番茄花粉管通道遗传转化方法

农杆菌转化法和花粉管通道法在植物科学的世界里，有两种方法特别受欢迎，那就是农杆菌转化法和花粉管通道法。

咱们今天就来聊聊这俩，轻松又幽默，大家随便听听哦。

农杆菌转化法，这可不是普通的“农民”跟“细菌”之间的故事，而是个大牌角色哦！农杆菌，听名字就有点牛气，实际上它是一种细菌，特别喜欢植物，尤其是那些勇敢的植物细胞。

想象一下，一个可爱的细菌潜入植物细胞，给它带来新衣服，新功能。

这就像在夏天给自己买了条新裙子，心情立马好起来。

科学家们就是这么巧妙，把一些外来基因放进农杆菌里，然后让它去“感染”植物细胞。

这样一来，植物就能获取新的性状，简直就是“改头换面”的一场大变身。

哎，这样一想，农杆菌还真是个调皮捣蛋鬼。

它就像那个总爱给你惊喜的朋友，突然带来一堆新玩意儿。

不过呢，运用这种方法的时候，科学家得特别小心，万一农杆菌跑去搞破坏，那可就糟糕了，植物反而受了伤。

这就好比是一个好心人，结果反而把你家的花瓶撞碎了，真是让人哭笑不得。

虽然有点风险，但只要掌握得当，嘿，收获的果实可真甜美。

然后，我们再说说花粉管通道法。

听起来是不是有点高大上？其实这也是个很有趣的事儿。

想象一下，一个小小的花粉粒，像个快递小哥，背着一堆重要包裹，准备送到植物的子房。

花粉管就像是它的专属通道，里边的旅程可是相当艰辛哦！这小家伙得通过很多障碍，才能顺利到达目的地。

就好比你在街上买外卖，拼命想找到那条巷子。

要是能顺利抵达，花粉就能完成授粉，植物就能繁衍后代，简直是“大功告成”。

不过呀，花粉管通道法也有它的小麻烦。

有时候花粉粒可不一定那么听话，可能偏离方向，绕来绕去。

这就像你早上出门忘记带钥匙，结果在门口徘徊，没法进家。

这种方法虽然巧妙，却也需要一些耐心和细心。

每一步都得小心翼翼，才能确保花粉顺利完成使命。

这两种方法各有千秋。

农杆菌转化法就像是一场精彩的舞台剧，有激烈的剧情变化；而花粉管通道法则像是一部温暖的旅行故事，满是细腻的情感和坚持的力量。

花粉管通道转化技术及其分子验证花粉管通道法，亦称授粉后外源基因导入植物遗传转化技术，是利用植物授粉后所形成的天然花粉管通道（花粉引导组织），经珠心通道将外源DNA 携带进入胚囊，转化受精卵或其前后的生殖细胞（精子、卵子），由于它们仍处于未形成细胞壁的类似“原生质体”状态，并且正在进行活跃的DNA 复制、分离和重组，所以很容易将外源DNA 片段整合进受体基因组中，以达到遗传转化的目的。

该法的提出是基于Hess（1980）的试验，他报道了花粉粒可以吸收外源DNA的结果（李长缨等，2000）。

我国学者在远缘杂交的基础上，通过授粉时混入异源花粉匀浆的方法，在后代中发现了对应性状的变异，从而推测可能有异源DNA 参与了受精过程。

Zhou 等（1983）成功地将外源海岛棉DNA 导入陆地棉，培育出抗枯萎病的栽培品种，创立了花粉管通道法转化技术。

目前，已有的研究结果表明，花粉管通道法介导的遗传转化及其后代能产生变异，已相继在40 多种作物上取得了显著成效（孔青等，2005；Song et al，2007）；在国外SCI/EI 期刊也相继出现报道（Luo et al，1989；Li et al，2002；Shou et al，2002 ；Chen et al，2008），并已获得大量优良小麦等作物新品种（周春江等，2007；王永芳等，2009），为拓宽作物抗性基因资源和品质改良提供了新的途径。

