒ珍珠岩ʒ10~15m m树皮=3ʒ1ʒ1㊂供试材料相关信息详见表1㊂1.2方法1.2.1形态数据测量参考‘植物新品种特异性㊁一致性㊁稳定性测试指南铁线莲“[21]选取29个表型性状,其中数量性状14个(表2),假质量性状15个(表3)㊂表型性状的数据获取于盛花期及叶片成熟期2个阶段进行,每个品种选取10株长势基本一致的植株进行性状调查,盛花期进行花的相关性状测量调查,叶片成熟期进行叶的相关性状测量调查㊂67第1期贾艳艳等:基于形态标记和I S S R分子标记的长瓣铁线莲遗传多样性分析图1 26个供试长瓣铁线莲花朵图片F i g .1 P i c t u r e s o f 26C l e m a t i sm a c r o pe t a l af l o w e r s f o r t e s t i ng 77草 地 学 报第32卷表1 26个长瓣铁线莲相关信息T a b l e 1 R e l e v a n t i n f o r m a t i o no f 26C l e m a t i sm a c r o pe t a l a 序号N u m b e r名称N a m e花期B l o o m i n gpe r i o d /月果期F r u i t i n gpe r i o d /月来源S o u r c e1 梅德威尔 C . M a i d w e l lH a l l 4-56-8优藤园艺2 吉斯卡 C . G i s k a 4-56-8吉祥园艺3 塞西尔 C . C e c i l e 4-56-8吉祥园艺4 芭蕾舞裙 C . B a l l e t s k i r t 4-56-8伟伟园艺5 粉红玛卡 C . M a r k h a m 'sP i n k 4-5无吉祥园艺6 弗朗姬 C . F r a n k i e 4-56-8吉祥园艺7 泄湖 C . X i e h u 5-66-8吉祥园艺8 粉红火烈鸟 C . P i n kF l a m i n g o s 4-66-8黄姐园艺9 乡村玫瑰 C . C o u n t r y R o s e 4-5无优藤园艺10 海洋珍珠 C . O c e a nP e a r l 4-5无优藤园艺11 紫罗兰惊喜 C . V i o l e t S u r p r i s e 4-5无伟伟园艺12 紫色惊喜 C . P u r p l eS u r p r i s e 4-56-8伟伟园艺13 粉色惊喜 C . P i n kS u r p r i s e 4-5无伟伟园艺14 金色惊喜 C . G o l d e nS u r p r i s e 4-56-8伟伟园艺15 蓝色惊喜 C . B l u eS u r p r i s e 4-56-8伟伟园艺16 黄金之梦 C . G o l d e nD r e a m 4-56-8伟伟园艺17 紫色之梦 C . P u r p l eD r e a m 4-56-8伟伟园艺18 粉色之梦 C . P i n kD r e a m 4-56-8伟伟园艺19 柠檬之梦 C . L e m o nD r e a m 4-56-8伟伟园艺20 粉色秋千 C . P i n kS w i n g 4-56-8吉祥园艺21 峭壁 C . C l i f f 4-56-8优藤园艺22 金色斯托尔韦克 C . S t o l w i j kG o l d 46-8伟伟园艺23 琥珀 C . A m b e r 4-56-8优藤园艺24 白色高压 C . W h i t eh i g h p r e s s u r e 4-56-8优藤园艺25 拉古 C . L a g u 4-56-8黄姐园艺26野生长瓣铁线莲C l e m a t i sm a c r o pe t a l a 4-66-9河北省保定市阜平县表2 14个数量性状测定标准T a b l e 2 D e t e r m i n a t i o n c r i t e r i a f o r 14q u a n t i t a t i v e t r a i t s数量性状Q u a n t i t a t i v e t r a i t测定标准D e t e r m i n a t i o n s t a n d a r d 株高P l a n t h e i gh t /m m 植株根颈部到植株顶部之间的距离T h ed i s t a n c eb e t w e e nt h en e c ko f t h e p l a n tr o o t a n d t h e t o p of t h e p l a n t 复叶长C o m p o u n d l e a f l e ng th /m m 复叶叶基到叶尖的距离Di s t a n c e f r o mb a s e t o t i p o f c o m po u n d l e a v e s 复叶宽C o m p o u n d l e a fw i d t h /m m 复叶叶片最宽处的长度T h e l e n g t ho f t h ew i d e s t p a r t o f a c o m p o u n d l e a f 顶端小叶长A p i c a l l o b u l e l e n g t h /m m 顶端叶叶基到叶尖的距离T h e d i s t a n c e f r o mt h e b a s e o f t h e t o p l e a f t o t h e t i p of t h e l e a f顶端小叶宽T o pl e a f l e tw i d t h /m m 顶端叶叶片最宽处的长度T h e l e n g t ha t t h ew i d e s t p o i n t o f t h e t o p l e a f b l a d e 叶柄长度P e t i o l e l e n g t h /m m 叶片基部到茎间的长度T h e l e n g t h f r o mt h eb a s e o f t h e l e a f t o t h e s t e m 花冠直径C o r o l l a d i a m e t e r /m m 花冠最大处的直径T h e d i a m e t e r o f t h e l a r g e s t p a r t o f t h e c o r o l l a 花梗长P e d i c e l l e n g t h /m m 花梗两端之间的长度T h e l e n gt hb e t w e e n t h e t w o e n d s o f t h e p e d i c e l 花量F l o w e r o u t p u t /p c s 开花期内的开花数量T h e n u m b e r o f b l o o m s d u r i n g t