植物分子育种学
- 格式:doc
- 大小:163.50 KB
- 文档页数:14
植物分子育种学的概念运用分子生物学技术的科学性与先进性,即可以将不同物种的遗传物质(DNA或基因)导入受体细胞,再进行培育与选择,从而育出符合育种目标要求的新品种。
植物分子育种可概括为三个层次上的工程技术:1.将带有目的性状基因的供体总DNA片段导入欲改良的植物受体细胞,使其后代发生变异,从中筛选出获得目的性状的后代或符合需要的有价值的新类型,培育出高产、优质、高抗的新品种;2.分离目的基因,构建重组分子,导入需要改良的植物受体细胞,经过筛选,培育出获得目的性状,且综合性状优良的后代,育出新品种。
3.分子标记层次。
植物分子育种的特点1、打破物种分类的界限,充分利用自然界丰富的遗传资源,使遗传物质能在不同的植物间,甚至在植物、动物和微生物之间进行交流;2、利用植株的特定细胞进行外源DNA或基因的转移,如卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞;或者幼胚、幼苗、芽丛分裂旺盛的细胞,它们随着整体生长发育的进程而完成外源DNA或基因的导入、整合与转化过程。
无需经过细胞原生质体离体培养、转化诱导,形成再生株等一系列繁琐复杂的培养流程。
3、适应面广,单子叶、双子叶植物均可运用这项技术达到品种创新与改良的育种效果。
4、与常规育种相比,育种时间明显缩短,一般只需3~4代各选系便可稳定。
5、方法简便,室内外(大田、盆栽场、温室等)均可进行,常规育种工作者易于掌握。
周光宇提出的“DNA片段杂交”假说:就整体分子而言,远缘亲本间的染色体结构是不亲和的,容易相互排斥。
但局部DNA分子部分基因间的结构有可能保持一定的亲和性,因而远源DNA片段有可能进入受体细胞。
在母体DNA复制过程中,这种DNA片段便与受体基因组相应区段整合,成为子代所表现的各种典型或非典型遗传变异现象的内在遗传依据。
DNA片段杂交假说的分子验证1、同工酶分析:在高粱稻(银坊×亨加利)及其亲本酯酶同工酶分析研究中发现一条与高粱相同而银坊(母本)没有的酶带,说明高粱稻中的这条酶带来自父本高粱;2、DNA分子杂交:在对高粱稻基因组的分析研究中,取父本高粱DNA与母本水稻DNA进行分子杂交,除去两者的同源序列,以其余的高粱DNA序列制备探针,与高粱稻DNA进行分子杂交,发现高粱稻DNA中存在高粱的同源序列,从而证实高粱稻基因组中确实存在高粱DNA片段,此即说明高粱DNA片段已整合于高粱稻的基因组中。
植物分子育种技术及应用随着人口的不断增长,越来越多的粮食和其他农作物需求不断增长。
而传统的育种方法需要大量的时间和成本,不能满足现代社会的需求。
为此,科学家们研究出了一种名为植物分子育种技术的新方法。
本文将介绍这种新技术,并探讨它的应用前景。
1. 植物分子育种技术是什么植物分子育种技术是一种基于分子生物学和生物信息学的新兴技术。
它是通过分析植物基因组中与某些质量特征相关的DNA标记,来帮助育种者判断某个植株的质量特征。
这种技术不仅节省了传统育种方法中的时间和成本,而且能够更准确地预测育种结果。
2. 植物分子育种技术的应用由于植物分子育种技术具有高效、高准确性和高可操作性的优点,因此已经在许多农作物的育种中得到了广泛应用。
以下是这种技术应用的几个方面:(1)提高产量和品质植物分子育种技术可以通过种子培育、环境控制和育种研究等方法来提高作物的产量和品质。
例如,通过检测大豆DNA中的一些特定标记,科学家可以挑选出潜在的耐旱、高产和高蛋白质品种。
(2)提高抗病性植物分子育种技术还可以帮助育种者研究抗病性。