一、花粉管通道法的产生及分类花粉管通道法最早要追溯到Pandey（1975）以烟草为材料，将供体品种的花粉经射线杀死后与受体品种的新鲜花粉混合授粉，结果获得了供体花色性状的变异。

我国科学家周光宇在1983年首次在“Methods in Enzymology”报道了将外源海岛棉DNA 导入陆地棉，培育出抗枯萎病的栽培品种，创立了花粉管通道法。

此后人们对花粉管通道法进行了大量的研究，研究内容包括外源DNA 的转化机理、转化技术、转化后代的性状鉴定等方面，并把此项技术成功地运用到育种实践中来。

番茄的遗传转化班级姓名学号摘要：本研究以小型番茄为试材,建立其以子叶、下胚轴为外植体的高效、稳定再生体系及遗传转化体系。

子叶外植体与农杆菌共培养后,经过诱导,根的再生，初步建立了农杆菌介导的遗传转化体系。

是目前最有效的途径之一。

农杆菌对植物释放的化学物产生趋化反应，向植物受伤组织集中。

经共培养后，受伤部位的化学诱导物透过农杆菌的细胞膜使Ti质粒上的Vir基因活化。

Vir基因产物使Ti 质粒上的T—DNA进入植物细胞，并整合到植物核基因组中。

插入在T—DNA 左右边界区内的目的基因也随之整合到植物染色体上，从而使目的基因在植物细胞中得到表达。

近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物中也得到了广泛应用。

关键字：番茄下胚轴子叶转化一、实验材料、试剂和仪器设备1.实验材料：番茄种子2.试剂：大量元素、氯化钙、微量元素、铁盐、有机成分、琼脂、蔗糖、蒸馏水、1mol∕LNaOH、6BA、NAA、升汞、蛋白胨、酵母粉、卡那霉素、75％乙醇3.仪器设备：天平、烧杯、量筒、移液管、药勺、称量纸、玻璃棒、吸耳球、PH 试纸、培养瓶、封口膜、橡皮筋、高压灭菌锅、电炉、标签纸、记号笔、滤纸、镊子、剪子、移液枪、枪头、酒精灯、培养皿二、实验步骤1.外植体的制备(1) MS培养基母液的配制按以下的成分与浓缩比例配制母液大量元素50mg∕L氯化钙50mg∕L微量元素1 mg∕L有机成分1 mg∕L蔗糖30 g∕L琼脂 6 g∕L(2)MS培养基的配置配制200ml的MS培养基，将所需要的试剂混合后加热溶解，用1mol∕LNaOH 调节PH至5.8，宁大勿小偏酸不凝固，然后分装到灭好菌的培养瓶中。

(3)高压灭菌将配制好的培养基、培养瓶、无菌水、有滤纸的培养皿灭菌(4)铺种子打开超净工作台紫外灯照射约30min，然后关闭紫外灯，打开超净工作台的风机。

先数好所需要的种子，放在一个小烧杯中，到入升汞，没过种子，五到六分钟。

然后回收升汞，把无菌水倒入摇晃，用灭菌好的无菌水洗3—4次，拿镊子灭菌，要灭透。

花粉管转化法花粉管转化法是一种常用的转化方法，它是通过将外来基因表达体系导入父本花粉成熟阶段的花粉管中，实现外源DNA转化的方法。

该方法主要用于杂交种的遗传改良和分子生物学研究。

1.杂交种改良：由于杂交种表现出了许多优异的特性，因此在农业生产中得到了广泛的应用。

然而，由于杂交种的特异性，对外来基因的吸收能力较弱，因此如何有效地实现转化一直是一个难题。

花粉管转化法则在这一问题上提供了一个可行的方法。

该方法首先选出基因型良好的亲本进行花粉收集。

将外源基因表达体系通过基因枪法或者病毒转化技术导入父本花粉，再将花粉准确地放入母本花柱，待花粉萌发成花粉管、进入胚囊请应时，外源基因即可被稳定地遗传到子代个体中。