h e f l o w e r i n gp e r i o d 萼片长S e p a l l e n gt h /m m 萼片基部与萼片最顶端的垂直距离T h e v e r t i c a l d i s t a n c e b e t w e e n t h e b a s e o f t h es e p a l a n d t h e t o p o f t h e s e p a l 萼片宽S e p a lw i d t h /m m 萼片最宽处的长度T h e l e n g t ho f t h ew i d e s t s e pa l 花瓣状退化雄蕊数量N u mb e r o f p e t a l i z e d s t a m e n s /pc s 花瓣状退化雄蕊的数量N u m b e r o f f u l l ype t a l a t e d s t a m e n s 花瓣状退化雄蕊长P e t a l i n e s t a m e n l e n g t h /m m 花瓣状退化雄蕊基部与花瓣状退化雄蕊最顶端的垂直距离T h ev e r t i c a l d i s t a n c eb e t w e e n t h e b a s e o f p e t a l a t e d s t a m e n s a n d t h e t o p m o s t p a r t o f p e t a l a t e d s t a m e n s 花瓣状退化雄蕊宽P e t a l i n a t e d s t a m e nw i d t h /m m花瓣状退化雄蕊最宽处的长度T h e l e n g t h o f t h ew i d e s t pa r t o f a p e t a l a t e d s t a m e n 1.2.2 D N A 的提取与检测 D N A 的提取采取试剂盒法(C W 0531S ,康为世纪),D N A 纯度采用微量紫外分光光度计进行检测,要求其纯度(O D 260/O D 280)在1.6~2.0之间,剔除不合格的样本重新提取至合格㊂将D N A 母液浓度稀释成40n g㊃μL -1的工作液,1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测[10]㊂1.2.3 I S S R 引物筛选及P C R 扩增 参照王鑫等[11]筛选出的12条引物进行试验㊂12条引物相关信息见表4㊂87第1期贾艳艳等:基于形态标记和I S S R 分子标记的长瓣铁线莲遗传多样性分析表3 15个假质量性状及分级T a b l e 3 15P s e u d o -q u a l i t a t i v e c h a r a c t e r i s t i c a n d g r a d i n g假质量性状P s e u d o -qu a l i t a t i v e c h a r a c t e r i s t i c 性状描述及分级C h a r a c t e r d e s c r i pt i o na n d c l a s s i f i c a t i o n 叶片上部主要颜色T h em a i nc o l o r o f t h e u p pe r p a r t of t h eb l a d e 黄绿色(1)㊁浅绿色(2)㊁中等绿色(3)㊁深绿色(4)叶片下部主要颜色M a i n c o l o r o f t h e l o w e r p a r t o f t h e b l a d e 黄绿色(1)㊁浅绿色(2)㊁中等绿色(3)㊁深绿色(4)叶片形状B l a d e s h a p e 披针形(1)㊁卵圆形(2)㊁椭圆形(3)㊁倒卵圆形(4)㊁菱形(5)㊁心形(6)叶片顶端形状B l a d e t i p s h a pe 卷须状(1)㊁窄渐尖(2)㊁阔渐尖(3)㊁急尖(4)㊁钝圆(5)叶片基部形状B l a d e b a s e s h a p e 楔形(1)㊁钝圆形(2)㊁圆形(3)㊁心形(4)叶片边缘形状B l a d e e d g e s h a p e 全缘(1)㊁波状(2)㊁圆齿状(3)㊁齿状(4)㊁锯齿状(5)萼片形状S e p a l s h a pe 披针形(1)㊁卵圆形(2)㊁椭圆形(3)㊁菱形(4)㊁倒卵圆形(5)㊁匙形(6)萼片基部形状S e p a l b a s e s h a p e 类型1(1)㊁类型2(2)㊁类型3(3)萼片先端形状S e p a l a p e x s h a p e 阔渐尖(1)㊁窄渐尖(2)㊁急尖(3)㊁钝圆(4)㊁微凹(5)萼片上表面主要颜色M a i n c o l o r s o n t h e s u r f a c e o f s e pa l s 白色(1)㊁金黄色(2)㊁黄绿色(3)㊁浅粉色(4)㊁深粉色(5)㊁紫红色(6)㊁紫色(7)㊁蓝紫色(8)㊁蓝色(9)萼片下表面主要颜色M a i n c o l o r s o n t h e l o w e r s u r f a c e o f s e pa l s 白色(1)㊁金黄色(2)㊁黄绿色(3)㊁浅粉色(4)㊁深粉色(5)㊁紫红色(6)㊁紫色(7)㊁蓝紫色(8)㊁蓝色(9)萼片上表面颜色分布(1种颜色)C o l o r d i s t r i b u t i o no n t h e s u r f a c e o f s e pa l s (1c o l o r )向中部逐渐变浅(1)㊁色泽均匀(2)㊁向边缘逐渐变浅(3)萼片上表面层次分布(两种以上颜色)L a y e r d i s t r i b u t i o no n t h e s u r f a c e o f s e p a l s (t w oo rm o r e c o l o r s )镶边(1)㊁中条(2)㊁斑点(3)㊁脉纹(4)萼片边缘波状程度D e g r e e o fw a v i n e s s a t t h e e d g e o f s e p a l s 无或极弱(1)㊁弱(2)㊁中(3)㊁强(4)花瓣状退化雄蕊主要颜色T h em a i n c o l o r o f p e t a l l i k e d e ge n e r a t e d s t a m e n s 白色(1)㊁金黄色(2)㊁黄绿色(3)㊁浅粉色(4)㊁深粉色(5)㊁紫红色(6)㊁紫色(7)㊁蓝紫色(8)㊁蓝色(9) I S S R -P C R 反应体系为25.0μL ,具体包括:1.0μL D N A 工作液㊁2.0μL 引物㊁12μL2ˑE sT a q M a s t e rM i x ㊁10μL d d H 2O ㊂I S S R -P C R 反应程序为:94ħ预变性5m i n;94ħ变性50s ;50ħ退火1m i n ;72ħ延伸1m i n ;36个循环;72ħ延伸10m i n ;4ħ保存㊂表4 12条引物名称及序列T a b l e 4 I n f o r m a t i o no f 12I S S R p r i m e r s引物名称P r i m e r n a m e引物序列P r i m e r s e qu e n c e (5'ң3')退火温度A n n e a l i n g t e m pe r a t u r e /ħU B C 815C T C T C T C T C T C T C T C T G54.0U B C 824T C T C T C T C T C T C T C T C G 55.4U B C 834A G A G A G A G A G A G A G A G Y T 57.5U B C 835A G A G A G A G A G A G A G A G Y C 50.4U B C 836A G A G A G A G A G A G A G A G Y A 55.4U B C 840G A G A G A G A G A G A G A G A Y T 55.4U B C 841G A G A G A G A G A G A G A G A Y C 55.4U B C 843C T C T C T C T C T C T C T C T R A 54.0U B C 844C T C T C T C T C T C T C T C T R C 55.4U B C 845C T C T C T C T C T C T C T C T R G 55.4U B C 866C T CC T CC T CC T CC T CC T C 55.4U B C 899C A T G G T G T T G G T C A T T G T T C C A 51.81.2.4 数据处理(1)形态指标数据处理利用E x c e l 2019对调查测定的表型性状数据进行整理,计算14个数量性状的最小值㊁最大值㊁极差㊁平均值㊁标准差和变异系数;计算15个假质量性状的分布频率及S h a n n o n -W i e n e r 信息指数H (H =1-ði n =i P il n P i )和S i m p s o n 遗传多样性指数D (D=1-ðin =1P2i),式中:P i 为某一性状第i 级内材料份数占总份数的百分比㊂利用S P S S 26.0基于欧式遗传距离(E u c l i d e a n d i s t a n c e )对29个表型性状进行R 型聚类分析,对26个长瓣铁线莲品种(种)进行Q 型聚类分析㊂(2)I S S R 分子标记数据处理依据人工读带原则,同一引物扩增出来的条带,在同一位置上出现清晰无拖带条带记为 1 ,无条带记为 0 ,建立0,1矩阵㊂利用N T s ys 软件计算遗传相似系数,使用U P G M A 法绘制聚类分析图[22]㊂使用P O P G E N E 软件计算等位基因数(N a )㊁有效等位基因数(N e )㊁S h a n n o n s 多样性信息指数(I )㊁N e i s基因多样性指数(H )等指标㊂选择具有良好多态性97草 地 学 报第32卷位点的引物,构建26个长瓣铁线莲的指纹图谱[23]㊂2 结果与分析2.1 形态标记遗传多样性结果与分析2.1.1 14个数量性状的多样性分析 由表5可知,14个数量形状的变异系数在0.24%~2.32%之间,其中复叶长,复叶宽和萼片长的变异系数均最小,为0.24%;花瓣状退化雄蕊数量的变异系数为2.32%,表明花瓣状退化雄蕊的变异较为丰富,长瓣铁线莲品种 粉红玛卡 的花瓣状退化雄蕊数量为0,而海洋珍珠的花瓣状退化雄蕊数量最多可达311个㊂叶指标的平均变异系数为0.29%,花指标的平均变异系数为0.64%,可见长瓣铁线莲花的变异较为丰富㊂表5 14个数量性状多样性分析T a b l e 5 D i v e r s i t y A n a l ys i s o f 14Q u a n t i t a t i v eT r a i t s 数量性状Q u a n t i t a t i v e t r a i t最大值M a x最小值M i n极差R a n ge 平均值M e a nv a l u e标准差S D变异系数C V/%株高P l a n t h e i gh t /m m 283.6732.46251.21145.5839.200.27复叶长C o m p o u n d l e a f l e n g t h /m m 134.1418.08116.0673.8717.840.24复叶宽C o m po u n d l e a fw i d t h /m m 172.1242.01130.1194.5822.840.24顶端小叶长A p i c a l l o b u l e l e n g t h /m m 104.6118.0386.5848.5114.450.30顶端小叶宽T o pl e a f l e tw i d t h /m m 64.744.0660.6822.078.660.39叶柄长度P e t i o l e l e n gt h /m m 125.2112.56112.6549.6214.350.29花冠直径C o r o l l a d i a m e t e r /m m 105.577.1098.4858.2316.980.29花梗长P e d i c e l l e n g t h /m m 193.2328.77164.4681.5221.240.26花量F l o w e r o u t p u t /p c s 52.001.0051.0011.8711.410.96萼片长S e p a l l e n g t h /m m 68.8110.0558.7639.289.580.24萼片宽S e pa lw i d t h /m m 34.995.4329.5614.904.460.30花瓣状退化雄蕊数量N u mb e r o f p e t a l i z e d s t a m e n s /pc s 311.000.00311.0021.6150.112.32花瓣状退化雄蕊长P e t a l i n e s t a m e n l e n gt h /m m 63.240.0063.2434.4211.170.32花瓣状退化雄蕊宽P e t a l i n a t e d s t a m e nw i d t h /m m 15.650.0015.656.512.580.402.1.2 15个假质量性状的多样性分析 由表6可知,15个假质量性状的信息多样性指数H 在0~2.29%之间,遗传多样性指数D 在0~0.94%之间,叶片形状㊁叶片顶端形状㊁叶片基部形状㊁萼片上表面主要颜色㊁萼片下表面主要颜色㊁萼片上表面颜色分布(1种颜色)㊁萼片上表面次色分布(两种以上颜色)㊁萼片边缘波状程度㊁花瓣状退化雄蕊主要颜色,9个指标的H 