通过分析具有特定DNA标记的植物,科学家可以预测一些抗性基因在种群中的频率。
这一因素对于研发抗病新品种尤为重要。
(3)开发适应性更高的品种由于气候变化和其他环境变化的影响,许多种植物无法适应当地的气候和土地条件。
植物分子育种技术可以帮助开发适应性更高的品种。
通过分析多个DNA标记,科学家可以确定那些携带适应性基因的植物,进而培育出更适合当地环境的新品种。
3. 植物分子育种技术的实现和发展植物分子育种技术是一项复杂的研究领域,需要多学科领域的知识支持。
同时,这种技术也需要新的技术和新方法的不断开发。
(1)基因测序技术的进步随着基因测序技术的不断发展,植物分子育种技术也得到了更多的支持。
人们可以在更短的时间内完成基因测序,同时也可以分析更多的DNA标记,从而提高了植物分子育种技术的准确性和效率。
(2)人工智能和大数据的应用人工智能和大数据对于植物分子育种技术的应用尤为重要。
分子植物育种是一种利用分子生物学和遗传学原理来改良植物品种的方法。
它通过研究植物的基因组、基因表达和遗传变异等分子水平的变化,以期获得具有优良性状的新品种。
在分子植物育种中,常用的技术包括:
1.基因克隆:通过从植物组织或细胞中提取DNA,并利用分子生物学方法将目标基因分离出来,然后将其插入到载体中进行扩增和转化,最终获得含有目标基因的转基因植物。
2.基因编辑:利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术,直接对植物基因组进行精确的修改,以实现特定性状的改变。
这种方法可以高效地改变植物的遗传信息,但需要对目标基因进行精确的设计和操作。
3.基因表达调控:通过研究植物基因的表达模式和调控机制,可以了解不同基因在植物生长发育过程中的功能和相互关系。
这有助于确定哪些基因对于特定性状的改良是关键的,并为后续的育种工作提供指导。
4.遗传分析:通过对植物群体的遗传多样性和亲缘关系进行分析,可以评估不同个体之间的遗传差异,并选择具有优良性状的个体进行杂交和选育。
5.分子标记辅助选择:利用分子标记技术,可以在早期阶段对植物进行筛选和鉴定,从而加快育种进程。
分子标记可以是特定的DNA序列、SNP(单核苷酸多态性)等,它们与目标性状相关联,可以作为选择的重要依据。
分子植物育种的优势在于可以更加精确地改良植物性状,提高育种效率和成功率。
同时,它也为解决一些传统育种方法难以解决的问题提供了新的途径。
然而,分子植物育种也面临一些挑战,如技术复杂性、安全性和伦理问题等,需要在实践中加以解决和完善。
第十章 分子育种一、名词解释1.植物基因工程:指把不同生物有机体的DNA(或基因)分离提取出来,在体外进行酶切和连接,构成重组DNA分子,转化到受体细胞,使外源基因在受体细胞中复制增殖,然后借助生物的或理化的方法将外源基因导入到植物细胞,进行转译或表达。
2.生物安全:是指生物技术从研究、开发、生产到实际应用整个过程中的安全性问题。
3.分子标记:是指以生物大分子,尤其是生物体的遗传物质—核酸的多态性为基础的遗传标记。
4.分子标记辅助育种:指借助于目标基因紧密连锁的分子标记的基因型分析,鉴定分离群体中含有目标基因的个体,以提高选择的效率,即采用分子标记辅助选择手段,减少育种过程中的盲目性,从而加速育种进程。
二、问答题1.基因的克隆方法和技术有哪些?(1)鸟枪法(2)mRNA分离法(3)转座子标签法及T-DNA插入突变法(4)基因图谱的克隆法(5)其他方法2.植物遗传转化方法和特点有哪些?(1)农杆菌介导的遗传转化(2)DNA理化转移方法①化学刺激质粒进入原生质体②电融合法③微注射④基因枪法⑤超声波处理法⑥碳化硅纤维介导DNA转移法⑦电泳法(3)种质系统转化法①花粉管通道法②胚囊及子房注射法③生殖细胞浸泡法3.转基因植物有哪些分析鉴定方法?(1)外源基因整合的鉴定DNA Southern杂交 PCR(2)外源基因转录水平的鉴定Northern 杂交 RT-PCR(3)外源基因表达蛋白的检测Western杂交(4)外源基因控制表型性状的鉴定。