2.分子生物学研究：花粉管转化法也被广泛应用于植物分子生物学研究。

它可以通过将外源基因引入花粉管，实现一系列基因功能研究，如基因表达、序列功能分析等。

通过花粉管转化法，科研人员可以将克隆的DNA序列注入花粉，而不用使用反义寡核苷酸等传统方法。

同时，方法具有速度快、转化效率高、基因表达稳定等优点，适合在大规模实验中使用。

3.花粉管转化操作步骤：（1）领取花药：选取健康的花药，用镊子轻轻地拔出完整的花药。

（2）收集花粉：用镊子轻轻的夹住花药，轻轻均匀地按压花药上的花药袋，将顶端收到足够的花粉。

（3）准备转化溶液：用质控水或10%蔗糖溶液，配制成0.1%AB23001或0.1%亚胺基吡啶SPM转化溶液，并加入外源基因表达体系。

（4）转化花粉：在注射枪的前端涂上转化溶液，将花粉逐一注射入花粉管中。

（5）花粉处理：将含有转化花粉的瓶子放置在适当的温度下，培养相应时间，直至花粉长出花粉管。

（6）取胚囊：将转化的花粉管取出并分离胚囊，进行后续处理。

花粉管转化法是一种快速、高效的DNA转化方法，对植物杂交品种的良种选育及植物分子生物学研究有着广泛应用。

但是，在实际操作过程中仍需考虑到花粉数量、溶液配制、注射压力等多种因素，以提高转化效率和避免花粉的受损。

花粉管通道法转基因技术在果树上的研究进展果树的基因转化研究早在1988年，首先在核桃上取得突破，McGranahan等获得了转gus基因核桃再生植株。

此后，果树转基因工程研究日益发展，许多果树获得了转基因植株，但是与农作物的转基因工程研究相比，果树转基因工程还是远远处于落后状态。

最难转化的禾谷类，现在也已经有多种作物进入转基因的商业化生产阶段，而果树仅有一例转基因植物进入田间试验（方宏筠等，1999）。

我国在樱桃、草莓、苹果等果树转基因方面做了许多研究工作，并都获得了转化目的基因的转基因植株，特别是樱桃的转抗菌肽基因已由农业部批准进入田间实验，该项研究处于国际领先水平。

1988年第一株转基因核桃(Juglans regia L.)在美国诞生为利用基因工程改变果树特定性状、培育果树新品种奠定了实践基础。

相对于农作物而言，果树转基因技术及研发相对滞后转化体系仍有待进一步完善，但果树基因工程也有其突出的优势。

目前，我国已在荔枝、番木瓜、苹果、柑橘、梨、桃、香蕉、猕猴桃、葡萄、樱桃、草莓的果树上展开了遗传转化技术的研究，转化方法主要包括农杆菌介导法和基因枪轰击的方式，获得了部分转基因植株。

在果树等林木育种中，花粉管通道法的相关研究少有报道，仅见钟启宏等采用花粉管通道导入方法，将欧洲黑杨的一个克隆片段导入泡桐，最终获得了3株可含50μg/mL的Kan培养基上生长的幼苗。

侯立群（2000）等利用花粉管通道发进行核桃转基因研究，只是获得了畸形果植株，但尚未完成分子鉴定等。

山东农业大学张玲（2004）利用花粉管通道法对杏转化抗寒基因相关研究。

由于果树，栽培环境复杂、生产周期长，且主要为风媒传粉植物，与作物相比，在影响树种自身遗传多样性等方面，其潜在的生态风险性可能更大。

随着果树转基因成功事例逐年增加，转基因果树的生态安全性问题也越发受到重视。

由于花粉管通道法进行转化的供体可以是植物总DNA，即利用自然界现有的具目的性状的外源DNA或基因进行遗传转化，其实质相当于远缘杂交。

花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。

该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。

该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。

1 花粉管通道法的生理学基础花粉管通道法的主要原理是授粉后使外源DNA 能沿着花粉管通道形成的途径渗透，经过珠心进入胚囊，最终转化尚不具备正常细胞壁的合子或早期胚胎细胞。