和D 值均较高,表明这些指标在26个长瓣铁线莲中表现出较高的遗传多样性㊂表6 15个假质量性状的多样性分析T a b l e 6 D i v e r s i t y A n a l y s i s o f 15P s e u d o -qu a l i t a t i v e c h a r a c t e r i s t i c 假质量性状P s e u d o -qu a l i t a t i v e c h a r a c t e r i s t i c 分级及频率C l a s s i f i c a t i o na n d f r e q u e n c y/%123456789H D叶片上部主要颜色T h em a i nc o l o r o f t h eu p p e r p a r t o f t h eb l a d e 7.7053.8530.777.701.000.60叶片下部主要颜色M a i nc o l o r o f t h e l o w e r p a r t o f t h eb l a d e7.7053.8530.777.701.000.60叶片形状B l a d e s h a pe 34.6234.6219.2311.541.440.71叶片顶端形状B l a d e t i p s h a pe 15.3815.3815.3846.157.701.540.71叶片基部形状B l a d eb a s e s h a pe 26.9234.6215.3823.081.550.73叶片边缘形状B l a d e e d g e s h a p e 011.5426.9215.3846.150.880.68萼片形状S e p a l s h a pe 24.0060.0016.000.760.56萼片基部形状S e p a l b a s e s h a pe 100萼片先端形状S e p a l a p e xs h a pe 8.0024.0060.004.004.001.460.57萼片上表面主要颜色M a i nc o l o r s o n t h e s u r f a c eo f s e pa l s 12.004.008.0028.0004.0028.0016.004.002.400.79萼片下表面主要颜色M a i nc o l o r s o n t h e l o w e r s u r f a c eo f s e pa l s 4.004.008.0024.008.0020.0028.004.002.290.81萼片上表面颜色分布(1种颜色)C o l o r d i s t r i b u t i o no n t h e s u r f a c eo f s e p a l s (1c o l o r )16.0032.008.000.770.87萼片上表面次色分布(两种以上颜色)L a y e r d i s t r i b u t i o no n t h e s u r f a c eo f s e pa l s (t w oo rm o r e c o l o r s )12.008.004.0020.001.440.94萼片边缘波状程度D e g r e eo fw a v i n e s s a t t h e e d g eo f s e pa l s 44.0024.0016.0016.001.550.70花瓣状退化雄蕊主要颜色T h em a i nc o l o r o f p e t a l l i k ed e ge n e r a t e ds t a m e n s 4.004.008.0024.008.0020.0028.004.002.290.818第1期贾艳艳等:基于形态标记和I S S R分子标记的长瓣铁线莲遗传多样性分析2.1.3基于表型性状的聚类分析(1)29个表型性状的R型聚类分析由图2可知,在欧式遗传距离为15时,可将29个表型性状划分为七大类,第一类包括萼片上㊁下表面主要颜色等4个假质量性状;第二类包括叶片顶端形状和叶片基部形状两个假质量形状;第三类包括的表型性状数量最多,包含花瓣状退化雄蕊长度㊁花瓣状退化雄蕊宽度㊁株高等16个表型性状;第四类包括花量和叶片形状两个表型性状;第五类包括花瓣状退化雄蕊数量㊁萼片基部形状和萼片上表面颜色分布(1种颜色)3个性状;第六类仅包含萼片边缘起伏;第七类仅包含萼片上表面次色分布(2种以上颜色)㊂图229个表型性状的R型分析F i g.2 R-t y p e a n a l y s i s o f29p h e n o t y p i c t r a i t s(2)26个长瓣铁线莲的Q型聚类分析由图3可知,在欧式距离为15时,可将26个长瓣铁线莲样本划分为五大类,第一类包括 梅德威尔 ㊁ 弗朗姬 和 拉古 等11个样本;第二类包括粉红火烈鸟 ㊁ 紫色惊喜 和 乡村玫瑰 等5个样本;第三类仅包含 珍珠海洋 ;第四类包括 黄金之梦 ㊁ 粉色秋千 和 柠檬之梦 等8个样本;第五类仅包含 金色斯托尔维克 ㊂第一类的11个长瓣铁线莲花色均为蓝紫色,花瓣状退化雄蕊数量较多,重瓣较高㊂第三类的 珍珠海洋 花形最为独特,既无雄蕊亦雌蕊,花瓣状退化雄蕊数量100多㊂第五类的 金色斯托尔维克 叶色为金黄色,与其他长瓣铁线莲存在显著差异㊂2.2I S S R分子标记遗传多样性结果与分析2.2.1 D N A提取与检测26个样本D N A的电泳检测,结果显示样本D N A母液电泳结果均为一条清晰明亮的条带,26个样本纯度高满足后续反应对模板D N A的质量要求(图4)㊂2.2.2I S S R引物筛选及扩增结果 12条引物共扩增出144条清晰条带,其中特异性条带144条,每个引物平均扩增出12个位点,平均特异性位点12个,多态性比率达到100%(表7)㊂12条引物可扩增出6~17条数量不等的条带,扩增条带片段大小为200~2000b p,其中,引物U B C815扩增出数量最多的多态性条带(图5),为17条㊂引物U844扩增出数量最少的多态性条带,为6条㊂利用P O P-G E N E分析26份长瓣铁线莲样本D N A多样性,铁线莲等位基因数(N a)为1.9931,有效等位基因数(N e)为1.2934,N e i s基因多样性指数(H)为0.2014,S h a n n o n s多样性信息指数(I)为0.3362,表明26个长瓣铁线莲具有较高的D N A多态性和丰富的遗传多样性㊂18草地学报第32卷图326个长瓣铁线莲样本的Q型聚类分析F i g.3 Q-t y p e c l u s t e r i n g a n a l y s i s o f26s a m p l e s o f C l e m a t i sm a c r o p e t a l a图426个样本基因组D N A母液电泳结果F i g.4 E l e c t r o p h o r e s i s r e s u l t s o