4.转基因植物为何要进行安全性评价?如何评价?基因工程技术的出现,使人类对有机体的操作能力大大加强,基因在动物、植物和微生物之间相互转移,甚至可将人工设计合成的基因转入到生物体内进行表达,创造出许多前所未有的新性状、新产品甚至新物种,这就有可能产生人类目前的科技知识水平所不能预见的后果,危害人类健康、破坏生态环境。
因此要进行安全评价。
生物安全评价与控制,通常根据所涉及受体生物安全等级、操作的基因安全等级、两者结合的产生遗传工程体的安全等级设定不同的安全水平。
植物分子育种方法及其在实践中的应用研究简介植物分子育种方法是指利用分子生物学的技术手段,开发出一种高效、快速、准确的育种技术。
这种育种方法能够有效地避免传统育种技术中的一些局限性,如长时间、大量、耗费资源等等。
同时,它还能够利用现代科技手段,对植物基因的特性进行深入研究,控制植物的生长和产量,提高作物质量和产量。
在实际应用中,植物分子育种方法已经取得了很好的效果,成为了现代农业育种中的一个重要分支。
基本原理植物分子育种方法基于基因结构和功能的现代分子生物学技术,是育种方法中的一种前沿技术。
它主要是通过分子标记辅助育种、育种相关基因的定位、克隆、功能分析和表达特性研究等一系列手段。
主要的分子标记技术包括 RFLP(限制性片段长度多态性)、SSR(单序列重复)、SNP(单核苷酸多态性)和AFLP(扩增片段长度多态性)等。
这些技术不仅在基因组宽比较中得到广泛应用,而且还在杂交育种、种子染色体分析、植物病理、耐逆性和各种农业生物技术中得到广泛应用。
应用案例在实践中,植物分子育种方法已经应用于多个植物品种中,取得了良好的效果。
下面介绍几个相关的案例。
水稻育种水稻是全球重要的粮食作物之一,但遗传多样性低和复杂性强的特点使其育种一直是困难的。
利用植物分子育种技术,可以对水稻进行基因组宽扫描,可快速发现关键基因。
其中,SSR的遗传标记在水稻育种研究中起着重要的作用。
研究表明,这种标记可以作为水稻育种无链接群体的权重标记,也可以在水稻杂交育种中作为选择标记。
此外,水稻育种技术还通过人工杂交实验,筛选了新型优良品种,极大地提高了水稻产量、品质和抗病能力。
番茄育种外观和口感鲜美的番茄是人们日常膳食中必不可少的蔬菜之一,自然保护不足和品种选育存在不足是限制其生产和供应的主要原因。
植物分子育种技术不仅可以发掘番茄品种的基因体特点,而且可以人工筛选优良品种。
其中,番茄种子中的SSR标记在育种研究中的效果尤为明显,可以作为理想的群体标记,实现了关键功能基因的功能鉴定和证实等目标。
植物分子育种的研究与发展植物育种是指通过人工或自然的方式,对植物进行基因交换、选良选优、杂交改良等操作,进而获得更为优良的植物品种,以满足人们农业生产、食品生产等方面的需求。
而植物分子育种作为一种新兴的育种手段,在近年来得到了越来越广泛的应用,其研究与发展也逐渐受到了人们的关注。
一、植物分子育种的定义及发展历程植物分子育种是指以分子水平对植物的遗传因子进行研究和操纵,通过利用现代分子生物学技术,探索和开发新的植物育种方法。
该技术自20世纪60年代起,在基因工程和生物技术的推动下发展迅速,直到今日已成为植物育种领域的一大热点。
早在1972年,在分离了第一条限制性内切酶EcoRI基因序列之后,植物分子育种就诞生了。