这一技术原理可以应用于任何开花植物。

水稻是自花授粉作物，因此这种方法同样适用于水稻。

围绕着花粉管通道的形成是一个发生在植物花器结构中的传粉授精的过程。

从狭义上理解就象字面表明的那样，授粉是指从花粉被送到柱头上到在柱头上萌发的过程，实际上应该是一个以狭义授粉为中心的包括这一过程的非常复杂的生理现象，即包括花粉形成、传粉、花粉萌发、花粉管伸长以及继花粉管伸长之后的受精问题，甚至还包括拒绝受精现象。

被子植物的花器结构已研究得比较清楚，最外面的是子房，子房中有胚珠，它由外胚珠、内胚珠及珠心、珠孔、珠柄组成。

珠心内有8 核，近珠孔端有 3 个核，一个分化为卵细胞， 2 个分化为助细胞。

助细胞和卵细胞组合成卵器。

这三个细胞排列成三角形，各细胞都呈梨形，尖部朝着珠孔端。

近合点端的 3 个核分化为反足细胞。

胚囊的中央有两个极核，并和周围细胞质组成一个中央细胞。

因此典型的被子植物胚囊为8 核7 细胞胚囊，亦称为雌配子体，卵细胞称为雌配子。

雄配子体由含有大量淀粉的营养核和具有微管的两个精细胞、此外还有多糖类、线粒体组成。

植物开花以后，落在柱头上的花粉粒，被柱头分泌的粘液所粘住，以后花粉的内壁在萌发孔处向外突出并继续伸长，形成花粉管，这一过程，称作花粉粒的萌发。

番茄组织培养及其农杆菌介导类胡萝卜素合成酶基因LvcB的遗传转化任永霞1,2,王　罡1,郭郁频2,王　萍3,季　静1(1.天津大学农业与生物工程学院,300072;2.河北北方学院,张家口075131;3.淮海工学院海洋学院,连云港222005) 摘　要:LycB(番茄红素β-环化酶)基因是类胡萝卜素生物合成过程中关键酶之一,位于合成代谢的重要分枝点上,直接影响β胡萝卜素的合成。

通过农杆菌介导法,利用LycB基因转化重要果菜两用作物———番茄。

经PCR及PCR-S outhem分子检测证明,目的基因LycB已整合进番茄基因组中。

关键词:LycB基因;番茄;根癌农杆菌;类胡萝卜素;组织培养中图分类号:S641.203.6　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2006)01-0098-03 类胡萝卜素是广泛存在于自然界的一类色素,通常是指胡萝卜素和叶黄素两大类色素的总称。

绝大多数类胡萝卜素呈现绚丽的红、橙或黄色,至今已发现600多种天然的类胡萝卜素。

类胡萝卜素,尤其是β-胡萝卜素不仅是维生素A的前体,且还具有延缓衰老、增强人体免疫力、预防心血管疾病和防癌抗癌等作用。

类胡萝卜素与人类的健康密切相关,随着人们对其认识的加深,人类对其需求也越来越大。

但人体自身不能合成类胡萝卜素,果蔬是其重要来源。

番茄是人们喜食的果菜两用作物,类胡萝卜素的含量是番茄品质和营养价值高低的主要标志。

本实验采用根癌农杆菌介导技术,将LycB基因导入番茄,通过基因工程手段调控其类胡萝卜素的合成,提高番茄β-胡萝卜素的含量,满足人类对健康的需求,以期为番茄品质基因工程育种奠定基础。

1　材料与方法1.1　材料植物材料为东农704、东农708、东农709三个品种,种子由东北农业大学李景富教授惠赠。

1.2　菌株和质粒根癌农杆菌菌株为EH A101,所含质粒上构建有目的基因LycB和植物抗性筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因Hyg。

均由季静教授提供。