f g e n o m i cD N A m o t h e r l i q u o r o f26s a m p l e s图5引物U B C815的P C R扩增电泳图谱F i g.5P C Ra m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h e r o g r a mo f p r i m e rU B C8152.2.326个长瓣铁线莲的I S S R聚类结果利用12条引物扩增出来的144个条带构建0㊁1矩阵,导入N t s y s建立26个长瓣铁线莲种质资源遗传相似系数矩阵(表8),26个供试样本的遗传相似系数在0.0526~0.4773之间,平均相似系数为0.20,说明26个长瓣铁线莲间具有较高的遗传多样性㊂其中, 金色斯托尔维克 和 紫色惊喜 的遗传相似系数最小为0.0526,表明二者之间亲缘关系较远;从形态学角度来看,二者间的确存在较大差异, 金色斯托尔维克 叶色为黄绿色,叶型为倒卵圆形,叶片边缘为圆齿状,花色为蓝紫色,萼片形状为椭圆形; 紫色惊喜 叶色为浅绿色,叶型为披针形,叶片边缘为锯齿状,花色为紫色,萼片形状为披针形㊂28第1期贾艳艳等:基于形态标记和I S S R 分子标记的长瓣铁线莲遗传多样性分析表7 12条引物扩增的多态性信息T a b l e7 P o l y m o r p h i s mi n f o r m a t i o n a m p l i f i e db y 12p r i m e r s 引物名称P r i m e r n a m e位点数N u m b e r o f b i t s 多态性位点数N u m b e r o fp o l y m o r ph i c l o c i 多态性百分率P o l y m o r ph i s m p e r c e n t a ge /%U B C 8151717100U B C 8241414100U B C 8341414100U B C 8351313100U B C 8361414100U B C 8401414100U B C 8411212100U B C 84388100U B C 84466100U B C 84599100U B C 8661414100U B C 89999100塞西尔 和 弗朗姬 的遗传相似系数较大为0.4773,说明两者间具有较近的亲缘关系;形态标记聚类时,二者同样被划分为一类, 塞西尔 和 弗朗姬 的大多形态指标相近,例如叶片颜色为浅绿色,叶片形态相近,幼枝都被稀疏短绒毛,叶片均被毛,花朵均具淡香,花朵大小相近,萼片排列方式均为相接,萼片先端均不反折,形状均为急尖,萼片纵切面形状均为凸状,萼片边缘无起伏,萼片及花瓣状退化雄蕊主要颜色均为蓝紫色等㊂综合26个供试样本的遗传相似系数,金色斯托尔维克 与其他的样本间的遗传相似系数较小,在0.05~0.31之间,说明 金色斯托尔维克 与其他品种及野生种的亲缘关系较远,在形态标记聚类时 金色斯托尔维克 单独被划分为一类㊂26个样本的U P GMA 法的聚类结果表明,在相似系数为0.68处,可将26个长瓣铁线莲划分为八类(图6)㊂其中, 黄金之梦 划分为第一类, 琥珀 划分为第二类,阜平长瓣铁线莲划分为第三类, 乡村玫瑰 划分为第四类, 峭壁 划分为第五类, 金色惊喜 , 紫色惊喜 , 柠檬之梦 划分为第六类, 拉古 划分为第七类,其余17个品种划分为第八类㊂聚类结果显示 金色斯托尔维克 与其他16个品种被划分为一类,且与 紫色之梦 亲缘关系较近,从形态学角度来看, 金色斯托尔维克 叶色为黄绿色,叶型为倒卵圆形,叶片顶端形状为急尖,叶片基部形状为楔形,花色为蓝紫色,萼片形状为椭圆形,花瓣状退化雄蕊数量较少;而 紫色之梦 叶色为淡绿色,叶型为卵圆形,叶片顶端形状为卷须状,叶片基部形状为钝圆形,花色为紫粉色,萼片形状为卵圆形,花瓣状退化雄蕊数量相对较多,但形态聚类 金色斯托尔维克 被单独划分为一类,形态学聚类与分子学聚类存在差异㊂图6 基于I S S R 标记的26个长瓣铁线莲种质资源的U P G M A 聚类F i g .6 U P GMAc l u s t e r i n g o f 26C l e m a t i sm a c r o pe t a l a g e r m p l a s mr e s o u r c e sb a s e do n I S S R M a r k e r s 2.2.4 26个长瓣铁线莲的I S S R 指纹图谱构建 为快速区分鉴定26个长瓣铁线莲,利用多态性高㊁条带清晰的I S S R 引物U B C 815,U B C 824和U B C 836构建26个长瓣铁线莲的数字指纹图谱(表9)㊂38草 地 学 报第32卷表8 26个长瓣铁线莲种质资源的遗传相似系数T a b l e 8 G e n e t i c s i m i l a r i t y c o e f f i c i e n t s o f 26C l e m a t i sm a c r o pe t a l a G e r m p l a s m R e s o u r c e s 编号12345678910111213141516171819202122232425261 1.000020.40001.000030.29550.29551.000040.41460.28890.37211.000050.32560.21280.31820.28261.000060.30610.33330.47730.32000.38301.000070.28890.23400.40480.20000.31110.43481.000080.29790.24490.29170.34040.26530.38000.39691.000090.24000.24000.14550.16360.14550.22810.23080.19641.0000100.25000.22450.27080.19230.19610.33330.29170.25000.10001.0000110.28570.21150.23080.14040.18520.31480.41300.33330.25450.26421.0000120.17650.25000.19610.12730.22000.23640.16980.14040.17860.18520.24071.0000130.21820.21820.19300.18970.15250.31580.25450.24140.15870.31480.25420.24561.0000140.15790.15790.15520.09680.08060.19350.15250.20340.16130.12900.23730.27270.26231.0000150.27080.22000.21570.16670.24000.18970.26000.13790.11670.20370.17240.12070.26320.14