1983年,瑞士科学家哥隆等人成功地将牛转移成一株含人成纤维细胞基因组DNA的细胞株,此举不仅为人类基因组研究奠定了基础,也为植物分子育种的未来发展铺平了道路。
不久之后,植物基因工程和生物技术迅速发展,其中包括基因克隆、基因编辑、基因组测序等技术的问世,加速了植物分子育种的发展。
因此,植物分子育种得以拓展各个领域,包括植物遗传学、植物育种、植物病理学和分子生态学等。
二、植物分子育种的方法与技术通过利用现代分析技术,如核酸测序、基因检测、基因编辑等,检测和操作目标基因,从而实现对植物基因的操纵。
在植物分子育种研究中,主要采用的方法包括:1.基因编辑技术随着CRISPR-Cas9的发明和改进,基因编辑技术已经成为目前最热门的植物分子育种技术之一。
利用基因编辑技术可以直接在植物体内修饰目标基因,快速成功改良植物性状。
2.遗传改造技术遗传改造技术是将外源基因整合到植物基因组中,以直接调控植物性状。
这种技术可用于改变植物抗病性、免疫能力、营养价值、生长速度和产量等。
3.转录组分析技术基于分子生物学方法,新一代测序技术的应用和全基因组测序数据的广泛拓展,植物转录组分析技术发展迅速。
通过转录组分析技术,可以对植物的基因表达进行深入的研究,理解植物生长发育中的分子机制。
国内外植物育种的历史已经证实,新的育种方法的采用和新的育种途径的探索成功将会提高植物育种的效果,给植物育种带来一场深刻的革命。
植物分子育种技术为物种间和属间甚至科间远缘遗传物质的导人和交换,进而为快速培育高产、多抗和优质的新品种提供有效的育种途径。
可望产生出巨大的社会效益和经济效益。
一、植物分子育种的概念植物分子育种是指不经过有性过程,将外源DNA导入植物,诱发可遗传的变异,以选育带目的性状的优良品种的育种技术。
分子育种广义地讲包括两个层次的生物工程技术:①外源DNA导入植物的技术:即将带有目的性状的基因的供体总DNA片段导人植物,筛选获得目的性状表达的后代,培育新品种;②植物基因工程技术:即将目的基因分离出来,在体外构建重组分子再导人植物细胞,然后通过离体培养并筛选获得目的基因表达的植株,培育新品种。
狭义的分子育种指的是第一个层次的分子育种即外源DNA导入植物的技术。
二、植物分子育种的特点我国育种学家对水稻、小麦、大麦、棉花、高梁、大豆、马铃薯、蚕豆等作物长达20年的探索后掌握了植物分子育种如下一些特点:1、操作简单。
基因工程技术自50年代初使用以来,在作物育种中的应用进展缓慢,主要原因是难以找到理想的目的基因,因为作物的主要经济性状一般是数量性状,这些性状受微效多基因控制,难于识别和分离。
此外,在通过基因工程改造作物的过程中很难找到合适的基因载体。
我国的植物分子育种以异源DNA片段有可能在受体植物细胞内形成部分杂交片段的假说为基础,通过适当的导人方法很容易将供体的总DNA导人受体细胞内,由此引起受体发生遗传性变异,为育种家提供丰富的遗传变异资源,因而是简单易行的育种新途径。
2、变异范围广。
周光宇、陈启锋和黄骏麒等认为,异源DNA 导人受体细胞后,由于供体与受体的异源遗传物质的相互作用,其中包括DNA片段的插人、整合、调控和启动等,会引起受体产生多种多样的遗传性变异。
受体所产生的遗传性变异涉及到作物的各类质量性状和数量性状,其中包括植株的形态变异、生长发育速度、生理生化特性、抗病虫能力、产量构成潜力和品质改良以及抗逆性等等。
植物分子育种学的概念运用分子生物学技术的科学性与先进性,即可以将不同物种的遗传物质(DNA或基因)导入受体细胞,再进行培育与选择,从而育出符合育种目标要求的新品种。