521.0000160.14290.12280.08330.11860.12070.10770.13790.18970.09380.13330.14520.11480.08700.21310.13111.0000170.14290.14290.20590.13510.07890.20000.20000.18420.12200.1220.23680.10000.15910.19050.15380.06671.0000180.12070.27450.20000.17540.13790.25860.24070.22810.18330.21050.24140.15000.18750.19050.18640.21670.08891.0000190.09620.14000.16000.13460.18370.10800.11320.16980.10530.10910.14290.24490.28300.21820.12730.16070.05130.20001.0000200.10530.12500.20750.10170.12280.33960.20370.21430.11290.26420.25000.11670.21310.23730.19030.18330.20510.30910.18521.0000210.20000.20000.28070.25420.19670.25000.27590.28330.13040.22580.25400.18750.16900.20590.20310.23080.24440.26560.23730.25401.0000220.19150.21740.23910.20830.21280.30610.20830.27080.14810.17650.16670.05260.24070.11860.22000.08470.17650.16070.16330.18870.20001.0000230.17240.13900.25450.18640.15000.18750.20690.17740.19350.09090.17190.14290.16180.13040.14060.18750.08330.30510.21050.27120.23530.17241.0000240.13730.18370.25530.15380.11320.24530.15380.18870.12280.14810.18180.12730.16950.19300.14550.11860.16670.26420.22920.30000.23330.18370.14751.0000250.16670.16670.16670.31480.20000.20340.27870.24140.15380.13430.21310.22220.10450.20900.19400.27120.13040.12500.21540.16390.26230.34620.17140.26321.0000260.26420.19640.19300.21050.21430.19050.18970.24140.14060.14520.23330.14520.14710.13240.18030.17190.15910.13430.09680.17460.25760.21820.21540.15000.22731.0000注:序号1~26与表1名称相对应N o t e :S e r i a ln u m b e r s1~26c o r r e s po n dt ot h en a m e s i nT a b l e1表9 引物U B C 815、U B C 824和引物U B C 836构建26个长瓣铁线莲的数字指纹图谱T a b l e 9 c o n s t r u c t i o no f d i g i t a l f i n g e r p r i n t s o f 26C l e m a t i s l o n g i fl o r a w i t h p r i m e r sU B C 815㊁U B C 824a n dU B C 836编号N u m b e r名称N a m e指纹图谱F i n g e r pr i n t U B C 815U B C 824U B C 8361 梅德威尔 C . M a i d w e l lH a l l0000000000001011000000001000000000000000110002 吉斯卡 C . G i s k a 0000000001110101000000100000000000000010100003 塞西尔 C . C e c i l e 0010000011101011000000000000100000000010100004 芭蕾舞裙 C . B a l l e t s k i r t 0000010011101011000000000000100000010000100005 粉红玛卡 C . M a r k h a m s P i n k0000000101001001100000001000000000110010100006 弗朗姬 C . F r a n k i e 0000000001010011000000001000100000110010100007 泄湖 C . X i e h u0001000001010010000000001000100000000010100008 粉红火烈鸟 C . P i n kF l a m i n g o s 0000000011011010000100001000100000010000100009 乡村玫瑰 C . C o u n t r y R o s e 00000000001100111001100010000010000000001100010 海洋珍珠 C . O c e a nP e a r l 00000000100010100000000000000000001110110010011 紫罗兰惊喜 C . V i o l e t S u r p r i s e 00001000000111100000100010000000000000010000112 紫色惊喜 C . P u r p l e S u r p r i s e 00000000001101010010100000000010000110000000013 粉色惊喜 C . P i n k S u r p r i s e 00010000011000100000100100100000000110100000114 金色惊喜 C . G o l d e n S u r p r i s e 00100000000101010010110000000000010010000000115 蓝色惊喜 C . B l u e S u r p r i s e 01110000010011100000010101000000000101100000016 黄金之梦 C . G o l d e nD r e a m 10000000000010000000000000000001011100000000017 紫色之梦 C . P u r p l eD r e a m 00000000010111100000000000000000000000000000018 粉色之梦 C . P i n kD r e a m 01000000111101000000000000100000101100111001019 C .