植物分子育种可概括为三个层次上的工程技术:1.将带有目的性状基因的供体总DNA片段导入欲改良的植物受体细胞,使其后代发生变异,从中筛选出获得目的性状的后代或符合需要的有价值的新类型,培育出高产、优质、高抗的新品种;2.分离目的基因,构建重组分子,导入需要改良的植物受体细胞,经过筛选,培育出获得目的性状,且综合性状优良的后代,育出新品种。
3.分子标记层次。
植物分子育种的特点1、打破物种分类的界限,充分利用自然界丰富的遗传资源,使遗传物质能在不同的植物间,甚至在植物、动物和微生物之间进行交流;2、利用植株的特定细胞进行外源DNA或基因的转移,如卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞;或者幼胚、幼苗、芽丛分裂旺盛的细胞,它们随着整体生长发育的进程而完成外源DNA或基因的导入、整合与转化过程。
无需经过细胞原生质体离体培养、转化诱导,形成再生株等一系列繁琐复杂的培养流程。
3、适应面广,单子叶、双子叶植物均可运用这项技术达到品种创新与改良的育种效果。
4、与常规育种相比,育种时间明显缩短,一般只需3~4代各选系便可稳定。
5、方法简便,室内外(大田、盆栽场、温室等)均可进行,常规育种工作者易于掌握。
周光宇提出的“DNA片段杂交”假说:就整体分子而言,远缘亲本间的染色体结构是不亲和的,容易相互排斥。
但局部DNA分子部分基因间的结构有可能保持一定的亲和性,因而远源DNA片段有可能进入受体细胞。
在母体DNA复制过程中,这种DNA片段便与受体基因组相应区段整合,成为子代所表现的各种典型或非典型遗传变异现象的内在遗传依据。
DNA片段杂交假说的分子验证1、同工酶分析:在高粱稻(银坊×亨加利)及其亲本酯酶同工酶分析研究中发现一条与高粱相同而银坊(母本)没有的酶带,说明高粱稻中的这条酶带来自父本高粱;2、DNA分子杂交:在对高粱稻基因组的分析研究中,取父本高粱DNA与母本水稻DNA进行分子杂交,除去两者的同源序列,以其余的高粱DNA序列制备探针,与高粱稻DNA进行分子杂交,发现高粱稻DNA中存在高粱的同源序列,从而证实高粱稻基因组中确实存在高粱DNA片段,此即说明高粱DNA片段已整合于高粱稻的基因组中。
3、DNA复性动力学分析:在对高粱稻及其两亲本的重复序列DNA复性动力学分析研究中,发现高粱稻基因组的中度重复序列部分与母本水稻有差异,从而进一步说明这是由于父本高粱稻DNA整合于母本水稻基因组而造成的结果。
外源DNA的导入是指通过某种特定的途径将外源基因或外源DNA片段导入受体细胞,使之整合到受体细胞基因组中,而实现其功能表达的过程。
外源DNA导入植物细胞三个关键因素:一、有适宜的基因(包括目的基因、选择标记基因或报告基因)和合适的选择条件;二、组织培养体系,要求植物细胞必需有效的再生成株,频率高,周期短;三、外源基因导入到植物的途径和方法,要求损失小、频率高且外源基因能稳定的整合到基因组,并且具有正常的时空表达能力。
外源DNA导入方法:一、按照技术属性可将它们分为物理法、化学法、生物法。
1、物理法:基因枪法、电激法、微注射法、激光穿刺法、超声波法、碳化硅纤维法等;2、化学法:聚乙二醇(PEG)法、磷酸钙-DNA共沉淀、脂质体法等;3、生物法:农杆菌介导法、花粉管通道法、浸渍法、病毒介导法等。
二、按照媒介类型的有或无,可分为载体介导法、直接导入法和种质系统介导法:1、载体介导法:将目DNA转入农杆菌或病毒中,并以之为载体,随着它们对植物的感染而将目的DNA导入植物细胞中;2、直接导入法:以裸露的外源DNA通过化学或物理方法直接导入植物细胞;3、种质系统介导法:借助植物自身的种质细胞与媒介(如花粉、子房、花粉管通道、幼胚等)来实现外源DNA导入,它包括花粉管导入法、子房、幼穗、幼胚注射法、种子浸渍法等。