柠檬之梦 C . L e m o nD r e a m 00000000011000000000100000000000101110000001020 粉色秋千 C . P i n k S w i n g00000000110110000000010000100000101110100100021 峭壁 C . C l i f f00000001110111100000000000000000110111011001022 金色斯托尔韦克 C . S t o l w i jkG o l d 00000000110100100100000001000000011000101000023 琥珀 C . A m b e r00000000110000000000000100100000100001101000024 白色高压 C . W h i t e h i gh p r e s s u r e 00000001101101000000000000100000000000001000025 拉古 C . L a gu 00100100101001000000010001000100011110111100026野生长瓣铁线莲C l e m a t i sm a c r o pe t a l a 00000011100110000000001001000000000101000001048第1期贾艳艳等:基于形态标记和I S S R分子标记的长瓣铁线莲遗传多样性分析3讨论物种的遗传多样性是其长期进化的结果,也是其生存㊁适应和发展的前提,遗传多样性在物种形态㊁分子水平上均有所表现,丰富的遗传多样性是宝贵的基因资源[24-25]㊂形态标记表现直观,易于调查测量,其变异系数和多样性指数反映了种质间性状的离散程度和多样性,是研究植物遗传多样性的重要方法[26]㊂沈瑶等[27]在研究30个盆栽菊(C h r y s-a n t h e m u mˑm o r i f o l i u m R a m a t.)品种形态遗传多样性时发现,性状变异系数为14.67%~78.25%,最低和最高变异系数分别为冠幅和舌状小花数,表明盆栽菊品种表型变异丰富㊂本试验中长瓣铁线莲复叶长,复叶宽和萼片长的变异系数均最小,为0.24%;花瓣状退化雄蕊数量的变异系数为2.32%,表明花瓣状退化雄蕊的变异较为丰富,叶指标的平均变异系数为0.29%,花指标的平均变异系数为0.64%,长瓣铁线莲花的变异较丰富㊂I S S R分子标记多态性丰富㊁灵敏度高和稳定性高,被广泛应用于植物遗传多样性研究[28]㊂M a 等[29]对175种金丝桃属(H y p e r i c u mL i n n)植物利用I S S R分子标记法研究其遗传多样性水平,结果表明,I S S R分子标记技术可有效鉴别175种金丝桃属植物,17个欧洲种的遗传相似系数在0.617~ 0.911间㊂本试验的26个长瓣铁线莲遗传相似系数在0.05~0.48之间,平均相似系数为0.20,表明26个长瓣铁线莲间具有较远的亲缘关系,26个样本的等位基因数(N a)为1.9931,有效等位基因数(N e)为1.2934,N e i s基因多样性(H)为0.2014, S h a n n o n s多样性信息指数(I)为0.3362,表明26个长瓣铁线莲具有较高的遗传多样㊂12条多态性较高的I S S R引物共扩增出144个位点,多态性比率达100%,表明I S S R分子标记技术可有效鉴别长瓣铁线莲种质资源,结果显示,不同长瓣铁线莲种质资源具有较高的遗传多样性和复杂的遗传背景,引物U B C815,U B C824,U B C836构建的26个长瓣铁线莲指纹图谱可快速区分鉴定26个样本㊂胡霞等[30]则发现杏(P r u n u s a r m e n i a c a L.)的野生种群间具有较高的遗传多样性水平,群体内遗传分化水平较高,群体间遗传分化水平较低㊂对比王鑫等[11]的研究结果发现,引物U B C824对河北易县野生的长瓣铁线莲P C R扩增电泳图谱与本研究的扩增图谱存在差异,推测可能与材料取材于不同地区有关,长瓣铁线莲野生居群间同样可能存在遗传多样性㊂本研究基于表型性状和I S S R分子标记技术对26个长瓣铁线莲进行聚类分析,表型性状聚类将26个长瓣铁线莲样本划分为5类,而I S S R分子标记聚类,将26个长瓣铁线莲划分为八类,其中包括 金色惊喜 ㊁ 紫色惊喜 ㊁ 梅德威尔 和 吉斯卡 等13个品种的形态聚类和I S S R分子聚类结果相同,另外13个长瓣铁线莲两种方法聚类结果差异较大,在形态聚类中 珍珠海洋 和 金色斯托尔维克 分别被单独划分为一类,但在I S S R分子聚类中 金色之梦 ㊁ 琥珀 ㊁ 乡村玫瑰 ㊁ 峭壁 ㊁ 拉古 及野生长瓣铁线莲分别被单独划分为一类㊂形态标记和I S-S R分子标记聚类结果不完全相同,这与前人的研究报道一致[31-33]㊂造成这两种分类方法结果不一致的原因是多方面的,首先,长瓣铁线莲遗传背景复杂,本研究利用的形态性状不足㊁单一的分子标记探查到的遗传差异有限,不能全面反映品种的遗传信息;其次,形态标记由基因和环境的共同作用,长瓣铁线莲形态容易受到环境因素影响㊂结合两种聚类方法可初步确定26个长瓣铁线莲的聚类,由于形态标记易受环境影响,且突变对形态标记会产生不利影响,故推测I S S R分子聚类较为准确㊂I s m a i l等[34]利用I S S R㊁S S R,两种标记方法对57种火炬姜(E t l i n g e r a e l a t i o r)种质进行了分子特征评价,表明不同分子标记的组合的研究更具可靠性㊂为提高试验结果准确性,在之后的工作中将加入其他的分子标记方法进行佐证,结合多种标记方法,综合运用多种评价体系,更有利于反应长瓣铁线莲遗传多样性水平㊂4结论形态标记结合I S S R分子标记可有效区分鉴定长瓣铁线莲种质资源,两种标记方法均表明26个长瓣铁线莲样本具有较高遗传多样性水平,本试验可为长瓣铁线莲种质资源收集保存㊁创制新品种等提供一定的理论基础㊂参考文献[1]韵敏.铁线莲属植物研究现状及其在园林方面的应用[J].林业科技情报,2021,53(4):57-59[2]杨维雄,常晓勇,尹建华.我国铁线莲属植物研究进展[J].现代农业科技,2020,23(9):135-137[3]孙瑞琦.铁线莲杂交育种及遗传转化初步研究[D].福州:福建农林大学,2019:1-12[4]张鸽香,武珊珊.我国铁线莲属植物的研究现状及其园林应用58。