一、农杆菌介导法又包括:(1)创伤植株感染法(又叫做整株感染)(2)原生质体和农杆菌共培养法转化植物细胞(3)叶盘法转化植物细胞。
目的基因通过这种方法进入植物细胞要分几个步骤走:第一,将目的基因重组到适当的Ti质粒载体或Ri质粒载体或其它类型的载体上。
根据所选用的载体系统进行重组。
重组方法就是基因工程中常用的一些基本方法。
第二,目的基因随载体进入农杆菌(即转化农杆菌)。
1)直接转化法;2)三亲交配法。
第三,目的基因进入植物细胞,即植物细胞的转化。
根癌农杆菌获得了外源目的基因后,接下来的工作就是要转化给植物细胞。
(原理):农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它们侵染植物后能诱发植物形成肿瘤。
从一种致癌的农杆菌中分离出了一种巨大质粒(约200Kb),称为致癌质粒,简称Ti质粒。
Ti质粒上有一段DNA被称为转移DNA(简称T-DNA),能转移并整合到植物染色体上,其上携带的基因能在受体细胞中表达。
Ti质粒随后被改造用作人工植物基因工程的载体。
这种利用农杆菌的遗传转化体系,将外源目的基因或DNA片段插入Ti质粒的T-DNA中,并随之导入受体植物细胞,而获得转基因植株的方法,即为农杆菌介导法。
(操作步骤)植物受体系统的建立;Ti质粒转化载体系统的构建;工程农杆菌的制备;外源基因的转化;转化体的筛选和转基因植株的检测二、基因枪法又称微弹轰击法、粒子轰击法、高速粒子喷射技术、弹道微靶点射击,是一种借助高速金属微粒将DNA 分子引入活细胞的转化技术。
(原理)利用火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力,将载有外源DNA的金(或钨)粉等金属微粒加速,射入受体细胞或组织,从而达到将外源DNA分子导入细胞中的目的。
(操作步骤)1、受体细胞或组织的预处理。
通过渗透剂(甘露醇、山梨醇等)处理来调节受体细胞或组织的渗透压,维持细胞的高渗状态,使其在轰击受伤后细胞质的外渗减少,从而有利于细胞的成活。
2、DNA微弹的制备。
这一过程是将外源基因DNA分子以一定比例附着在金属微粒子(金粉或钨粉)载体上。
3、受体材料的轰击。
4、过渡培养与筛选培养。
轰击后的材料先在不含选择压力的培养基中过渡培养一段时间(一般1~2周),以利于受轰击材料的恢复并充分表达外源基因(包括选择压力抗性基因),再转入有选择压力的培养基中进行培养,以抑制非转化细胞的生长,而转化细胞则能继续生长分化,从而被筛选出来。
三、聚乙二醇法(原理)聚乙二醇(PEG)是一种选择性化学渗透剂,它可以使细胞膜之间或使DNA与细胞膜之间形成分子桥,促使相互间的接触和粘连,并通过改变细胞膜表面的电荷,引起细胞膜透性变化,从而促进外源大分子进入原生质体,因此称之为PEG诱导法。
(操作程序)1、分离原生质体;2、提取带有目的基因的质粒或其它外源DNA;3、取0.5ml新制备的原生质体悬浮液(原生质体密度为2X106/ml),加入50μl小牛胸腺DNA,混匀后静置10分钟,然后再加入10ml外源DNA,轻轻混匀后静置10分钟;4、加入等体积40%的PEG溶液,立即混匀,室温下置30分钟;5、每隔5分钟加1~2ml 0.2mlCaCl2溶液,逐步稀释到10ml;6、离心收集原生质体,并重新悬浮培养到10ml培养基中培养1周;7、将原生质体转移到选择培养基中进行筛选培养。
(基本特点)PEG法的优点如下:1.实验成本低,不需要特殊的仪器设备;2.受体植物材料不受种类的限制,只要能建立原生质体再生体系的植物都可以采用此法;3.得到的转化体中嵌合体很少;4.结果稳定,重复性好;5.有实验证明,此法可使两个非连锁基因的共转化率达50%左右;6.有研究表明,用植物总DNA进行转化,其转化频率与用质粒DNA接近;7.此法可与电击法、脂质体法、基因枪法、激光微束穿刺法等技术结合使用,可大大提高转化率。
PEG法也有较大的局限性:1.必须以原生质体为受体,而建立原生质体再生体系往往十分困难;2.转化率仍然偏低。
四、浸渍法(基本原理)浸渍法是将植物的种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗、悬浮细胞甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中,利用植物细胞自身的物质运输系统将外源DNA分子直接导入受体细胞。
现在已经证明植物细胞至少通过以下几种途径将外源DNA吸入细胞内:1、外源DNA可以通过细胞间隙与胞间连丝组成的网络化的运输系统而被运输到每一个细胞内;2、植物细胞通过类似于动物细胞的内吞作用将外源DNA摄入细胞内;3、植物组织中的传递细胞的膜透性改变可以为大分子物质透过细胞膜提供机会,尤其是生殖细胞以及分生细胞中,外源DNA进入细胞中的机会更大。
(基本方法)以种子为受体介绍其基本操作方法:1、将种子用0.1%的升汞或20%~30%次氯酸钠消毒,无菌剥去种皮(也可剥去幼胚);2、将剥出的种子浸于无菌的0.1 XSSC缓冲液中,加入20%的二甲基亚砜(DMSO);3、加入供体DNA溶液(100~200μg/ml),浸泡30min至数小时;4、用无菌0.1 XSSC缓冲液冲洗干净;5、将种子放在无菌滤纸上吸干水份后,转入无激素的固体培养基上培养;6、将生长发育正常的胚转入筛选培养基上进行筛选(用质粒DNA浸泡的种子),或成苗后转栽到土壤中进行变异性状分析(用总DNA浸泡的种子)。
(基本特点)浸渍法具有如下优点:浸渍法是高等植物转化技术中最简单、快速、便宜的一种转化方法,它无需昂贵的仪器设备和复杂的组织培养技术,可以进行大批量的受体转化工作,容易推广。
局限性如下:转化频率较低,重复性较差,筛选和检测也困难,往往很难得到分子生物学证据。
五、花粉管通道法(原理)在受精及胚胎发育的初期是植物接受远缘遗传物质的敏感时期,就生殖细胞的结构而言,在胚囊中的精、卵细胞类似天然的原生质体;而且在精子入卵时,卵膜有一个开闭的过程;即使到了合子期,胞壁的形成也尚未完备,胞壁的屏障作用还很小,因此外源基因进入受体卵细胞及合子的阻力较小。
在花粉管伸入胚珠的过程中可形成花粉管通道,这为外源DNA分子进入胚囊提供了天然的途径。
植物授粉后外源DNA能沿着花粉管渗入,经过珠心通道进入胚囊,转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎。
就整体分子而言,亲缘关系愈远的生物间的染色体基因DNA的结构愈不易亲和,而容易相互排斥,但从局部的DNA片段来看,两种来源的DNA在部分区段上可能保持一定的亲和性,因而远缘DNA片段在受体细胞DNA复制过程中有可能被重组进去,这便是染色体水平以下的分子杂交。
(操作方法)1.柱头切除法:当受体植物自花授粉一定时间后(一般2~3小时),切去花柱,然后马上在切口上滴入供体DNA溶液(浓度为50~100μg/ml,溶于1XSSC),最后套袋隔离至种子成熟。
2.花粉粒吸入法:收集新鲜花粉加入到供体DNA溶液中混匀,使外源DNA吸入花粉粒,然后取混合液滴于预先去雄套袋隔离的雌花上进行人工授粉,再继续套袋至种子成熟。