我国铁线莲属植物研究进展铁线莲是一种广泛分布于我国南北地区的植物，其广泛的生态适应性和独特的药用功效使之备受关注。

在过去几年中，对铁线莲属植物的研究取得了显著进展，涉及到分类学、生物学、化学和药理学等多个方面。

分类学研究关于铁线莲的分类和系统发育，早在上世纪九十年代就已进行了一些研究。

其中一项研究结果表明，铁线莲在地球所有角落分散分布的可能性很高，且存在多个独立的起源。

近年来，基于DNA分子标记和生物信息学技术的研究取得了更深入的进展，建立了更为精确和可靠的铁线莲属植物系统发育关系。

这项研究结果表明，铁线莲属植物可分为南方和北方两个分支，北方分支有10个物种，南方分支则包括4个物种。

生物学研究铁线莲在我国南北地区的各种环境中均可出现，包括海拔高度为3500米的高原地区，以及沙漠、悬崖、草地等特殊环境中。

因此，其对环境的适应性成为研究的热点之一。

近年来，基于转录组学和代谢组学技术的研究揭示了铁线莲对一氧化碳、氯化钠、铜离子等胁迫因素的响应机制。

其中，针对铜离子胁迫的研究结果表明，铁线莲能够通过调控铜离子形态、增强根系钝化和植株分泌物的形成等机制来适应铜离子的毒害。

铁线莲是一种药用植物，被认为具有清热解毒、消炎、止血、祛痰等多种药用功效。

其中，良种铁线莲（Veronicastrum axillare (Lam.) Schweigg. & Körte）的主要活性成分是多糖和皂甙，因此在化学研究中被认为是重点研究对象。

近年来，通过超高效液相色谱、质谱联用技术等，从铁线莲中分离出了多糖、皂甙、黄酮甙、环烷醇等多种化合物，并对其药用功效进行了探究。

另外，也有研究表明，铁线莲中的某些成分具有抗肿瘤、抗氧化等生物活性，因此在食品和保健品等领域也具有广阔的应用前景。

药理学研究铁线莲的药理学研究主要围绕其抗炎、抗病毒、神经保护等作用展开。

其中，研究表明铁线莲的多糖可以显著降低体内炎性介质的水平，发挥抗炎作用。